2.1   小鼠基因鉴定结果   通过PDHA1 (iΔEC/iΔEC)条件性敲除小鼠和PDHA1(iΔEC/-)小鼠交配得到PDHA1(iΔEC/iΔEC)子代小鼠。PCR扩增CreERT2基因检测子代小鼠，见图1，以琼脂糖凝胶电泳进行基因鉴定，334 bp为目的条带大小，在300-400 bp位置出现条带便可确认为PDHA1(iΔEC/iΔEC)小鼠。鉴定完成后，观测小鼠的体型及体质量，发现PDHA1(iΔEC/iΔEC)小鼠和PDHA1(iΔEC/-)小鼠体质量和体表特征无差异。



2.2   小鼠肺组织中的PDHA1蛋白表达水平   PDHA1(iΔEC/iΔEC)条件性敲除小鼠的PDHA1蛋白相对表达量低于PDHA1(iΔEC/-)小鼠(t=4.320，P=0.002 5，P < 0.01)，二者比较差异有统计学意义，见图2。



2.3   小鼠肺组织中的PDHA1 mRNA表达水平    PDHA1(iΔEC/iΔEC)条件性敲除小鼠的PDHA1 mRNA表达低于PDHA1(iΔEC/-)小鼠(t=2.272，P=0.029 7，P < 0.05)，差异有统计学意义，见图3。



2.4   基因敲除后的能量代谢改变   HK2是糖酵解的关键限速酶，IDH是有氧磷酸化的关键酶。在PDHA1基因敲除后，小鼠肺组织中HK2的表达升高，IDH的表达降低，说明线粒体中有氧磷酸化代谢减弱，糖酵解代谢增加，见图4。



PDHA1 (iΔEC/ iΔEC)和PDHA1 (iΔEC/-)两组HK2和IDH蛋白比较差异均有统计学意义(tHK2=2.488，P=0.02，P < 0.05；tIDH=2.166，P=0.041 4，P < 0.05)；PDHA1 (iΔEC/ iΔEC)和PDHA1 (iΔEC/-)两组HK2和IDH mRNA比较差异均有统计学意义(tHK2=2.198，P=0.04，P < 0.05；tIDH=2.778，P=0.014 1，P < 0.05)。
2.5   免疫荧光检测PDHA1基因敲除情况   血管内皮细胞钙粘连蛋白VE-Cadherin 是血管内皮细胞膜上特异性表达的蛋白，PDHA1蛋白是细胞质中表达的蛋白。对PDHA1(iΔEC/iΔEC)和 PDHA1(iΔEC/-)小鼠的肺脏切片进行免疫荧光双色染色，可以鉴定VE-Cadherin染色后的血管内皮细胞中PDHA1蛋白的表达，如图5所示，PDHA1(iΔEC/-)的表达明显高于PDHA1(iΔEC/iΔEC)小鼠，说明PDHA1(iΔEC/iΔEC)小鼠成功在血管内皮细胞上敲除了PDHA1基因。

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血管内皮细胞的能量代谢方式与许多疾病有关，已有研究显示，在动脉粥样硬化的进程中，血管内皮细胞的氧化应激反应引起氧化代谢失衡，分泌高水平的活性氧可以降低一氧化氮和硫化氢产生，引起血管内皮细胞炎症反应增强、白细胞黏附增加、血小板聚集，形成恶性循环，加剧动脉粥样硬化的进程[1-2]，辅酶Q10作为线粒体呼吸链的一个重要组成部分之一，通过促进能量代谢在动脉粥样硬化的防治中发生作用[3]。ZHANG等[4]发现通过敲除Sirt3基因后，血管内皮细胞的耗氧量增加，但血管新生能力降低，心肌细胞因缺氧功能丧失，因而血管内皮细胞的糖酵解途径与心肌功能息息相关。血管内皮细胞通过糖酵解途径促进巨噬细胞向M2型极化，提高肌肉再生能力，而在敲除PFKFB3后，巨噬细胞向M1型极化，肌肉再生能力降低[5]。由此可见，血管内皮细胞的呼吸代谢方式与疾病的发生发展有密切关系。
血管内皮细胞虽然是以糖酵解为主要的代谢方式，但是以线粒体呼吸为主的有氧磷酸化在内皮细胞并未消失[6]。PDHA1基因是编码丙酮酸脱氢酶1(PDHE1)重要亚基的载体基因，是连接糖酵解与三羧酸循环的枢纽，是能量调控的关键基因[7]。研究显示，PDHA1基因缺乏能够引起Leigh综合征，引起乳酸堆积在神经肌肉系统，发生相关疾病[8]。PDHA1与多种疾病及肿瘤发生有关。Sirt3通过HIF1α/PDK1/PDHA1通路抑制胆管癌肿瘤的发生而发挥抗Warburg作用[9]。目前，关于PDHA1基因与肿瘤的研究多限于细胞和分子层面[10-12]，虽然血管内皮细胞特异性敲除小鼠的构建技术较为成熟[13-15]，但PDHA1基因在血管内皮细胞的敲除尚属首次构建。在动物整体水平分析PDHA1基因在血管内皮细胞相关疾病中的表达来映射能量代谢在不同疾病的作用。通过改变内皮细胞的能量代谢方式可能对疾病的发生发展产生影响。
Cre/LoxP重组酶是构建条件性基因敲除鼠常用的技术，其中Cre重组酶包括2种，一种是从妊娠期进行的条件性基因敲除，一般表示为Cre重组酶；另一种是可诱导重组酶，一般表示为CreERT2重组酶，CreERT2是Cre重组酶与雌激素受体组成的融合蛋白，其中ER配体能够与他莫昔芬结合，从而介导CreERT2重组酶从细胞质进入细胞核，切除2个同向的LoxP位点之间的DNA序列，使得在特定的时间和空间敲除或活化某特定靶向基因变得可控[16]。为满足实验的可控性，采用CreERT2重组酶系统用于内皮细胞PDHA1特异性敲除，通过他莫昔芬诱导实现同时期敲除PDHA1基因和造模。
建立内皮细胞PDHA1基因条件性敲除小鼠是研究内皮细胞呼吸代谢与疾病关系的重要途径。到目前为止，PDHA1基因研究多集中在肿瘤和PDHA1特异突变疾病，而在其他疾病中并未有报道。血管内皮细胞的能量代谢可能与不同器官疾病有关，课题组前期发现辅酶Q10灌胃能够缓解矽肺纤维化的发展[17]，而血管内皮细胞的HGF基因敲除对纤维化的发展具有促进作用[18]。该研究通过血管内皮细胞PDHA1基因特异性敲除鼠的繁育及鉴定，为后续研究血管内皮细胞PDHA1基因与肺纤维化的相关机制提供实验基础，且为血管内皮细胞能量代谢引起其他疾病的研究提供了新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   动物学体内实验。通过PDHA1(iΔEC/iΔEC)和PDHA1 (iΔEC /-)交配，子代进行基因鉴定，两组比较采用t检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年1-12月在宁夏医科大学动物实验中心屏障实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   SPF级2只成年PDHA1 (iΔEC/iΔEC)雄鼠与4只成年PDHA1 (iΔEC /-)雌鼠，购自北京唯尚立德生物科技有限公司。实验过程经过宁夏医科大学伦理委员会审核，批准号为IACUC-NYLAC-2020-100。实验动物饲养于宁夏医科大学动物实验中心屏障实验室，室内温度20-25 ℃，昼夜12 h交替喂养。
1.3.2   实验试剂   DNA裂解液：Triton X(Solarbio，T8200)、Tris(Solarbio，pH 8.0，T6061)、20 g/L蛋白酶K(中国天根公司，RT403-01)；DNA Marker(宝日医生物技术有限公司，北京，MD107)；RNA提取试剂(中国天根公司，DP419)；蛋白提取试剂盒(南京凯基公司，KGP2100)；PDHA1引物及Cre引物(上海生物工程有限公司合成)；反转录与荧光定量PCR试剂盒(Thermo Fisher，美国，RR036A；RR820A)；EB类似物(GR501-01)及蓝酶(南京诺唯赞生物科技有限公司，P112-AA)；PDHA1抗体(Abcam，ab110330，美国)；HK2抗体(Abcam，ab209847，美国)；IDH抗体(sc-373816，Santa，Europe)；β-actin直标抗体(sc-47778，Santa，Europe )；辣根过氧化氢酶标记荧光二抗(博奥森，北京)；琼脂糖粉末(Invitrogen，美国)；PVDF膜(上海索莱宝生物科技有限公司)。其他常用试剂如脱脂奶粉、PBS粉末、Tris、(NH4)2SO4、HCl、NaOH、MgCl2等均为国产分析纯。
1.3.3   实验仪器   荧光定量 PCR仪(qTOWER3G，枫岭，中国上海)；电泳仪及凝胶成像系统(Rio-Rad，PowerPac，美国)；激光共聚焦显微镜(蔡司，LSM 800，德国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   繁育足够数量的PDHA1-Tek-CreERT2(f/f,+)小鼠   将上述2只雄鼠和4只雌鼠合笼，在雌鼠出现阴栓时确定雌鼠怀孕，待小鼠出生三四周后，小鼠以耳标作为标记，剪趾进行基因鉴定。6周龄小鼠按75 mg/kg剂量腹腔注射他莫昔芬(他莫昔芬质量浓度20 g/L，玉米油溶解，避光保存)，每24 h注射1次，连续注射5 d，注射完毕后，8周龄取材。将肺组织右下叶灌注50%OCT进行冰冻组织包埋，其余肺叶直接放入-80 ℃冻存。
1.4.2   小鼠基因鉴定
(1)10×MGB溶液的配制：取1只50 mL的干净离心管，向其中加入0.05 mol的Tris晶体溶于50 mL的去离子水，测其酸碱度并将pH值调至8.8；另取一只15 mL的干净离心管，向其中加入0.02 mL的(NH4)2SO4和10 mL去离子水至完全溶解；另取一只15 mL的干净离心管，向其中加入0.01 mL的MgCl2和10 mL去离子水。将上述溶液完全配好后，取6.7 mL的Tris溶液置于干净的离心管，加入830 μL的(NH4)2SO4溶液、650 μL的MgCl2溶液及1.82 mL的ddH2O充分混匀。
(2)Lysis mix的配制：取配制好的1 mL 10×MGB，50 μL 100% Triton X，100 μL β-巯基乙醇和8.4 mL ddH2O混合均匀。
(3)小鼠脚趾消化提取DNA：取用已经配制计算好的Lysis mix，向其中加入蛋白酶K(每200 μL Lysis mix加入3 μL蛋白酶K，现用现配)，向盛有小鼠脚趾的EP管中加入120 μL已配好的上述溶液，55 ℃水浴过夜裂解，95 ℃变性10 min后11 000 r/min离心5 min，取上清液。
(4)DNA复制及基因鉴定：向PCR的八联管中分别加入10 μL诺维赞蓝酶，0.3 μL上游引物及0.3 μL下游引物，以及0.59 μL提取好的DNA。在95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 42 s，40个循环，72 ℃ 5 min，16 ℃保存，然后进行DNA扩增，将扩增的DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，曝光观察DNA条带。CreERT2引物：正向引物为5'-CGC TAA GGA TGA CTC TGG-3'；反向引物为5'-CAA CAA GGC ACT GAC CAT-3'。
1.4.3   Western blot检测小鼠肺组织中蛋白表达水平   无菌取小鼠的肺组织，用剪刀剪碎后，加入配比好的磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、PMSF和Lysis Buffer，高剪切分散乳化机充分破碎组织细胞，提取小鼠肺组织总蛋白。取部分总蛋白加入Loading buffer和超纯水将蛋白稀释为3 mg/L，95 ℃变性5 min；取变性后蛋白样品10 μL，10%SDS-PAGE制胶电泳恒压80 V后转120 V；将凝胶的蛋白转移至PVDF膜上(恒压15 V，75 min)，5%脱脂奶粉(PBST缓冲液配制)封闭2 h，加入PDHA1(1∶1 000)、HK2(1∶1 000)、IDH(1∶500)及GAPDH(1∶5 000)一抗稀释液4 ℃摇床孵育过夜，PBST缓冲液洗3次，每次10 min；辣根过氧化物酶标二抗室温孵育2 h，PBST缓冲液洗脱3次，每次10 min；ECL化学发光法显像，曝光时间可按照发光信号的强弱进行调整，Image Lab测定灰度值。
1.4.4   实时定量PCR检测小鼠肺组织中mRNA表达水平   取小鼠的肺组织，收集到1.5 mL的EP管中，用剪刀剪碎后，向EP管中约加入1 mL裂解液RZ(按每50-100 mg组织样品加入裂解液RZ 1 mL)，在匀浆仪中进行匀浆处理；4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清液至新的无RNAase EP管；加入200 μL氯仿充分振荡，于室温静置3 min后再4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取水相经洗脱后得到RNA保存备用；用紫外分光光度计测定A260/A280值，选取A260/A280比值介于1.8-2.1间的RNA进行反转录，合成cDNA作为模板进行q-PCR反应，反应体系为20 μL，其中TB Green Premix Ex TaqⅡ(2*)10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，余下用灭菌水补齐；反应条件为95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 42 s，共计40个循环，反应开始前95 ℃预热5 min；每个样品3个复孔。PDHA1引物序列：正向引物为5'-TGT GAC CTT CAT CGG CTA GAA-3'；反向引物为5'-TGA TCC GCC TTT AGC TCC ATC-3'；HK2引物序列：正向引物为5'-ATG ATC GCC TGC TTA TTC ACG-3'；反向引物为5'-CGC CTA GAA ATC TCC AGA AGG G-3'；IDH引物序列：正向引物为5'-GTG GGC GTC AAG TGT GCT A-3'；反向引物为5'-CCA CCC AGA ATG TTT CGG ATG-3'。
1.4.5   小鼠肺组织免疫荧光VE-cadherin和PDHA1共染   从-80 ℃中取出小鼠肺组织取材直接制作冰冻切片，置入湿润的暗盒中恢复至室温并使组织表面干燥，将其置入0.01 mol/L的PBS中，摇床漂洗5 min，减少自身背景；40 g/L多聚甲醛浸润覆盖固定25 min，PBS漂洗3次，每次5 min；0.3%Triton-100细胞膜打孔20 min，PBS漂洗3次，每次3 min；体积分数为5%胎牛血清封闭30 min，加入1∶200 VE-cadherin和PDHA1一抗，4 ℃封闭过夜；次日，将暗盒取出恢复至室温，PBS漂洗3次，避光孵育二抗，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3次；加入DAPI避光孵育3 min，PBS漂洗3次；滴加抗荧光猝灭剂，覆盖载玻片，用指甲油封固，蔡司LSM800激光共聚焦显微镜观察。 
1.5   主要观察指标   ①PDHA1 (iΔEC/iΔEC)小鼠和PDHA1 (iΔEC/-)小鼠的体长和体质量；②PCR基因鉴定结果；③小鼠肺组织PDHA1蛋白和mRNA表达；④小鼠血管内皮细胞PDHA1的免疫荧光表达；⑤小鼠肺组织HK2、IDH蛋白及mRNA表达。
1.6   统计学分析   采用SPSS 24.0软件对所有数据进行统计分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

PDHA1基因作为丙酮酸脱氢酶复合体PDHc的关键亚单位载体基因[10]，对细胞的有氧呼吸链意义重大。目前已知在胰岛β细胞中利用Cre/LoxP系统条件性敲除PDHA1来研究糖尿病与胰岛β细胞能量代谢的相关关系[19]。Cre/LoxP系统已经成功将血管内皮细胞中的DEPTOR(含有DEP结构域的mTOR相互作用蛋白，其调节血管内皮细胞活化，并且在体外促炎和血管生成反应中发挥重要作用)基因条件性敲除，为研究DEPTOR基因在体内动物水平血管疾病相关的研究奠定基础[20]。敲除血管内皮细胞中的PFKFB3以及HK2，可降低血管内皮细胞糖酵解能力，抑制血管生成[21]，且PFKFB3能介导内皮细胞糖酵解促进肺动脉高压[22]。因此，探究PDHA1基因在动物体内血管相关疾病中的作用是课题组未来的发展方向。
外来物质经呼吸道吸入肺中，可刺激肺部发生免疫炎症反应，细胞进行炎症损耗和修复，引起细胞外基质沉积，逐渐累积形成肺纤维化[23]。在肺纤维化的形成过程中，血管内皮细胞扮演着重要的角色，血管内皮细胞直接参与细胞外基质沉积，它可合成胶原、纤维连接蛋白、层连蛋白等结缔组织成分，肺纤维化时血管内皮细胞周围可见大量胶原纤维合成[24]。因此，肺血管内皮细胞及胶原沉积在肺纤维化发病中具有重要作用，且二者存在相互联系、相互促进的关系[25]。CAO等[18]研究表明调节血管周围成纤维细胞和内皮细胞之间的作用可能会消除肺纤维化，形成上皮诱导的生态位，用于实质细胞的重建和再生。LI等[26]研究发现血管内皮细胞的线粒体呼吸能够通过产生活性氧和一氧化氮信号分子调控信号通路促进血管新生，由此推断改变内皮细胞的能量代谢方式可能影响矽肺纤维化的发生发展。
实验结果发现PDHA1(iΔEC/ iΔEC)特异性敲除鼠在注射他莫昔芬后，PDHA1基因表达下降，但PDHA1基因作为一个能量代谢的重要基因，不能将其完全消除，否则小鼠将不能存活，故进行的基因繁育小鼠均为杂合子。通过对原代PDHA1(iΔEC/ iΔEC)和PDHA1(iΔEC/-)相互交配，繁育出PDHA1(iΔEC/ iΔEC)小鼠15只，PDHA1(iΔEC/-)小鼠2只，符合孟德尔遗传定律，在8周龄二者体质量及体表特征比较无显著差异，说明血管内皮细胞敲除PDHA1基因对小鼠的体质量及外形并未有影响。PDHA1(iΔEC/ iΔEC)基因鉴定结果可见CreERT2基因在334 bp有条带，而334 bp处无条带，证明该鼠为PDHA1(iΔEC/-)基因鼠。PDHA1蛋白及mRNA表达在敲除鼠的血管内皮细胞下降，证实PDHA1(iΔEC/ iΔEC)基因敲除小鼠繁育成功。分别验证糖酵解和氧化磷酸化的限速酶HK2和IDH的表达，证实了血管内皮细胞能量代谢改变。
课题组前期的10X单细胞测序结果显示，在生理盐水和二氧化硅处理的小鼠中，内皮细胞的PDHA1基因表达差异有显著性意义。PDHA1基因在血管内皮细胞部分敲除后，作者将在后期进行矽肺造模，判断该基因在血管内皮细胞参与矽肺纤维化中的作用机制。
由上述可知，血管内皮细胞在疾病中扮演着重要的角色，不同的能量代谢途径能够与不同的病理生理相关联。作者希望通过探讨血管内皮细胞的能量相关代谢基因PDHA1缺失对肺纤维化的影响，阐述血管内皮细胞的有氧磷酸化途径在肺纤维化中的作用。而且未来通过对血管内皮细胞的能量相关代谢基因PDHA1缺失研究更多的疾病与血管内皮细胞的能量代谢关系。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
PDHA1基因：是编码丙酮酸脱氢酶1重要亚基的载体基因，是连接糖酵解与三羧酸循环的枢纽，是能量调控的关键基因。
丙酮酸脱氢酶复合体：是有氧呼吸链中将丙酮酸转化为乙酰辅酶A的重要酶，将糖的有氧氧化与三羧酸循环和氧化磷酸化连接起来，在细胞线粒体呼吸链能量代谢中的作用至关重要。

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基因敲除小鼠是研究不同基因在体内复杂状态的有效途径。可以通过敲除某个基因研究该基因缺乏引起的生理形态作用，相比较细胞实验，体内实验更能模拟基因表达敲除状态。#br#

血管内皮细胞与肺纤维化的相关关系已经得到了很多证明。敲除血管内皮细胞中的PFKFB3 以及HK2，可降低血管内皮细胞糖酵解能力，抑制血管生成，证明能量代谢可以影响血管内皮细胞。PDHA1基因是编码丙酮酸脱氢酶1(PDHE1)重要亚基的载体基因，是连接糖酵解与三羧酸循环的枢纽，是能量调控的关键基因，该研究通过血管内皮细胞PDHA1基因敲除来研究能量代谢在血管内皮细胞中的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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