在空间探索实验中，与对照组相比，其他组小鼠跨平台次数显著增多(P < 0.05)；联合处理组小鼠跨平台次数多于丰富环境组、褪黑素组(P < 0.05)，见图3。



2.3   各组小鼠脑海马组织形态学观察    
2.3.1   苏木精-伊红染色   光镜下可见，对照组小鼠海马区细胞排列紊乱，大小不均，细胞形态不一；与对照组相比，其他3组小鼠海马区细胞排列整齐紧密，呈圆形或椭圆形，细胞形态较对照组有明显改善，其中联合处理组改善尤为显著，见图4。



2.3.2   NeuN免疫荧光/TUNEL双标染色   对照组小鼠海马CA1区NeuN阳性细胞分布稀疏，其他3组NeuN阳性细胞分布增多；荧光强度定量分析显示，与对照组相比，其他3组NeuN免疫反应性明显增强(P < 0.05)，NeuN/TUNEL双阳性细胞数显著减少(P < 0.05)，尤以联合处理组明显(P < 0.05)，见图5。



2.3.3   尼氏染色   光镜下可见对照组小鼠海马区锥体细胞层的尼氏体染色清晰，细胞呈类圆形、椭圆形或多角形，染色淡，细胞小，组织裂隙多，细胞排列不紧密。与对照组相比，其他3组小鼠海马区锥体细胞层的尼氏体染色深，细胞饱满，组织裂隙少且细胞排列较紧密，细胞层数多，其中联合处理组尤为显著，见图6。

尼氏染色阳性细胞计数结果显示，与对照组相比，其他3组小鼠海马区尼氏染色阳性细胞数量显著增多(P < 0.05)；联合处理组海马区尼氏染色阳性细胞数量多于丰富环境组、褪黑素组(P < 0.05)，见表1。



2.4   各组小鼠海马组织凋亡相关蛋白表达   与对照组相比，其他3组小鼠海马中的Bax、Caspase-3蛋白表达下降(P < 0.05)，Bcl-2蛋白表达升高(P < 0.05)；联合处理组小鼠海马中Bax、Caspase-3蛋白表达低于丰富环境组、褪黑素组(P < 0.05)，Bcl-2蛋白表达高于丰富环境组、褪黑素组(P < 0.05)。与对照组相比，其他3组小鼠海马中的P53蛋白表达下降(P < 0.05)；联合处理组小鼠海马中P53蛋白表达低于丰富环境组、褪黑素组(P < 0.05)，见图7。

脑老化是指随年龄增长神经系统整体功能下降的过程，其特征性表现为细胞、组织、器官的退行性改变[1]。如今世界人口老龄化趋势不可避免，如何延缓人体功能下降和认知障碍的发生，是当今世界面临的全球性重大健康和社会问题，临床治疗干预方法有限，因此探索多方案联合治疗具有重要意义。

褪黑激素是一种由松果体分泌的吲哚类神经内分泌激素，参与各种生理功能，包括昼夜节律、性成熟和生殖、衰老、免疫反应、肿瘤、氧化应激及炎症反应等[2]。既往研究发现，褪黑素产量下降是一个导致与年龄相关神经退行性疾病过程的重要因素，并且已经被认为是脑老化进程中的重要原因之一[3]。丰富环境干预作为一种行为疗法现已被证实能提高包括阿尔茨海默病[4]、帕金森病等多种神经退行性疾病模型动物的神经系统功能和认知表现[5]，与改善脑老化密切相关。但二者对于脑老化的改善作用是否存在协同性目前尚未见报道。

快速老化小鼠是研究脑老化的经典动物模型[6]。此次实验旨在验证丰富环境和褪黑素对SAMP8小鼠老化过程的影响及二者作用有无协同性，进而为临床实际应用以及药物作用靶点的研究奠定理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机分组动物实验，组间两两比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2021年3-12月在华北理工大学实验动物中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   雄性3月龄SAMP8小鼠24只，SPF级，购于北京维通利华实验动物科技有限公司，许可证编号SCXK(京) 2020-0001，体质量20-40 g。饲养于干燥通风的SPF级环境，12 h/12 h明暗交替[7]。实验方案已得到华北理工大学动物实验伦理委员会批准。
1.3.2   实验试剂及仪器   褪黑素(汤臣倍健，批号20190306D)；抗NeuN单克隆抗体(Abcam)；Cy3标记的羊抗兔IgG(Abcam)；Caspase-3、Bax、Bcl-2抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；P53抗体(苏州睿瀛生物技术有限公司)；全自动石蜡包埋机Leica EG1150H型、切片机Leica RM2245型(LEICA公司)；Olympus BX53型光学显微镜(Olympus公司)；凝胶成像分析系统 Universal Hood Ⅲ(BIO-RAD公司)；实时荧光定量PCR仪 AG6325型(Eppendorf公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   实验动物分组及处理   适应性饲养7 d后，将SAMP8小鼠采用随机数字表法分4组：对照组、丰富环境组、褪黑素组、联合处理组，每组6只。对照组、褪黑素组饲养于标准环境，丰富环境组、联合处理组饲养于丰富环境，直至小鼠满4月龄。满4月龄次日，褪黑素组、联合处理组小鼠皮下注射褪黑素8 mg/(kg·d)，临用前用无水乙醇溶解褪黑素再加生理盐水配制，乙醇终体积分数为0.5%，褪黑素质量浓度为1 g/L，每天18：00-20：00注射；对照组、丰富环境组皮下注射生理盐水8 mL/(kg·d)，共30 d。给药结束后，将小鼠继续于原环境饲养至11月龄。

标准环境和丰富环境设定：①标准环境：在5 cm×15 cm×20 cm的塑料笼内只放垫料；②丰富环境：在5 cm×50 cm×75 cm金属网笼中布置有花样繁多的绳梯滑梯、形状颜色各异的跑轮管道积木及球等玩具，每天播放音乐及照射多色光持续2 h[8]。其余条件同标准环境。

1.4.2   行为学测试

筑巢实验：将适量的筑巢材料放入鼠笼，并给予充足的食物和水。次日开始每天早7点观察筑巢结果并进行评分，连续观察4 d。小鼠筑巢过程中尽量保持环境安静，避免出现实验人员进出鼠房而惊扰小鼠筑巢过程的情况[9](注意：筑巢材料最好采用片状、屑状、条状等各种形状的木质或纸质材料，不要使用棉质材料，以防止纤维状的棉絮对小鼠行动造成阻碍以及对小鼠眼睛造成损伤[10])。从放入筑巢材料起到小鼠在笼内自由活动12 h后为止，按照以下评分方法对小鼠筑巢行为进行评估：1分，纸片分布均匀，未形成簇；2分，纸片垫层铺展形成松散的成簇；3分，纸片垫层铺展占1/2笼子或者形成松散的成簇；4分，纸片垫层铺展占1/3笼子或者形成紧实的成簇；5分，纸片垫层铺展占1/4笼子或者形成紧实的成簇[11]。评分越高，说明在大脑控制下的小鼠社会行为及日常生活能力越强，即脑功能越好。筑巢实验结束1 d后进行Morris水迷宫实验。

Morris水迷宫实验：一圆形不锈钢水池(d=120 cm、h=50 cm)，池壁上标有东、南、西、北4个入水点，4个入水点连线将水池分为4个象限。随机选取一个象限，放置一个有机玻璃透明平台(d=14 cm、h=20 cm)并加以固定，平台在水面下1.5-2.0 cm。池内水中加碳素墨水，防止小鼠看到平台，水温恒定在22-25 ℃。水池正上方是和计算机相连的摄像机，可自动记录小鼠的游泳轨迹并进行智能分析[12]。①定位航行实验：历时4 d。每天将小鼠面向池壁从东、西、南、北4个象限分别入水，记录逃避潜伏期(自入水后至找到平台所需时间)。若2 min内小鼠仍未找到平台，则将其轻轻引向平台，记录逃避潜伏期为120 s。每次测试间隔为45 s。取4次结果的平均值作为当日最终结果，逃避潜伏期越长，小鼠的学习能力越差。②空间探索实验：定位航行实验完成后次日撤除玻璃平台，将小鼠从除原平台所在象限的任一象限面向池壁入水，观测小鼠游泳轨迹，记录2 min内小鼠跨越原平台所在位置的次数，次数越少，说明小鼠的记忆力越差。
1.4.3   海马组织形态观察 

标本采集：行为学测试结束后，腹腔注射戊巴比妥钠150-200 mg/kg麻醉小鼠，暴露心脏，于心尖灌注生理盐水，待小鼠肝脏完全变白且右心耳流出澄清液体后，断头处死，冰上取全脑后，沿中间矢状缝切开，左侧半脑置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，常规脱水、透明、石蜡包埋后4 μm切片[13]；右侧半脑冰上分离出海马，经液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。

苏木精-伊红染色：石蜡切片经脱蜡、梯度乙醇脱水后，将切片入Harris苏木精染5 min，自来水洗，1%的盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗。切片入伊红染液中染色3 min。将切片依次放入体积分数95%乙醇Ⅰ5 min-体积分数95%乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min，二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ，5 min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封固。

NeuN免疫荧光/TUNE双标染色：冰冻切片经37 ℃烤片30 min后，PBS漂洗5 min×3次，进行抗原修复，然后用0.01 mol/L PBST漂洗5 min×3次；2%BSA或10%BSA 37 ℃湿盒内封闭30 min。在标本片上滴加适当稀释的小鼠抗NeuN单克隆抗体(1∶500)，放在湿盒中，4 ℃过夜；PBS漂洗5 min×3次，滴加Cy3标记的羊抗兔IgG(1∶200)二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次，根据Tunel凋亡检测试剂盒说明书操作，配置、滴加反应液，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次，加DAPI染细胞核3 min，PBS漂洗5 min×3次，封固。每组至少选取5张切片在荧光显微镜下观察，用Image-Pro Plus软件对图片的荧光强度和神经元数量分析。

尼氏染色：石蜡切片常规脱蜡至水，置入尼氏染色液中染色3 min，后用蒸馏水洗涤2次(每次数秒)；再依次经体积分数75%，95%，100%乙醇进行浓度梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察拍照分析[14]。
1.4.4   Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达   取海马组织，称质量，按比例加入4 ℃ RIPA裂解液，电动匀浆机制备10%的组织匀浆后(冰上操作)，转移至离心管，4 ℃下12 000 r/min离心20 min，取上清液，分装至多个EP管，-80 ℃冷冻备用。取制备的蛋白提取液，上样量50 μg蛋白，经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，封闭2 h，TBST洗膜，分别加入TBST 稀释的兔抗鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2及P53多克隆抗体(1∶1 000，1∶500，1∶500，1∶500)，4 ℃过夜；TBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗山羊抗兔 IgG(1∶20 000)，室温孵育2 h，TBST洗涤；化学发光剂避光反应2.0-3.0 min，ECL显影并拍照。以β-actin作为内参，采用化学发光成像系统扫描分析结果。采用Lane 1D图像分析软件进行吸光度分析，将各吸光度值与内参蛋白β-actin条带吸光度值的比值作为蛋白的相对表达量。
1.5   主要观察指标   ①各组小鼠筑巢实验评分；②各组小鼠Morris水迷宫逃避潜伏期及跨平台次数；③各组小鼠海马组织苏木精-伊红染色、NeuN免疫荧光/TUNEL染色及尼氏染色结果；④各组小鼠海马组织Bax、Caspase-3、Bcl-2、P53蛋白相对表达量。
1.6   统计学分析   采用SPSS 23.0统计学软件处理数据，计量资料采用x±s表示，数据进行正态分布检验及组间方差齐性检验，符合正态分布及方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，当P < 0.01或P < 0.05时即认为该差异有显著性意义。统计学方法已经华北理工大学生物统计学专家审核。

脑老化是指大脑组织结构、形态、功能随年龄增长逐渐出现的一种正常衰退老化的生理现象，表现为细胞数量减少并伴一定程度的脑高级功能障碍，其中认知功能减退是其重要特征之一。脑老化是许多年龄相关性疾病的发病基础，其朝着恶性方向发展到一定阶段有可能会演变成如阿尔茨海默病和帕金森综合征等神经退行性疾病。如何延缓脑老化也是神经精神领域关注的重点。丰富环境通过配备各种有康复作用的玩具，提供温馨的生活环境，给予研究对象感觉、运动、社会交往等方面的综合刺激，发挥神经保护作用[15-16]，如刘佳雨等[17]发现丰富环境干预有助于改善卒中后小鼠认知功能，黄俊等[18]发现丰富环境可改善血管性痴呆大鼠的认知功能。褪黑素作为哺乳动物必需氨基酸-色氨酸的衍生物，可减轻大鼠前额叶皮质缺血引起认知功能障碍[19]；此外，王敏等[20]发现褪黑素可明显改善Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病大鼠的认知功能。此次实验发现丰富环境、褪黑素干预可明显改善SAMP8小鼠学习记忆功能，同前人研究结果一致，但其具体机制有待进一步探讨。

已有多种研究证实，丰富环境、褪黑素可抑制细胞凋亡从而发挥神经保护作用、改善认知功能。有研究发现，褪黑素可抑制细胞色素C的释放及Caspase-3的激活发挥神经保护作用[21]。刘阳阳等[22]发现褪黑素可下调P53表达，减轻缺血性脑卒中模型小鼠线粒体氧化应激损伤和细胞死亡，从而发挥脑保护作用。此外，褪黑素治疗通过调节凋亡相关蛋白如Bcl-2、Bax、C-Caspase-3、C-Caspase-12来抑制软脂酸诱导的CHOP-in B型精原干细胞凋亡[23]。研究表明丰富环境可通过抑制神经细胞凋亡改善运动功能[24]。BAYAT等[25]发现丰富环境可改善突触可塑性提高大鼠学习记忆能力。王传杰等[26]发现丰富环境可以升高缺血性脑卒中小鼠海马区Bcl-2和Bax蛋白表达水平，改善其空间学习和记忆功能。李敏等[27]发现丰富环境处理对脑缺血再灌注损伤后大鼠有保护作用，可通过下调P53蛋白表达抑制细胞凋亡的发生。此次实验发现，丰富环境、褪黑素干预可使SAMP8小鼠海马P53、Bax、Caspase-3蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白表达显著升高，提示丰富环境、褪黑素干预改善SAMP8小鼠学习记忆功能的作用很可能与调控小鼠海马神经细胞凋亡有关。

细胞凋亡是衰老过程中的关键因素。Bcl家族中最有代表性的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax可共同激活促凋亡因子Caspase-3和其家族的其他因子，引起衰老的发生[28-29]。P53是一种重要的转录因子，可对细胞受到的各种压力作出反应。诱导细胞凋亡是P53的重要功能之一，P53活化后可作为转录因子通过死亡受体途径和线粒体凋亡途径有效诱导细胞凋亡[30]。正常情况下，P53蛋白在细胞中维持在极低水平，但当DNA损伤及细胞受到其他刺激时P53表达量升高[31-32]；P53蛋白在核内大量积累，静止的P53则被迅速激活，并且分别与相应蛋白结合形成复合物而降低Bcl-2蛋白的表达，增加抗Bcl-2蛋白的物质(即胰岛素样生长因子、Bax、Fas等)直接或间接地降低Bcl-2蛋白的表达，从而促使细胞快速的大量凋亡。P53在调节Bcl-2家族的平衡方面起重要作用，是调节细胞凋亡的核心[33]。

研究显示SAMP8脑内衰老相关的P53/P21通路活性增强[34]。杨志虹等[35]发现，艾灸神阙穴能延缓D-半乳糖所致衰老模型小鼠的衰老，其作用机制可能与调节脑组织Bcl-2、Bax、Caspase-3和P53的蛋白表达有关。单博颖等[36]发现，何首乌饮可通过上调衰老生精细胞Bcl-2的表达、下调P53和Bax的表达抑制生精细胞凋亡，发挥延缓生精细胞衰老的作用。这与此次实验结果一致，均表明衰老与细胞凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase-3和P53的关系密不可分。

为研究丰富环境和褪黑素联合干预对脑老化造成的学习记忆功能衰退现象的疗效是否强于单方案治疗，此次实验另设丰富环境+褪黑素的联合处理组，与丰富环境组、褪黑素组分别比较后发现，联合处理组的疗效最佳，显著优于丰富环境组和褪黑素组。值得注意的是，在观察P53、Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白的相对表达量后，发现丰富环境和褪黑素联合干预可能对促凋亡因子影响更大，其中丰富环境干预对Caspase-3的影响大于Bax，褪黑素干预的表现正好相反。但总体可以认为，丰富环境和褪黑素联合应用对SAMP8小鼠学习记忆功能的改善疗效很可能高于单方案治疗。

综上所述，丰富环境和褪黑素对SAMP8小鼠学习记忆功能、脑神经细胞凋亡具有改善作用，其机制可能与调控小鼠海马神经细胞P53/P21通路而减少细胞凋亡有关；且将丰富环境和褪黑素联合应用的疗效很可能高于单方案治疗。丰富环境、褪黑素及二者联合干预脑老化的作用机制非常复杂，调控凋亡蛋白的表达只是其中之一，今后将对凋亡蛋白通路上其他蛋白的调控进行深入探索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
丰富环境：作为一种可改善中枢神经可塑性的重要干预模式，丰富环境的社会刺激及非生物刺激等参与细胞凋亡、分化、炎症反应等多种生理过程。丰富环境的作用机制十分复杂，通过调控凋亡相关因子表达改善脑功能，唤起其对环境的适应性行为以及提高其学习能力和记忆能力，是近些年来的研究热点。
褪黑素：褪黑素抑制细胞凋亡具有细胞保护的作用已经被多种研究证实。褪黑素可通过抗tau蛋白过度磷酸化，促进神经元轴突生长、抑制细胞色素C的释放及Caspase-3的激活发挥神经保护作用，但其具体作用机制尚不十分清楚，需进行深入研究。
SAMP8小鼠：快速衰老小鼠是目前研究快速衰老的唯一哺乳类模式动物。其中，SAMP8小鼠主要以学习记忆功能呈增龄性加速衰退，中枢神经系统如皮质、海马等部位发生病理改变为主，其增龄性改变与此次实验的观察指标相符。SAMP8小鼠一直被用于研究衰老与学习记忆功能及学习记忆功能障碍的发生机制，评价抗衰老和益智药物等。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

褪黑激素是一种由松果体分泌的吲哚类神经内分泌激素，参与各种生理功能，包括昼夜节律、性成熟和生殖、衰老、免疫反应、肿瘤、氧化应激及炎症反应等。既往研究发现，褪黑素产量下降是一个导致年龄相关的神经退行性疾病过程的重要因素，并且已经被认为是脑老化进程中重要原因之一。

丰富环境干预作为一种行为疗法，现已证实其能提高包括阿尔茨海默病、帕金森病等多种神经退行性疾病模型动物的神经系统功能和认知表现，与改善脑老化密切相关。

课题使用SAM-P8快速老化小鼠作为研究对象，通过给予实验组不同组别小鼠丰富环境和褪黑素两种因素其一或其二，根据小鼠筑巢实验评分、小鼠Morris水迷宫逃避潜伏期及跨平台次数、小鼠海马组织苏木素-伊红染色、TUNEL染色及尼氏染色结果、小鼠海马组织Bax、Caspase-3、Bcl-2、P53蛋白相对表达量的结果分析，证实丰富环境联合褪黑素方案通过调节SAM-P8小鼠海马P53蛋白及下游多种凋亡相关因子途径，改善其学习记忆功能及减少脑神经细胞凋亡作用具有协同性。

 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程