脑出血模型大鼠PirB和NogoA表达与神经功能缺损

doi:10.12307/2022.621

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (20): 3202-3206.doi: 10.12307/2022.621

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脑出血模型大鼠PirB和NogoA表达与神经功能缺损

杨洋，刘梦兰，孟仁亮，陶涛

西南医科大学附属医院神经内科，四川省泸州市 646000

收稿日期:2021-06-30 接受日期:2021-08-23 出版日期:2022-07-18 发布日期:2022-01-19
通讯作者: 陶涛，博士，副主任医师，西南医科大学附属医院神经内科，四川省泸州市 646000
作者简介:杨洋，女，1989年生，四川省简阳市人，汉族，2017年西南医科大学毕业，硕士，医师，主要从事脑血管疾病研究。
基金资助:
西南医科大学校级基金(2017ZRQN148)，项目负责人：杨洋

Expression of PirB and NogoA and neurological deficits in rats with intracranial hemorrhage

Yang Yang, Liu Menglan, Meng Renliang, Tao Tao

Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2021-06-30 Accepted:2021-08-23 Online:2022-07-18 Published:2022-01-19
Contact: Tao Tao, MD, Associate chief physician, Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Yang Yang, Master, Physician, Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
Southwest Medical University School-level Fund, No. 2017ZRQN148 (to YY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
PirB：是一种跨膜蛋白，与人类LILRB2同源，是主要组织相容性复合物Ⅰ的受体。PirB可表达于中枢神经系统，主要分布于大脑皮质和海马的神经元及星形胶质细胞，是Nogo-66、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白和髓鞘相关糖蛋白3种髓鞘抑制因子的独立功能受体，对调节神经元导向、突触可塑性和稳定神经通路起重要作用，同时也可抑制轴突再生及神经突的生长。
NogoA：是最先被发现的轴突再生抑制因子，主要表达于中枢神经系统的少突胶质细胞，参与神经系统发育以及神经元和突触可塑性的调节，在正常成熟的中枢神经系统其表达下调，维持突触结构及神经环路的稳定性，限制生理性的突出重塑；在中枢神经损伤的情况下其表达水平增高，抑制神经突的生长和轴突再生。

背景：NogoA和PirB是髓鞘相关抑制因子及受体，在多种中枢神经系统损伤模型中表达明显增高，且起着抑制轴突再生和阻碍神经功能恢复的作用，脑出血遗留严重持久的神经功能障碍可能与二者有关。
目的：通过构建大鼠脑出血模型，探讨PirB和NogoA蛋白表达与神经功能缺损的关系。
方法：健康雄性SD大鼠75只，随机分为假手术组(n=25)和脑出血组(n=50)，按取材时间点不同分为12 h及1，3，7，14 d组，假手术组大鼠不做任何处理，脑出血组大鼠以自体鼠尾不凝血经改良二次注入法建立脑出血模型。各时间点大鼠进行神经功能缺损评分后深度麻醉断头取脑，采用Western blot检测PirB和NogoA蛋白的定量表达，免疫荧光观察PirB定位表达。
结果与结论：①PirB可表达于成年健康大鼠的神经元及星形胶质细胞的胞体和突起；②脑出血组各时间点PirB和NogoA表达较假手术组明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，在脑出血后第3天达到高峰，持续至14 d表达仍较高；③脑出血组PirB和NogoA的表达与神经功能评分呈负相关关系；④结果表明，PirB和NogoA均可表达于健康成年大鼠脑组织中，脑出血后PirB和NogoA表达明显上调并抑制轴突再生，从而阻碍神经功能的恢复。

https://orcid.org/0000-0002-4997-3896 (杨洋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脑出血, PirB, NogoA, 轴突再生, 神经功能缺损, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Neurite outgrowth inhibitor A (NogoA) and paired immunoglobulin-like receptor B (PirB) are myelin-related inhibitors and receptors. They are significantly increased in a variety of central nervous system injury models, and play a role in inhibiting axon regeneration and impeding the recovery of nerve function. Persistent and severe neurological deficits due to intracerebral hemorrhage may be related to both NogoA and PirB.
OBJECTIVE: To investigate the protein expression of PirB and NogoA and their important effect on neurological deficits by constructing a rat model of intracranial hemorrhage.
METHODS: Seventy-five male Sprague-Dawley rats were randomly assigned into a sham surgery group (n=25) and an intracranial hemorrhage group (n=50). According to the time point of sample collection, each group was randomly divided into five subgroups as a 12-hour group, a 1-day group, a 3-day group, a 7-day group, and a 14-day group. Rats in the sham surgery group did not receive any treatment, while a rat intracranial hemorrhage model was established by modified secondary injection with autologous rat tail blood in the intracranial hemorrhage group. After the neurological deficit score was performed at each time point, rats were decapitated under deep anesthesia and brain samples were taken. Western blot was used to detect the quantitative protein expression of PirB and NogoA, and the location expression of PirB was observed by immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: PirB could be expressed in neurons and astrocytes of health adult rats. The expression of PirB and NogoA in the intracranial hemorrhage group was significantly higher than that in the sham surgery group at each time point (P < 0.05). The expression peaked on the 3rd day after intracranial hemorrhage, and remained relatively high until the 14th day. The expression of PirB and NogoA in the intracranial hemorrhage group was negatively correlated with the neurological deficit scores. These results indicate that PirB and NogoA can be both expressed in the brain tissue of health adult rats, which is significantly up-regulated and inhibits axon regeneration after intracranial hemorrhage, thereby hindering the recovery of nerve function.

Key words: intracranial hemorrhage, paired immunoglobulin-like receptor B, neurite outgrowth inhibitor A, axon regeneration, neurological deficit, rat

中图分类号:

杨洋, 刘梦兰, 孟仁亮, 陶涛. 脑出血模型大鼠PirB和NogoA表达与神经功能缺损[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(20): 3202-3206.

Yang Yang, Liu Menglan, Meng Renliang, Tao Tao. Expression of PirB and NogoA and neurological deficits in rats with intracranial hemorrhage[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(20): 3202-3206.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析此次实验共84只大鼠参加实验，进入结果分析75只，有9只大鼠中途脱落，包括脑出血组0级大鼠3只、麻醉意外死亡2只、造模过程中死亡3只、造模成功后饲养死亡1只。
2.2 神经功能评分假手术组大鼠术后一般情况良好，无神经功能障碍，各时间点评分均为18分。脑出血组大鼠神经功能缺失评分低于相应时间点的假手术组，差异有显著性意义(P < 0.05)；脑出血1 d神经功能缺失评分最低，与其他时间点相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.3 PirB蛋白的表达 PirB蛋白可表达于正常成年大鼠脑组织中，但表达甚少，脑出血后PirB的表达较假手术组各时间点明显增高(P < 0.05)，其表达在3 d达到高峰，与脑出血组其他时间点比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2-4。

2.4 NogoA蛋白的表达 NogoA可少量表达于正常大鼠脑组织中，脑出血后NogoA表达明显增高，在3 d达到高峰，与脑出血组其他时间点比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5-7。

2.5 PirB同时表达在神经元及星形胶质细胞 PirB阳性细胞发出红色荧光，星形胶质细胞和神经元细胞均为绿色荧光，前者形状不规则，细胞周围有许多突起，后者呈圆形或椭圆形，可见胞体一侧发出的轴突或轴突起始部，通过图像Merge后可见红色荧光与绿色荧光重叠显示出黄色荧光，说明PirB可表达在神经元细胞的胞体和轴突、星形胶质细胞的胞体和突起，胞核未见表达，见图8。

2.6 PirB、NogoA的表达与神经功能缺损的关系脑出血后PirB表达与NogoA表达呈正相关，差异有显著性意义(r=0.818，P < 0.05)，PirB的表达与神经功能评分均呈负相关关系，差异有显著性意义(r=-0.418，P < 0.05)，NogoA的表达与神经功能评分呈负相关关系，但差异无显著性意义(r=-0.058，P > 0.05)。既往大量研究证实NogoA在损伤的中枢神经系统中均可抑制轴突再生，阻碍神经功能恢复，该实验结果可能由于实验样本量较小，统计数据较少且差异性大所造成。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，两独立样本均数间比较主要用t检验，多组间比较采用ANOVA单因素方差分析，各观察指标相关性分析采用Pearson相关系数分析法。
1.2 时间及地点实验于2018年9月至2020年1月在西南医科大学附属医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康雄性成年SD大鼠75只，体质量250-280 g，由西南医科大学动物实验中心提供。
1.3.2 实验试剂和仪器多聚甲醛粉剂、高纯度蔗糖、小牛血清、PBS粉剂(索莱宝生物科技有限公司)；PVDF膜、HRP化学发光试剂(Millipore，美国)；1.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.8)、1.0 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)、10%SDS、Tween-20、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)、Western一抗稀释液、强RIPA裂解液、PMSF、防荧光淬灭剂、DAPI染色液(碧云天生物技术研究所)；TritonX-100(Amresco，美国)；山羊抗大鼠PirB多克隆抗体(A-20，Santa Cruz，美国)；兔抗大鼠NogoA多克隆抗体(13401，Cell Signal Technology，美国)；兔抗大鼠MAP2多克隆抗体(W14)、小鼠抗大鼠GAPDH单克隆抗体(1A6)(Bioworld，美国)；兔抗大鼠GFAP多克隆抗体(16825-1-AP)、Cy3标记驴抗山羊IgG(SA00009-3)、HRP标记山羊抗兔IgG(SA00001-2)(武汉三鹰生物技术有限公司)；FITC标记小鼠抗兔IgG(bs-0295M-FITC)(北京博奥森生物技术有限公司)；HRP标记兔抗山羊IgG(ab6741)、HRP标记山羊抗小鼠IgG(ab6789)(Abcam，美国)；手术器械包(西南医科大学消毒供应室)；50 μL微量注射器(上海上天精密仪器有限公司)；-80 ℃冰箱、低温高速离心机、水平摇床、免疫印迹化学发光仪，光学显微镜、激光发光盒(美国Thermo公司)；垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组 75只SD大鼠随机分为假手术组25只和脑出血组50只，脑出血组随机分为免疫印迹组和免疫荧光组各25只，再根据断头取脑时间不同随机分为12 h及1，3，7，14 d组，每个时间点5只，分别于鼠尾编号分笼饲养，自由饮水和进食，饲养房内温度23-25 ℃，湿度约50%。

1.4.2 模型制作大鼠予以1%戊巴比妥钠麻醉后，俯卧位固定于大鼠立体定位仪，经剃毛消毒后行正中切口切开头皮，定位钻孔部位在前囟右侧3 mm、向前0.2 mm，取鼠尾血50 μL[15]，经微量注射器沿钻孔缓慢进针6 mm，经改良二次注射法将自体血注入右侧大脑半球尾状核[16]。假手术组不进针和注射血液。术后待大鼠苏醒后以Bederson评分标准进行神经行为评分[17]，1分及以上为造模成功。

1.4.3 神经功能评分各时间点大鼠处死前以GARCIA等[18]的神经功能评分标准进行评分，见表1。

1.4.4 取材免疫印迹组大鼠经戊巴比妥深度麻醉后，立即离断头颈，开颅取出完整脑组织，将血肿周围脑组织快速置入液氮中冷冻，随后转移至-80 ℃冰箱备用。免疫荧光组大鼠经戊巴比妥深度麻醉后，迅速打开胸腔，经主动脉弓予以0.1 mol/L的PBS及40 g/L多聚甲醛依次灌注后断头取脑，脑组织依次置于甲醛液后固定、蔗糖液中脱水，备用。
1.4.5 Western blot检测PirB及NogoA蛋白的表达免疫印迹组大鼠脑组织解冻后加入组织裂解液研磨、离心，取上层清液测定样品蛋白浓度，按4∶1的比例加入5×上样缓冲液，煮沸变性8 min，每孔加入50 μg蛋白样品进行电泳分离(8% SDS-PAGE，60 V，30 min；120 V，60 min)后转膜(PDVF膜，4 ℃，100 V，180 min)，含有蛋白的PVDF膜经5%脱脂牛奶封闭洗涤后，加入一抗：小鼠抗大鼠GAPDH单克隆抗体(1∶10 000)、山羊抗大鼠PirB多克隆抗体(1∶250)和兔抗大鼠NogoA多克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，次日加入二抗：HRP标记山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)、HRP标记兔抗山羊IgG(1∶5 000)和HRP标记山羊抗兔IgG(1∶3 000)，孵育后ECL显影并拍照，用Quantity One软件对条带进行分析，以目的条带与内参条带吸光度的比值作为蛋白表达的相对含量。
1.4.6 免疫荧光检测PirB的定位表达取后固定的免疫荧光组大鼠血肿周围脑组织经OCT包埋后进行冰冻切片，切片厚度8 μm，将切片置于玻片上自然晾干，滴10% TritonX-100进行组织打孔，5% BSA封闭后置于避光孵育盒中。配置不同浓度的抗体：①山羊抗大鼠PirB多克隆抗体和兔抗大鼠MAP2多克隆抗体，抗体分别按1∶20和1∶100的比例以5%小牛血清混合稀释；②山羊抗大鼠PirB多克隆抗体和兔抗大鼠GFAP多克隆抗体分别按1∶20和1∶50的比例以体积分数为5%小牛血清混合稀释。将①和②抗体溶液滴于相应标记的组织上，玻片放于湿盒中于4 ℃冰箱避光孵育过夜。次日将Cy3标记驴抗山羊IgG和FITC标记小鼠抗兔IgG分别按1∶20和1∶100的比例混合稀释，滴于清洗过的组织切片上避光孵育，清洗后再滴DAPI避光孵育，清洗干净后以防荧光猝灭剂封闭并盖好盖玻片，放于荧光显微镜下曝光拍照。
1.5 主要观察指标脑出血各时间点大鼠神经功能缺损评分，PirB及NogoA蛋白定量表达以及PirB的定位表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件对相关数据进行分析，两独立样本均数间比较主要用t检验，计量资料以x±s表示，多组间比较采用ANOVA单因素方差分析，各观察指标相关性分析采用Pearson相关系数分析法，检验水准为a=0.05(双侧)，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脑出血虽然只占整个脑血管疾病15%-20%[19]，但其死亡率在脑出血后7 d高达35%，脑出血后1年高达59%[20]，幸存者常常遗留严重的神经功能障碍。目前脑出血的治疗较为局限，外科手术减压被认为是出血急性期挽救患者生命的有效方法，无生命危险的脑出血患者常采用降颅压、营养神经、调控血压、血糖等对症支持治疗，但脑出血后期遗留的持久严重的神经功能障碍尚无特效治疗方案[21-22]。轴突损伤和再生是脑出血后的关键病理改变，二者对神经功能修复有着持久的影响[23-24]。越来越多的研究表明，髓鞘相关抑制因子及其下游受体相关通路是抑制轴突再生、阻碍神经功能修复的关键所在，而NogoA-PirB通路是其中重要的抑制信号传导通路，多种中枢神经损伤研究证实该通路抑制轴突再生及神经功能修复，但该通路在脑出血中的研究甚少。NogoA是最先被发现也是抑制作用最强的髓鞘相关抑制因子，主要表达在少突胶质细胞，通过与神经元表面NgR受体复合物特异性结合而发挥抑制轴突再生的作用[25-26]。既往研究发现，在脑梗死大鼠脑组织中，NogoA表达明显增高，NogoA基因敲除后可减轻神经元的凋亡，减小大鼠的脑梗死面积[27]。NogoA在脑出血后表达也明显增加，于48 h达高峰，可加重神经元凋亡，抑制脑出血后行为及认知功能修复[28]。经 Nogo-A抗体治疗，大脑中动脉闭塞模型大鼠神经功能障碍得到改善，且Nogo-A抗体对卒中后1周、合并有并发症或卒中发生已达9周的大脑中动脉闭塞大鼠仍然有较好的疗效，表明Nogo-A在脑梗死后期仍然有表达，在抑制神经再生过程中起着重要的作用[29]。该研究发现，NogoA可表达于正常成年大鼠脑组织中，为维持神经功能稳定起着关键作用；脑出血后NogoA表达明显增高，在脑出血3 d达表达高峰，且持续至脑出血后2周表达仍明显高于假手术组，与LIU等[28]的研究结果一致，但表达高峰有所延迟，可能由于样本量或时间亚组差异所致，同时也可能说明NogoA的表达高峰持续时间较长；该研究证实了NogoA在脑出血后更长时间的表达增加，结合神经功能缺损持续存在，说明在损伤的中枢神经系统中，过量表达的NogoA可能长时间持续参与神经毒性相关作用，是轴突再生困难及神经功能障碍持续存在的关键因素，持续影响脑出血后的神经功能恢复。
除NgR以外，PirB 是髓鞘相关抑制因子的另一个独立功能受体，且与NogoA具有高度亲和力，在中枢神经系统整个发育过程和成年期均有表达，主要表达于大脑皮质和海马的神经元及星形胶质细胞，对调节神经元导向、突触可塑性和稳定神经通路起重要作用[12，30]。既往有研究发现，在大脑中动脉闭塞、皮质梗死和氧糖剥夺的多种缺血性模型中，PirB的表达均明显增加，且在脑梗死后3 d可达高峰，而在氧糖剥夺的体外模型中，阻断PirB后可明显减轻细胞凋亡[13]。在短暂性全脑缺血后，PirB在脑组织中的表达明显增高，于24 h达高峰，而阻断PirB可减少神经元凋亡，从而促进神经功能的恢复[31]。作为抑制轴突再生的关键因子，PirB在脑出血后表达明显增加并在48 h达高峰，而抑制NogoA/PirB通路可促进脑出血大鼠行为及认知功能的恢复[10]。
研究证实，健康成年大鼠脑组织中有少量PirB表达于神经元及星形胶质细胞的胞体和突起，可能对调节突出可塑性及稳定神经环路起着重要作用。大鼠脑出血后出现明显的神经功能缺损，PirB表达明显增加且脑出血3 d达高峰，直至脑出血中后期仍遗留持久的神经功能障碍，病理组织学表现为轴突断裂、紊乱、缩短，直至损伤后14 d未见明显恢复，说明PirB在中枢神经系统损伤之后有明显的轴突再生抑制作用，尤其是在损伤的中后期，尽管PirB表达有所下调，神经功能有所恢复，但轴突修复再生能力差，因此PirB持续高表达或持续的抑制作用可能长期影响中枢神经损伤的修复，阻碍神经功能的恢复，说明PirB可能成为神经修复的关键靶点。NogoA和PirB二者的表达趋势一致，呈正相关关系，二者是否具有相互促进和激活的作用，在今后的研究中可进一步探索，同时也可以以PirB为起点，研究其下游RhoA-ROCK、LZK-JNK通路抑制轴突再生的具体机制，为临床应用及新型药物的研究提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

脑出血模型大鼠PirB和NogoA表达与神经功能缺损

Expression of PirB and NogoA and neurological deficits in rats with intracranial hemorrhage

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