胶原纤维和基质金属蛋白酶9在大鼠正畸牙根吸收中的表达及意义

doi:10.12307/2022.902

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (27): 4288-4292.doi: 10.12307/2022.902

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胶原纤维和基质金属蛋白酶9在大鼠正畸牙根吸收中的表达及意义

刘珂1，范海霞2，王宏3，程焕芝2，耿海霞2

1潍坊医学院口腔医学院，山东省潍坊市 261053；2济宁医学院口腔医学院，山东省济宁市 272067；3济宁医学院附属医院口腔科，山东省济宁市 272067

收稿日期:2021-10-09 接受日期:2021-12-17 出版日期:2022-09-28 发布日期:2022-03-11
通讯作者: 耿海霞，教授，济宁医学院口腔医学院，山东省济宁市 272067
作者简介:刘珂，女，1996年生，山东省潍坊市人，汉族，在读硕士，主要从事牙根吸收的基础研究。
基金资助:
济宁市科技发展计划项目(2020JKNS005)，项目负责人：耿海霞；山东省医药卫生科技发展计划项目(2019WS354)，项目负责人：范海霞

Expression and significance of collagen fiber and matrix metalloproteinase-9 during orthodontic root resorption in rats

Liu Ke1, Fan Haixia2, Wang Hong3, Cheng Huanzhi2, Geng Haixia2

1School of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China; 2School of Stomatology, Jining Medical University, Jining 272067, Shandong Province, China; 3Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272067, Shandong Province, China

Received:2021-10-09 Accepted:2021-12-17 Online:2022-09-28 Published:2022-03-11
Contact: Geng Haixia, Professor, School of Stomatology, Jining Medical University, Jining 272067, Shandong Province, China
About author:Liu Ke, Master candidate, School of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China
Supported by:
Science and Technology Development Plan Project of Jining, No. 2020JKNS005 (to GHX); Medicine and Health Science and Technology Development Plan Project of Shandong Province, No. 2019WS354 (to FHX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
牙根吸收：是正畸过程中伴随牙移动而发生的一种较为常见的病理性过程，主要是指牙骨质发生缺损，甚至波及牙本质。
基质金属蛋白酶9：是基质金属蛋白酶家族中的一员，属于明胶酶，它不仅可以参与降解牙周组织中的胶原纤维，在炎症反应过程中可发挥蛋白水解酶作用。
胶原纤维：牙周组织中细胞外基质的重要组成部分，包括Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原。在牙齿移动过程中，Ⅰ型胶原可对机械力产生应变，保持牙齿的稳定性，而Ⅲ型胶原可缓解牙齿受到的牵张力。

背景：牙根吸收是正畸治疗中最常见的并发症，也是当前正畸研究中的热点，目前关于牙根吸收过程中不同时间点下牙周组织胶原纤维的重塑过程及其与基质金属蛋白酶9的关系尚不清楚。
目的：研究在正畸源性牙根吸收过程中，压力侧不同时间点牙周组织中胶原纤维重塑和基质金属蛋白酶9的表达情况。
方法：选取30只8周龄雄性Wistar大鼠，牵拉左侧上颌第一磨牙向近中移动，建立正畸牙移动模型(实验组)，右侧第一磨牙不做任何处理(对照组)。加力后1，3，5，7，14，21 d，利用组织形态学技术观察分析牙槽骨和牙根表面、牙周组织胶原纤维变化以及基质金属蛋白酶9表达情况。
结果与结论：①苏木精-伊红染色和Masson三色染色证实，与对照组相比，加力后不同时间点实验组牙槽骨和牙根表面均发生不同程度的牙根吸收，牙周组织胶原纤维发生结构重构，在7，21 d重构最显著，并且随加力时间延长单位面积内胶原纤维表达先减少后增多；②免疫组织化学染色证实，与对照组相比，实验组基质金属蛋白酶9表达增多，随加力时间延长基质金属蛋白酶9表达量呈现先增多后减少的趋势；Pearson相关分析显示，基质金属蛋白酶9与牙周组织胶原纤维的表达具有负相关性(r=-0.933，P < 0.01)；③结果说明，在大鼠正畸牙牙根吸收过程中，随加力时间延长牙周组织中胶原纤维呈现动态变化，基质金属蛋白酶9的表达水平与胶原纤维的动态变化和牙根吸收活动的变化趋势有关。

https://orcid.org/0000-0001-7463-491X (刘珂)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料;口腔生物材料;纳米材料;缓释材料;材料相容性；组织工程

关键词: 正畸牙移动, 牙根吸收, 基质金属蛋白酶9, 胶原纤维, 动物模型, 正畸力, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Root resorption is the most common complication in orthodontic treatment, and is also a hot topic in current orthodontic research. Currently, the remodeling process of collagen fibers in the inferior periodontal tissue and its relationship with matrix metalloproteinase-9 remain unclear at different time points during root resorption.
OBJECTIVE: To investigate the remodeling of collagen fibers and the expression of matrix metalloproteinase-9 in the inferior periodontal tissue at different time points on the pressure side during orthodontic root resorption.
METHODS: Thirty eight-week-old male Wistar rats were selected, and the orthodontic tooth movement model was established by pulling the left maxillary first molars towards the near middle in the experimental group, and the right side was not treated as the control group. The changes of collagen fibers and expression of matrix metalloproteinase-9 in alveolar bone, root surface and periodontal tissue at 1, 3, 5, 7, 14, and 21 days were observed and analyzed by histomorphology after force application.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hematoxylin-eosin staining and Masson's trichrome staining results confirmed that compared with the control group, the alveolar bone and tooth root surface of the experimental group had different degrees of resorption. The periodontal tissue collagen fibers underwent structural remodeling. The remodeling was most significant at 7 and 21 days. The expression of collagen fibers per unit area decreased first and then increased with the extension of the force. (2) Immunohistochemical staining confirmed that compared with the control group, the expression of matrix metalloproteinase-9 in the experimental group increased. The expression level showed a trend of first increasing and then decreasing with the extension of the application time. Pearson correlation analysis confirmed that the matrix metalloproteinase-9 expression was negatively correlated with the expression of collagen fibers in periodontal tissues (r=-0.933, P < 0.01). (3) The above results indicate that during orthodontic tooth root resorption in rats, the collagen in periodontal tissues is prolonged with time of stress. The expression level of matrix metalloproteinase-9 is related to the dynamic changes of collagen fibers and the changing trend of tooth root resorption.

Key words: orthodontic tooth movement, root resorption, matrix metalloproteinase-9, collagen fiber, animal model, orthodontic force, rat

中图分类号:

刘珂, 范海霞, 王宏, 程焕芝, 耿海霞. 胶原纤维和基质金属蛋白酶9在大鼠正畸牙根吸收中的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(27): 4288-4292.

Liu Ke, Fan Haixia, Wang Hong, Cheng Huanzhi, Geng Haixia. Expression and significance of collagen fiber and matrix metalloproteinase-9 during orthodontic root resorption in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(27): 4288-4292.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 30只大鼠全部进入结果分析。
2.2 两组第一磨牙根尖1/3区域苏木精-伊红染色观察见图2。

对照组牙根及牙槽骨表面光滑完整，牙周组织中可见成纤维细胞。实验组：加力后1 d，压力侧牙周膜间隙缩窄，牙根表面无明显的变化，牙槽骨吸收不明显，表面偶可见破骨细胞；加力后3 d，牙骨质和牙槽骨表面出现小的吸收陷窝；加力后5 d，牙周膜间隙较加力后3 d缩窄明显，牙根和牙槽骨表面吸收陷窝增多；加力后7 d，牙周膜间隙进一步缩窄，牙根表面吸收更加明显，严重者可涉及牙本质，牙槽骨和牙根吸收区域周围可见组织发生透明样变；加力后14 d，吸收陷窝未进一步增大；加力后21 d，牙周膜间隙稍增宽，牙根和牙槽骨表面吸收程度减轻或停止。
2.3 两组第一磨牙根尖1/3区域Masson三色染色观察见图3。

对照组牙周组织中胶原纤维束排列紧密有序。实验组：加力后1 d，牙周组织中胶原纤维排列整齐，牙根表面纤维束减少不明显；加力后3 d，胶原纤维排列疏松；加力后5 d，纤维呈无序排列，纤维细长；加力后7 d，胶原纤维排列方向杂乱，部分纤维束断裂，牙根表面纤维束不明显；加力后14 d，纤维紊乱程度减轻，排列疏松，可交织成网状，部分牙根表面可见胶原纤维束开始聚集；加力后21 d，纤维致密排列规则，呈放射状。统计学检验显示，与对照组相比，实验组加力后1，3，5，7，14，21 d的牙周组织胶原纤维面积减少(P < 0.05)。
2.4 两组第一磨牙根尖1/3区域免疫组织化学染色观察见图4。

基质金属蛋白酶9的阳性染色主要定位于压力侧牙周组织中的成纤维细胞、中性粒细胞、破牙/骨细胞中，呈棕黄色。基质金属蛋白酶9在对照组中呈弱表达或阴性表达，与对照组相比，实验组基质金属蛋白酶9表达逐渐增多，且在加力7 d时达到高峰，之后开始下降(P < 0.05)。
2.5 Pearson相关分析结果为了进一步验证胶原纤维和基质金属蛋白酶9之间的关系，进行了Pearson相关分析，结果显示牙周组织中胶原纤维表达与基质金属蛋白酶9的变化呈负相关(r = -0.933，P < 0.01)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析和LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2020年5月至2021年1月在济宁医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选用8周龄Wistar雄性大鼠30只[11]，体质量(200±20) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：No.110011200108697835。动物实验获得济宁医学院伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有手术操作，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂乙二胺四乙酸二纳(烟台远东精细化工有限公司)；多聚甲醛(无锡亚盛化工有限公司)；抗体稀释液ZLI-9028(北京索莱宝科技有限公司)；镍钛螺旋拉簧(北京有研医疗器械有限公司)；正畸用不锈钢结扎丝(美国 3M Unitek 公司)；苏木精-伊红染色试剂盒和Masson 三色染色试剂盒(北京索莱宝生物有限公司)；基质金属蛋白酶9兔多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，10375-2-AP)；DAB显色剂试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司)；酶标羊抗兔IgG聚合物(北京中杉金桥生物有限公司，PV-6001)。
1.3.3 主要仪器、设备组织切片机(德国Leica，RM2235)；正置显微镜 (日本Nikon)；电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；电动磁力搅拌机 (美国Thermo Scientific)；正畸测力计 (长沙天天齿科有限公司)。
1.4 实验方法

1.4.1 大鼠正畸牙移动模型建立腹腔注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉30只大鼠，腹部向上固定于鼠板上，使用快速涡轮机分别在上颌左侧第一磨牙、2个中切牙唇舌侧牙颈部、近远中轴角处分别磨出0.2 mm的浅沟，以便于将结扎丝放置于浅沟内进行固位。在制备浅沟的同时，使用生理盐水进行物理降温，以保护牙龈，避免其受损害，但应注意避免误吸而发生死亡；采用0.2 mm正畸用不锈钢结扎丝，将其从大鼠上颌左侧第一磨牙与第二磨牙间接触点下方的腭侧穿出至颊侧，包绕第一磨牙牙颈部一圈，等待结扎；将镍钛螺旋拉簧连接于包绕上颌左侧第一磨牙的结扎丝上，采用正畸测力计测出100 g牵引力值，然后采用0.2 mm正畸用不锈钢结扎丝沿着上颌两中切牙固位沟进行包绕结扎并连接于镍钛螺旋拉簧的另一端。为了防止矫治器脱落，分别在上颌两中切牙和磨牙处进行树脂加力。根据文献报道，采用100 g牵引力值[12]，作为实验组，见图1。右侧第一磨牙为对照组，不予任何处理。

1.4.2 制作石蜡切片加力后1，3，5，7，14，21 d各处死5只大鼠，完整取出整个上颌骨和周围组织，于40 g/L多聚甲醛溶液中固定48 h，置于 10%EDTA 脱钙液中持续脱钙 2 个月，每两三天更换一次脱钙液，直至注射器针头轻松刺入该组织标本，无明显阻力时表明脱钙完成。将脱钙完成的上颌骨标本用流动水冲洗2 h，将残余的脱钙液清洗干净。按照体积分数50%乙醇3 h，体积分数70%乙醇过夜，体积分数80%乙醇1 h，体积分数95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各40 min，体积分数100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各30 min进行梯度脱水；随后将标本放置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各15 min进行透明；并分别置于Ⅰ蜡、Ⅱ蜡中各1 h，进行石蜡包埋，制成4 μm厚的组织学切片，备用。实验选择近中根的根尖1/3区域作为研究对象，因为近中根是第一磨牙5个根中最大的一个，与施加的力大致在同一平面上，也是相应研究中最常被评估的对象[13-14]。
1.4.3 苏木精-伊红染色将切片置于恒温箱中烘干2 h。常规脱蜡、复水；PBS漂洗3次，每次5 min；苏木精染色3 min后流水冲洗10 min；伊红染色3 min后，流水冲洗10 min；随后置于梯度乙醇中脱水，二甲苯透明2次，每次10 min；中性树胶封固。
1.4.4 Masson染色取出切片于恒温箱中烘干2 h，常规脱蜡、复水；行Weigert染色液染色5 min，水洗3次，每次5 min；Masson 蓝化液返蓝3 min，水洗3次，每次5 min；随后再滴加丽春红品红工作液染色5 min，弱酸工作液水洗3 min；磷钼酸溶液洗1 min；苯胺蓝染色液中染色1 min，弱酸工作液水洗3 min；随后切片行梯度乙醇脱水、透明，中性树胶封固。采用Nikon光学显微镜分析200倍镜下牙周组织中胶原纤维的表达情况，以单位面积评估胶原纤维的表达程度。
1.4.5 免疫组织化学染色切片于恒温箱中烘干2 h，常规脱蜡、复水；PBS漂洗3次，每次5 min；枸橼酸修复10 min，自然冷却至室温，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加基质金属蛋白酶9兔多克隆抗体(1∶200)于4 ℃冰箱过夜；PBS漂洗 3 次，每次 5 min；滴加酶标羊抗兔IgG聚合物37 ℃孵育 1 h；DAB染色1 min；PBS漂洗 3 次，每次 5 min；苏木精复染1 min，流水冲洗后置入梯度乙醇中脱水、二甲苯透明，中性树胶封固。采用Nikon光学显微镜分析牙周组织中基质金属蛋白酶9的阳性信号强度(平均吸光度值)。
1.5 主要观察指标两组第一磨牙牙根的形态学变化、根尖牙周组织中胶原纤维的变化情况及基质金属蛋白酶9的表达与分布。
1.6 统计学分析采用 SPSS 24.0 统计软件对实验数据进行统计分析，所有实验数据均以x±s表示，数据采用单因素方差分析和组间多重比较行LSD检验。采用Pearson相关系数检验分析基质金属蛋白酶9与胶原纤维之间的相关性。当P < 0.05认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经济宁医学院生物统计学专家审核。

讨论

正畸牙齿移动是牙齿-牙槽骨复合体对外界机械力的一种生物学反应[15]，牙根吸收是伴随正畸过程中牙移动而发生的一种最为常见的病理性过程[16]。牙根吸收有着不可逆的危害性，轻度的牙根吸收可导致牙根尖变短、变钝，重度牙根吸收可导致牙齿的松动脱落，影响牙齿的稳定性和咀嚼功能。与破骨细胞介导的牙槽骨吸收类似，牙根吸收主要是由破牙细胞介导的[17]。正畸力作用下，有关破骨细胞的作用已得到广泛研究[18-19]，但在正畸牙移动模型中，与机械加力相关的胶原纤维重塑在很大程度上是未知的[20-21]。此次实验采用正畸牙移动模型，用螺旋弹簧将上颌第一磨牙与切牙连接，以促使第一磨牙近中移动，诱导根尖吸收。这种实验方法在先前啮齿动物中常被采用，并取得了一致的结果[22-23]。苏木精-伊红染色结果显示，与对照组相比，实验组压力侧牙槽骨和牙根表面可见吸收陷窝，随着时间的推移，牙槽骨和牙根表面的吸收陷窝逐渐增大，尤其加力7 d时牙根表面吸收破坏最为明显，并且在牙周组织透明样变周围以及根尖1/3区域的细胞牙骨质中可见少量空的腔隙。LIRA DOS SANTOS等[24]通过TUNEL凋亡染色和透射电镜证实，细胞牙骨质中这种空的腔隙为凋亡的牙骨质细胞。另外，在正畸力作用下牙根表面也可出现微小裂隙，进而引起牙骨质细胞凋亡，而凋亡小体通过诱导破牙细胞的形成可进一步促进牙根吸收的发生[25]。
牙周组织是一种富含胶原纤维的疏松结缔组织。以往对于牙周组织的研究多采用苏木精-伊红染色技术，而相对于苏木精-伊红染色，Masson三色染色可以更为清晰、准确地显示牙周纤维、牙槽骨形态[26] 。此次实验Masson三色染色显示，与对照组相比，实验组随着加力时间的延长压力侧牙周组织中胶原纤维逐渐受压变形、排列紊乱、纤维密度降低，尤其在加力7 d时变化最为明显。排列紊乱的胶原纤维通过阻碍牙周组织对正畸力的缓冲作用，导致局部压力增大、炎症因子释放增多，破骨细胞活化，进而引起或加重牙根吸收[27]。XU等[28]的研究证实，正畸治疗过程中牙齿移动与牙周韧带重构高度相关。结合胶原纤维的半定量分析结果可知，不同加力时间点下牙周组织中胶原纤维的表达量呈动态变化，表现为先减少后增多。
牙周组织中胶原纤维的降解和重塑与基质金属蛋白酶家族有关[8，29-30]。正畸加力前期，牙周组织中基质金属蛋白酶处于形成和储存阶段，直到加力7 d时基质金属蛋白酶表达达到高峰，此时胶原纤维的降解明显增多。随后基质金属蛋白酶的天然抑制剂基质金属蛋白酶抑制剂逐渐增多，使牙周组织中胶原纤维的降解受到抑制[31-32]。此次实验结果显示，与对照组相比，实验组中基质金属蛋白酶9的表达随加力时间延长逐渐上调，7 d时其表达量达到高峰，之后开始下降。胶原纤维作为基质金属蛋白酶9的作用底物，其表达亦呈现动态变化，加力7 d时变化最为明显。利用Pearson相关分析证实，在1，3，5，7，14，21 d 6个时间点下，牙周组织中胶原纤维的面积与基质金属蛋白酶9表达呈负相关(r=-0.933，P < 0.01)。结合苏木精-伊红和Masson三色染色结果可知，加力7 d时也是胶原纤维结构重塑和牙根表面破坏吸收最严重的时期。因此，基质金属蛋白酶9的表达水平与胶原纤维的动态变化和牙根吸收活动的变化趋势有关。
综上所述，随着正畸加力时间延长，牙根表面的吸收状态不同，随之牙周组织中胶原纤维呈现不同的表达模式，并且基质金属蛋白酶9的表达水平与牙根吸收活动的变化趋势基本一致，这将有助于进一步完善机械应力作用下正畸牙牙根吸收过程中牙周组织的生物学反应。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料;口腔生物材料;纳米材料;缓释材料;材料相容性；组织工程

胶原纤维和基质金属蛋白酶9在大鼠正畸牙根吸收中的表达及意义

Expression and significance of collagen fiber and matrix metalloproteinase-9 during orthodontic root resorption in rats

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