枸杞多糖联合奥沙利铂可逆转结肠癌干细胞的耐药

doi:10.12307/2024.106

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (1): 74-79.doi: 10.12307/2024.106

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枸杞多糖联合奥沙利铂可逆转结肠癌干细胞的耐药

艾芳芳1，2，肖红燕3，汪芳3，朱永朝4，马丽君5

宁夏医科大学，1临床医学院，2宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室，5基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，宁夏回族自治区银川市 750004；3宁夏回族自治区人民医院，宁夏回族自治区银川市 750004；4宁夏医科大学总医院外科学研究室，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2023-02-02 接受日期:2023-02-24 出版日期:2024-01-08 发布日期:2023-06-28
通讯作者: 朱永朝，博士，副研究员，宁夏医科大学总医院外科学研究室，宁夏回族自治区银川市 750004 马丽君，博士，副教授，宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:艾芳芳，女，1997年生，河南省禹州市人，回族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事肿瘤干细胞研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82060634)，项目负责人：马丽君；宁夏重点研发计划一般项目(2018BEG03018)，项目负责人：马丽君

Reversal effect of Lycium barbarum polysaccharide in combination with oxaliplatin on drug resistance of colon cancer stem cells

Ai Fangfang1, 2, Xiao Hongyan3, Wang Fang3, Zhu Yongzhao4, Ma Lijun5

1School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Key Laboratory of Ningxia Ethnomedicine Modernization of Ministry of Education, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 3People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 4Department of Surgery, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 5Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2023-02-02 Accepted:2023-02-24 Online:2024-01-08 Published:2023-06-28
Contact: Zhu Yongzhao, PhD, Associate researcher, Department of Surgery, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China Ma Lijun, PhD, Associate professor, Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Ai Fangfang, Master candidate, School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Key Laboratory of Ningxia Ethnomedicine Modernization of Ministry of Education, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82060634 (to MLJ); General Project of Ningxia Key Research and Development Plan, No. 2018BEG03018 (to MLJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

枸杞多糖：宁夏枸杞是中国药典收载的唯一正品，枸杞具有调节免疫、抗炎、保护细胞、血管、神经以及抗衰老和抗肿瘤等多种药理作用。枸杞多糖是其主要生物活性成分，主要由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、半乳糖醛酸与多种氨基酸或脂质构成的水溶性复合多糖。

结肠癌干细胞：结肠癌组织中表达干细胞标记物的细胞，具有更强的迁移和分化能力，因此在肿瘤的转移和复发过程中起到关键性作用。

背景：结肠癌临床主要采用以氟尿嘧啶、伊立替康及奥沙利铂为基础的治疗方法，研究发现这些药物的转运与ABC转运蛋白G家族成员2(ATP-binding cassette transport protein of G2，ABCG2)等膜转运蛋白相关，然而当患者对这些化疗药物产生耐药后，ABCG2的高表达致使治疗效果明显下降，引起了结肠癌的耐药问题。临床急切需要新的药物及治疗方法来提高疗效，枸杞多糖具有广泛的生物学活性，将多糖作为抗肿瘤药物，可以克服化疗和放疗过程中杀死肿瘤细胞的同时对机体正常细胞的损伤。
目的：通过体外实验探索枸杞多糖联合奥沙利铂对结肠癌干细胞耐药的逆转作用，进而探讨枸杞多糖逆转结肠癌耐药的可能分子机制。
方法：选用结肠癌细胞株HCT116以及奥沙利铂耐药细胞株HCT116-OXR进行体外实验，采用CCK8检测细胞增殖情况确定枸杞多糖和奥沙利铂的最适干预浓度和干预时间，进一步分为HCT116对照组，HCT116-OXR空白处理组，枸杞多糖组(2.5 mg/mL枸杞多糖)，奥沙利铂组
(10 μmol/L奥沙利铂)，枸杞多糖+奥沙利铂组(2.5 mg/mL枸杞多糖+10 μmol/L奥沙利铂)，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，免疫荧光和Western blot检测磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase，PMI)和ABCG2的表达，Western blot检测PI3K，AKT，Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。

结果与结论：①HCT116-OXR相较HCT116对枸杞多糖更敏感(P < 0.05)；②与HCT116-OXR空白处理组比较，奥沙利铂联合枸杞多糖促进了HCT116-OXR细胞凋亡(P < 0.05)，Bcl-2蛋白表达明显下调(P < 0.05)，Bax蛋白表达明显上调(P < 0.05)，ABCG2、PMI、PI3K、AKT的蛋白表达明显下调(P < 0.05)；③结果表明枸杞多糖通过抑制PMI/PI3K/AKT通路逆转结肠癌耐药，为研究枸杞多糖增敏化疗作用的分子机制奠定了基础。

https://orcid.org/0000-0001-8716-5251(艾芳芳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: PMI, ABCG2, PI3K, AKT, 枸杞多糖, 结肠癌干细胞, 耐药, 凋亡

Abstract: BACKGROUND: Clinical treatment for colon cancer mainly includes fluorouracil, irinotecan and oxaliplatin-based therapy. Studies have shown that membrane transport proteins such as ATP-binding cassette transport protein of G2 (ABCG2) mediate the transport of these drugs. However, when patients develop resistance to these chemotherapeutic drugs, the high expression of ABCG2 leads to a significant decrease in the therapeutic effect and raises the problem of drug resistance in colon cancer. New drugs and treatments are urgently needed to improve the efficacy. Lycium barbarum polysaccharide has a wide range of biological activities. It can be used as anti-tumor drug to overcome the damage to normal cells in the process of chemotherapy and radiotherapy in tumor patients.
OBJECTIVE: To explore the reversal effect of Lycium barbarum polysaccharide in combination with oxaliplatin on colon cancer drug-resistant cells through in vitro experiments to investigate the possible molecular mechanism of Lycium barbarum polysaccharide reversal on colon cancer drug-resistant cells.
METHODS: Colon cancer cell line HCT116 and oxaliplatin-resistant cell line HCT116-OXR were selected for in vitro experiments. The optimal intervention concentration and intervention time of Lycium barbarum polysaccharide and oxaliplatin were determined by CCK8 assay of cell proliferation. Samples were further divided into the HCT116 control group, HCT116-OXR blank treatment group, Lycium barbarum polysaccharide group (2.5 mg/mL Lycium barbarum polysaccharide), and oxaliplatin group (10 μmol/L oxaliplatin), and Lycium barbarum polysaccharide + oxaliplatin group (2.5 mg/mL Lycium barbarum polysaccharide +10 μmol/L oxaliplatin). Cell apoptosis was detected by flow cytometry. The protein expression levels of phosphomannose isomerase (PMI) and ABCG2 were detected by immunofluorescence and western blot assay. Phosphatidylinositol3-kinase (PI3K), protein kinase B (AKT), B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) and BCL2-Associated X (Bax) were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) HCT116-OXR was more sensitive to Lycium barbarum polysaccharide compared to HCT116 (P < 0.05). (2) Compared with the HCT116-OXR blank group, Lycium barbarum polysaccharide + oxaliplatin could promote apoptosis of HCT116-OXR cells (P < 0.05). The protein expression of Bcl-2 was significantly down-regulated (P < 0.05); the protein expression of Bax was significantly up-regulated (P < 0.05); the protein expression of ABCG2, PMI, PI3K and AKT was significantly down-regulated (P < 0.05). (3) These results indicate that Lycium barbarum polysaccharide reverses drug resistance in colon cancer by inhibiting PMI/PI3K/AKT signaling pathway, which lays the foundation for studying the molecular mechanism of Lycium barbarum polysaccharide’s sensitizing chemotherapeutic effects.

Key words: PMI, ABCG2, PI3K, AKT, Lycium barbarum polysaccharide, colon cancer stem cell, drug resistance, apoptosis

中图分类号:

艾芳芳, 肖红燕, 汪芳, 朱永朝, 马丽君. 枸杞多糖联合奥沙利铂可逆转结肠癌干细胞的耐药[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 74-79.

Ai Fangfang, Xiao Hongyan, Wang Fang, Zhu Yongzhao, Ma Lijun. Reversal effect of Lycium barbarum polysaccharide in combination with oxaliplatin on drug resistance of colon cancer stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(1): 74-79.

图/表（结果） 4

2.1 枸杞多糖对结肠癌细胞的抑制作用以及联合奥沙利铂的逆转效果对于HCT116和HCT116-OXR，与0 mg/mL枸杞多糖比较，0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，5 mg/mL枸杞多糖处理48 h细胞存活率明显降低；枸杞多糖处理48 h，HCT116，HCT116-OXR的IC50分别为3.332，2.914 mg/mL，枸杞多糖可抑制HCT116和HCT116-OXR的细胞增殖，并且HCT116-OXR相较HCT116对枸杞多糖更敏感(P < 0.05)，因此选取2.5 mg/mL枸杞多糖进行后续实验。 24 h细胞活力增强考虑为部分细胞株在营养成分的供养下暂时增殖，但48 h以后，枸杞多糖对肿瘤细胞普遍抑制，因此抑制肿瘤生长。奥沙利铂处理24 h后，HCT116，HCT116-OXR的IC50分别为5.703，13.090 μmol/L，耐药指数为2.295，差异有显著性意义(P < 0.05)。奥沙利铂联合2.5 mg/mL枸杞多糖处理HCT116-OXR的IC50为4.650 μmol/L，其逆转倍数为2.815。根据CCK8实验结果，10 μmol/L的奥沙利铂与2.5 mg/mL的枸杞多糖联合处理HCT116-OXR细胞24 h时，细胞毒性小于50%，此浓度用于后续实验，见图1。

2.2 枸杞多糖联合奥沙利铂对HCT116-OXR凋亡的影响枸杞多糖组(2.5 mg/mL枸杞多糖)、奥沙利铂组(10 μmol/L奥沙利铂)和枸杞多糖+奥沙利铂组(2.5 mg/mL枸杞多糖+10 μmol/L奥沙利铂)的细胞凋亡率分别为11.54%，7.33%，20.40%。与空白处理组相比，枸杞多糖+奥沙利铂组(2.5 mg/mL枸杞多糖+10 μmol/L奥沙利铂)处理后HCT116-OXR的细胞凋亡率由7.58%增长至20.4%，见图2。

2.3 枸杞多糖联合奥沙利铂处理后对PMI，ABCG2，Bax和Bcl-2表达的影响应用免疫荧光以及Western blot测定PMI，ABCG2的表达，枸杞多糖+奥沙利铂组(2.5 mg/mL枸杞多糖+10 μmol/L奥沙利铂)处理后PMI，ABCG2的表达下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，由此可见，枸杞多糖联合奥沙利铂处理后可降低PMI，ABCG2的表达。同时Western blot检测枸杞多糖+奥沙利铂组Bax表达上调，Bcl-2表达下调，见图3。

2.4 枸杞多糖联合奥沙利铂处理后对PI3K，AKT表达的影响应用Western blot检测PI3K，AKT的表达，枸杞多糖+奥沙利铂组(2.5 mg/mL枸杞多糖+10 μmol/L奥沙利铂)处理后，PI3K和AKT的表达下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4，由此可见，枸杞多糖联合奥沙利铂处理后可抑制PI3K/AKT通路。

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引言

根据GLOBOCAN 2022的调查结果，癌症成为全球第二大死亡原因，排名仅次于心脏病，结直肠癌在男性和女性中发病率以及死亡率均排名第三，位居前列[1]。中国4种消化道肿瘤新发病例数和死亡病例数均位列第一，中国消化道肿瘤的负担高于世界平均水平，主要是由于中国食管癌、胃癌、结直肠癌和肝癌在肿瘤中的比例明显高于世界[2]。80%的结肠癌患者确诊时年龄为60岁，林奇综合征为罹患结直肠癌的第一大原因，家族性腺瘤性息肉病为第二常见原因，炎症性肠病引起的慢性结肠炎也与结直肠癌风险增加有关[3]。结肠癌临床主要采用以氟尿嘧啶、伊立替康及奥沙利铂为基础的一线治疗方法。一线化疗开始后，80%患者有1年生存率，40%有3年生存率，20%有5年生存率[4]。尽管如此，在临床众多化疗方案中最突出的问题是肿瘤的耐药和复发，这严重影响了药物的疗效。因此克服这一难题，需要发现更多新药，前人研究发现多糖类中药有抗癌效果[4-5]，且其协同化疗药物增敏效果显著。
枸杞多糖是枸杞红色果实中的重要功能成分，具有多种益处，可降低血糖和血脂、免疫调节、抗癌、抗衰老、抗疲劳、抗青光眼等作用[4]。早期的中国医学专著在大约2 300年前记录了枸杞的药用价值。茄科枸杞属植物的果实，在传统中草药中很有名，现在它被广泛用作一种流行的功能性食品。枸杞多糖富含大量生物活性成分，包括类胡萝卜素、苯丙素、类黄酮、其他多酚和多糖，其中多糖成分高达51%[5]。大量研究也证实了枸杞多糖具有抗肿瘤活性[4-10]。但其逆转结肠癌耐药的作用未见相关报道，因此该研究通过体外实验探究枸杞多糖联合奥沙利铂对结肠癌耐药细胞的影响。
磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase，PMI)是一种锌指依赖酶，可催化6-磷酸甘露糖(mannose 6-phosphate，M6P)和6-磷酸果糖(fructose 6-phosphate，F6P)的可逆性异构化。M6P是各种微生物细胞壁蛋白甘露糖糖基化所必须的，因此可作为抗菌药物靶点。PMI也参与能量代谢，因其产物F6P可通过糖酵解进一步被氧化。在真核生物中，PMI的缺失导致F6P或M6P的积累、糖基化的缺陷以及P53的诱导[11]。PMI在癌症的代谢过程中发挥重要作用，白血病高表达PMI，抑制PMI可以有效抑制肿瘤细胞生长[12]。此外，PMI还参与成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)家族的调节，对膜受体的影响可能是其发挥作用的关键点，从而增敏胶质瘤的放疗[13]。枸杞多糖能否抑制PMI的表达从而增敏化疗是该研究的重点之一。
ABC转运蛋白G家族成员2(ATP-binding cassette transport protein of G2，ABCG2)是一个72 kD的半转运体，是ABC(ATP转运盒)转运体G家族的第二个成员 [14]。ABCG2的外排转运蛋白功能，有助于奥沙利铂排出结直肠癌细胞，从而使该细胞从奥沙利铂内解毒[15-17]，ABCG2同时在干细胞领域发挥着重要作用[18]。肿瘤干细胞通过高表达ABC转运体以及抗凋亡分子从而获得耐药性，分别代表了基于转运和非转运的结肠癌细胞耐药机制[19]。ABCG2作为结肠癌干细胞重要标记，在耐药细胞中高表达[20]。课题组的前期结果显示：结肠癌患者肿瘤组织中高表达ABCG2与CD133+细胞群，CD133+细胞群克隆形成率明显高于CD133-细胞，从而提供了CD133+结肠肿瘤干细胞与肿瘤抗药性关系的基础。利用siRNA干扰技术降低ABCG2的表达后，肿瘤干细胞克隆形成率降低，CD133+细胞数量减少，并且体外及体内药敏实验证实增强了化疗药物5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的抗肿瘤生长作用[21]。越来越多的研究证实多糖能够作为增敏剂，从而提高化疗或放疗效果，进而逆转耐药[22-23]。
该研究主要通过体外实验探讨枸杞多糖联合奥沙利铂对结肠癌奥沙利铂耐药细胞株(HCT116-OXR)的逆转作用及可能机制，以期为临床耐药结直肠癌的治疗提供一种新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2021年10月至2022年4月在宁夏医科大学科学与技术研究中心完成，2022年5月至2023年12月在宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室完成。
1.3 材料人结肠癌细胞株HCT116及奥沙利铂耐药细胞株HCT116-OXR由浙江美森生物科技公司提供，货号分别为CTCC-001，CTCC-0313；McCoy’s 5A培养基(普诺赛生物科技公司，PM150710)；DMEM培养基(Gibco，c11995500BT)；胎牛血清(GIBCO，10099141C)；奥沙利铂(MCE，HY-17371)；枸杞多糖(宁夏天仁枸杞生物科技股份有限公司，20170501)；CCK8(大连美仑生物技术有限公司，MA0218-2)；小鼠单克隆抗体PMI、ABCG2(Santa Cruz Biotechnology，货号分别为sc-393434，sc-377176)；兔单克隆抗体PI3K、AKT(Cell Signaling Technology，货号分别为4249，4691)；兔多克隆抗体Bcl-2、Bax、β-tublin、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠、山羊抗兔IgG抗体(Affinity Biosciences，货号分别为AF6139，AF0120，KF007，s0002-100，s0001-100)；Transwell小室、Matrigel(Corning，货号分别为3422，354248)；0.1%结晶紫、40 g/L多聚甲醛、抗荧光淬灭封片剂含DAPI(索莱宝，货号分别为G1063，P1110，S2110-5)；Rhodamine标记的山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥，ZF-0313)；凋亡试剂盒(BD，556547)；BCA试剂盒、ECL检测试剂盒、全蛋白提取试剂盒(凯基生物，货号分别为KGP902，KGP1121，KGP250)。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养人结肠癌细胞株HCT116及奥沙利铂耐药细胞株HCT116-OXR在37 ℃、体积分数为5% CO2的无菌培养箱中培养，每隔3 d更换1次培养基。HCT116采用含体积分数为10%胎牛血清的McCoy’s 5A培养基培养，HCT116-OXR采用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养。待细胞生长至对数生长期时进行后续实验。
1.4.2 CCK8实验确定枸杞多糖和奥沙利铂的干预浓度和时间将培养的HCT116和HCT116-OXR消化计数后以3 000个/孔密度接种于96孔板中，每孔100 μL细胞悬液。HCT116空白对照组每孔加100 μL McCoy’s 5A完全培养基，HCT116-OXR空白对照组每孔加100 μL DMEM完全培养基，四周边上的孔各加150 μL生理盐水以维持96孔板的湿度。细胞培养24 h贴壁后，更换含0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，5 mg/mL 枸杞多糖和5，10，50，100 μmol/L 奥沙利铂的McCoy’s 5A完全培养基或DMEM完全培养基100 μL，每一药物浓度设3个复孔，且同步设无药对照组，继续培养24，48 h。培养结束后，避光条件下，每孔加入10 μL CCK8溶液，放入培养箱继续培养1-4 h，酶标仪检测波长450 nm处各孔的吸光度值。根据吸光度值判断活细胞数量，吸光度值越高，活细胞数量越多。按照公式计算细胞存活率，细胞存活率=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%；通过Graph pad 计算半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration， IC50)，按照公式计算耐药指数以及逆转倍数，耐药指数(resistance index，RI)=IC50(HCT116-OXR)/IC50(HCT116)；逆转倍数(reversal effect，RE)= IC50(单独奥沙利铂)/ IC50(联合用药)。
1.4.3 实验分组分别为HCT116对照组，HCT116-OXR空白处理组，枸杞多糖组(HCT116-OXR+2.5 mg/mL枸杞多糖)，奥沙利铂组(HCT116-OXR+10 μmol/L奥沙利铂)，枸杞多糖+奥沙利铂组(HCT116-OXR+2.5 mg/mL枸杞多糖+10 μmol/L奥沙利铂)。
1.4.4 细胞免疫荧光检测在无菌24孔板放入相应大小的无菌玻片后每孔接种2×104个HCT116或HCT116-OXR，次日显微镜下观察细胞在玻片上贴壁生长，状态良好，密度适中，分别加入2.5 mg/mL枸杞多糖、10 μmol/L奥沙利铂、2.5 mg/mL枸杞多糖和10 μmol/L奥沙利铂，对照组仅换液处理。处理24 h后，吸弃各孔内培养基，用PBS轻轻冲洗玻片3次，各孔内加入适量的40 g/L多聚甲醛固定细胞20 min，PBS轻轻冲洗玻片3次，加入适量含0.1% Triton X-100及体积分数3%山羊血清的PBS室温下封闭1 h，加入一抗，4 ℃过夜孵育，抗体稀释比例分别为：鼠抗人PMI(1∶100)，鼠抗人ABCG2(1∶100)，PBS轻轻冲洗玻片3次，加入荧光二抗，室温下避光孵育1 h，罗丹明标记的山羊抗鼠二抗稀释比例为1∶200，PBS轻轻冲洗玻片3次，DAPI染核3 min，中性树脂封固，激光共聚焦显微镜观察。
1.4.5 细胞凋亡检测将HCT116和HCT116-OXR以每孔1.5×105的密度接种于6孔板中培养，待细胞贴壁后，更换含2.5 mg/mL枸杞多糖、10 μmol/L奥沙利铂、2.5 mg/mL枸杞多糖和10 μmol/L奥沙利铂的McCoy’s 5A完全培养基或DMEM完全培养基，对照组仅换液处理。处理24 h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，4 ℃，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用预冷的PBS洗涤细胞2次，并用1×PBS重悬，4 ℃，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入100 μL 1×binding buffer，轻轻吹匀，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，轻轻吹匀，避光、室温条件下孵育15 min，上机前加入400 μL 1×binding buffer，轻轻混匀，用AccuriTM C6分析型流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.4.6 Western blot检测将HCT116和HCT116-OXR以每孔1.5×105的密度接种于6孔板中培养，待细胞贴壁后，更换含2.5 mg/mL枸杞多糖、10 μmol/L奥沙利铂、2.5 mg/mL枸杞多糖和10 μmol/L奥沙利铂的McCoy’s 5A完全培养基或DMEM完全培养基继续培养，对照组仅换液处理。处理24 h后提取细胞蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，计算上样量，配置电泳胶，120 V电泳，电泳结束后，300 mA转膜2 h，快速封闭液封闭，4 ℃过夜孵育PMI(1∶500)，ABCG2(1∶500)，Bax(1∶2 000)，Bcl-2(1∶2 000)，PI3K(1∶1 000)，AKT(1∶1 000)，回收一抗，用PBST洗3遍，每次10 min，常温孵育辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或者山羊抗鼠二抗(稀释比例均为1∶5 000)，回收二抗，用PBST洗3遍，每次10 min，ECL试剂盒A，B液1∶1配制，曝光显影，所有结果用Image J分析。
1.5 主要观察指标 ①CCK8检测细胞存活情况，确定枸杞多糖联合奥沙利铂处理的大致浓度，并且计算IC50值；②枸杞多糖联合奥沙利铂处理HCT116-OXR的凋亡率；③免疫荧光以及Western blot检测PMI和ABCG2的蛋白表达；④Western blot检测PI3K，AKT，Bax，Bcl-2的蛋白表达。
1.6 统计学分析各组数据以x±s表示，首先对数据进行方差齐性分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，作图工具采用GraphPad Prism，Adobe Photoshop，
Adobe Illustrator软件。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经由宁夏医科大学统计学专家审核。

讨论

结肠癌一线化疗后最突出的问题是肿瘤的耐药和复发，为克服这一难题，需要发现更多新药。前人研究发现多糖类中药有抗癌效果[24]，且其协同化疗药物增敏效果显著。研究表明岩藻多糖有可能提高药物输送到肿瘤中的效率和实现与其他癌症药物的协同效应[25]。该实验中，枸杞多糖联合奥沙利铂处理后促进HCT116-OXR细胞的凋亡，逆转HCT116-OXR细胞耐药，逆转倍数为2.815。流式细胞检测结果显示枸杞多糖联合奥沙利铂处理后耐药细胞凋亡增加。不论是CCK8结果还是细胞凋亡实验均提示枸杞多糖能够逆转结肠癌奥沙利铂耐药细胞的耐药性。然后检测标志结肠癌干细胞的耐药蛋白ABCG2的表达，结果表明，枸杞多糖联合奥沙利铂有效抑制结肠癌干细胞标志物ABCG2的表达。糖类在癌症多重耐药发展中的作用可以归因于糖酵解及糖酵解相关酶、聚糖结构及聚糖形成过程相关酶和糖蛋白的功能异常[26]，因此检测了PMI的表达，结果显示枸杞多糖联合奥沙利铂明显下调PMI的表达，从而一定程度上证实了上述猜想。考虑到PMI在糖酵解以及糖基化中发挥的重要作用[27]，以及ABCG2在结肠癌恶性转归过程中的重要作用，其更深一层的机制值得探索。
AKT家族在耐药蛋白ABC家族中发挥着重要作用[28-29]，枸杞多糖联合奥沙利铂下调AKT，PI3K的表达，同时该研究检测到枸杞多糖联合奥沙利铂下调Bcl-2的表达，促进Bax的表达，引起耐药细胞凋亡，从而逆转耐药，表明枸杞多糖联合奥沙利铂是通过抑制PI3K/AKT通路的激活从而引起细胞凋亡。此前关于耐药蛋白的研究多考虑其本身的表达高低，未曾考虑其组成性影响，例如其磷酸化或者糖基化对其功能的影响。考虑PMI在糖酵解以及糖基化方面发挥的作用，该研究也探究枸杞多糖联合奥沙利铂对PMI的影响，以期为中药治疗耐药问题提供一种新思路。在前人的研究中，PMI下调后抑制糖酵解、氧化磷酸化，从而抑制肿瘤的生长[12，30]，另一项研究表明，敲低PMI能够调节膜受体FGFR家族信号，并且增加胶质瘤放射敏感性，PMI活性的丧失降低了U-251和SKMG-3恶性胶质瘤细胞系中FGFR家族受体的磷酸化，也导致FRS2、Akt和MAPK信号的显著降低[13]。另有研究报道PMI的缺失激活了P53，揭示了新的调节P53的可能机制[31]。因此，有效抑制PMI的药物有可能在癌症治疗中发挥巨大作用。枸杞多糖能够有效抑制结肠癌耐药细胞中PMI的表达，并抑制PI3K/AKT通路的激活，引起耐药细胞凋亡，为治疗耐药性结肠癌提供一种新思路。
N596位点是ABCG2 蛋白目前唯一能够检测到的N-连接糖基化修饰[32-33]，但是N-连接糖基化并不影响ABCG2的表达以及转运到质膜，因此对整体功能并不重要。但是N-连接糖基化对于ABCG2的稳定是重要的，并且这种N-连接糖基化的破坏导致了蛋白质的不稳定和泛素介导的蛋白酶体降解增强[34-35]，因此也证实了N-连接糖基化在ABCG2分子间二硫键形成中发挥的作用，以及对于正确折叠和增强内质网中人ABCG2蛋白二聚体稳定性的重要性[35]。在该研究中，枸杞多糖联合奥沙利铂抑制ABCG2的表达，也表明了枸杞多糖在结肠癌耐药过程中的重要作用。鉴于ABCG2在结肠癌干细胞始动和耐药方面扮演的重要角色，其更深层面的变化值得进一步研究。
综上所述，该研究证实了枸杞多糖联合奥沙利铂通过抑制ABCG2的表达，从而促进结肠癌耐药细胞凋亡的发生。该研究同时检测到PMI下调，PI3K/AKT通路被抑制，也为进一步更深入的研究奠定了基础，同时也为今后临床治疗结肠癌耐药提供了一定的理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

枸杞多糖联合奥沙利铂可逆转结肠癌干细胞的耐药

Reversal effect of Lycium barbarum polysaccharide in combination with oxaliplatin on drug resistance of colon cancer stem cells

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