代谢型谷氨酸受体在丰富环境改善卒中后认知功能障碍中的作用

doi:10.12307/2022.667

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3676-3682.doi: 10.12307/2022.667

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代谢型谷氨酸受体在丰富环境改善卒中后认知功能障碍中的作用

刘佳雨1，严萍1，张瑜1，周洪雨2，王鑫2

扬州大学，1护理学院，2临床医学院，江苏省扬州市 225002

收稿日期:2021-02-08 接受日期:2021-03-16 出版日期:2022-08-18 发布日期:2022-02-15
通讯作者: 王鑫，博士，主任医师，副教授，扬州大学临床医学院，江苏省扬州市 225002
作者简介:刘佳雨，女，1992年生，江苏省盱眙县人，汉族，2021年扬州大学毕业，硕士，主要从事神经康复护理方面的研究。
基金资助:
江苏省自然科学基金资助项目(BK20171280)，项目负责人：王鑫；江苏省人兽共患病学重点实验室“护馨基金”项目(HX2003)，项目负责人：王鑫

Metabotropic glutamate receptor improves post-stroke cognitive impairment in enriched environments

Liu Jiayu1, Yan Ping1, Zhang Yu1, Zhou Hongyu2, Wang Xin2

1School of Nursing, Yangzhou University, Yangzhou 225002, Jiangsu Province, China; 2Clinical Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225002, Jiangsu Province, China

Received:2021-02-08 Accepted:2021-03-16 Online:2022-08-18 Published:2022-02-15
Contact: Wang Xin, MD, Chief physician, Associate professor, Clinical Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225002, Jiangsu Province, China
About author:Liu Jiayu, Master, School of Nursing, Yangzhou University, Yangzhou 225002, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK20171280 (to WX); “Huxin Fund” Project of Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis, No. HX2003 (to WX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
谷氨酸：是哺乳动物中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，其介导的兴奋性信号传导可以影响哺乳动物的认知功能。谷氨酸受体包括离子型受体和代谢型受体，其中离子型谷氨酸受体中N-甲基-D-天冬氨酸受体与兴奋性神经毒性和学习记忆行为密切相关；代谢型受体基于它们的序列同源性、信号转导机制和药理学分为3组，其中Ⅱ组代谢型谷氨酸受体(mGluR2和mGluR3)涉及海马功能和认知。
丰富环境：首次由加拿大科学家DONALD HEBB提出，是一个有着复杂的物理性刺激和社会刺激的综合环境，通常用作动物实验，形成丰富的动物饲养环境，促进动物学习经历、感觉输入的提升，为动物开展良好的社会交际提供机会。丰富环境对于脑可塑性和认知恢复都有一定的作用，具有无创性、低成本、低风险方面的独特优势。

背景：丰富环境干预对认知损伤有一定的改善作用，谷氨酸是与认知密切相关的兴奋性氨基酸，丰富环境对卒中后小鼠谷氨酸受体的影响和机制尚不明确。
目的：探讨代谢型谷氨酸受体在丰富环境改善卒中后认知功能障碍中的作用及其相关机制。
方法：采用光栓法制作小鼠脑卒中模型，通过Y迷宫与假手术组小鼠对比，筛选出具有认知障碍的小鼠。按随机数字表法将实验小鼠分为3组，即假手术组(假手术+标准环境组)、卒中后认知障碍+标准环境组、卒中后认知障碍+丰富环境组。各组小鼠在相应环境下分别饲养14 d后，采用Y迷宫检测小鼠额叶工作记忆能力，新物体识别实验检测小鼠海马学习记忆能力，实时定量PCR法检测小鼠额叶和海马内代谢型谷氨酸受体的基因转录水平，Western blot法检测小鼠额叶和海马内代谢型谷氨酸受体、乙酰化的组蛋白H3、环磷腺苷反应元件结合蛋白表达情况。
结果与结论：①与假手术+标准环境组小鼠比较，卒中后认知障碍+标准环境组小鼠的Y迷宫自发交替率显著下降(P < 0.001)，新物体探索率明显降低(P < 0.001)，额叶及海马的代谢型谷氨酸基因转录水平下调(P < 0.01)，额叶及海马相关蛋白表达显著降低(P < 0.01)；②卒中后认知障碍+丰富环境组小鼠自发交替率、新物体探索率、额叶及海马的谷氨酸基因转录、额叶及海马相关蛋白表达均较卒中后认知障碍+标准环境组显著改善(P < 0.05)，但与假手术+标准环境组差异仍有显著性意义(P < 0.05)；③提示丰富环境干预有助于改善卒中后小鼠记忆，其作用机制可能是通过提高环磷腺苷反应元件结合蛋白的磷酸化、改善乙酰化内稳态失衡、增加代谢型谷氨酸受体2 mRNA转录和蛋白表达，最终改善认知功能。
缩略语：卒中后认知障碍：post-stroke cognitive impairment，PSCI；代谢型谷氨酸受体：metabotropic glutamate receptors，mGluRs；环磷腺苷反应元件结合蛋白：CAMP response binding protein，CREB

https://orcid.org/0000-0001-9982-7902 (刘佳雨)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脑卒中, 认知障碍, 丰富环境, 标准环境, 谷氨酸, 代谢型谷氨酸受体

Abstract: BACKGROUND: Enriched environment intervention can improve cognitive impairment to a certain extent. Glutamate is an excitatory amino acid closely related to cognition. The effect and mechanism of enriched environment on glutamate receptor in post-stroke mice are still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of metabotropic glutamate receptor on improving post-stroke cognitive impairment and its mechanism in enriched environments.
METHODS: The mouse model of stroke was made by light embolus method, and the mice with cognitive impairment were selected through Y maze test in comparison with the sham operation group. The mice were randomly divided into three groups: sham operation+standard environment operation group (Sham+SE), post-stroke cognitive impairment+standard environment (PSCI+SE) group and post-stroke cognitive impairment+enriched environment (PSCI+EE) group. After 14 days in the corresponding environment, Y maze was used to detect the cognitive function of the frontal lobe. New object recognition experiment was used to detect the learning and memory ability of the hippocampus. Quantitative real-time PCR was used to detect the mRNA transcription level of metabotropic glutamate receptor in the frontal lobe and hippocampus, and western blot was used to detect the protein expression of metabotropic glutamate receptor, acetylated histone H3, CAMP response binding protein in the frontal lobe and hippocampus.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the Sham+SE group, the Y maze spontaneous alternation rate was significantly decreased (P < 0.001), the new object exploration rate was significantly decreased (P < 0.001), metabotropic glutamate receptor mRNA levels in the frontal lobe and hippocampus were downregulated (P < 0.01), and the expression of related proteins in the frontal lobe and hippocampus was significantly decreased in the PSCI+SE group (P < 0.01). The spontaneous alternation rate, new object exploration rate, and metabolic glutamate receptor mRNA in the frontal lobe and hippocampus were significantly decreased, and mRNA transcription, frontal lobe and hippocampus related protein expression were significantly improved in the PSCI+EE group compared with the PSCI+SE group (P < 0.05), but there was still a significant difference between PSCI+EE group and Sham+SE group (P < 0.05). To conclude, enriched environment intervention is helpful to improve the memory of mice after stroke, and its mechanism may be through increasing the phosphorylation of CAMP response binding protein, acetylation homeostasis imbalance, increasing metabotropic glutamate receptor 2 mRNA transcription and protein expression, and ultimately improving cognitive function.

Key words: stroke, cognitive impairment, enriched environment, standard environment, glutamate, metabotropic glutamate receptor

中图分类号:

刘佳雨, 严萍, 张瑜, 周洪雨, 王鑫. 代谢型谷氨酸受体在丰富环境改善卒中后认知功能障碍中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3676-3682.

Liu Jiayu, Yan Ping, Zhang Yu, Zhou Hongyu, Wang Xin. Metabotropic glutamate receptor improves post-stroke cognitive impairment in enriched environments[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(23): 3676-3682.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析选择健康成年小鼠30只，随机分为3组，每组10只，实验过程中无脱失，所有反应均计入结果分析。
2.2 丰富环境对PSCI小鼠Y迷宫成绩的影响 3组之间进入每臂总数差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4A。PSCI+标准环境组小鼠的自发交替率较假手术组明显降低，组间差异有显著性意义(P < 0.001)，提示PSCI小鼠工作记忆功能显著受损。PSCI+丰富环境组小鼠的自发交替率较PSCI +标准环境组明显改善(P < 0.01)，说明丰富环境饲养后，PSCI小鼠的工作记忆有所提升。但PSCI+丰富环境组上述指标和假手术组相比差异仍有显著性意义(P < 0.05)，可见丰富环境干预能在很大程度上提高认知功能障碍小鼠的记忆，不过仍然不能达到正常水平，见图4B。

2.3 丰富环境对PSCI小鼠新物体识别实验成绩的影响 PSCI+标准环境组小鼠的新物体探索率较假手术组明显降低，差异有显著性意义(P < 0.001)，提示PSCI小鼠学习记忆功能遭到显著损害。PSCI+丰富环境组小鼠的新物体探索率较PSCI +标准环境组明显改善(P < 0.01)，说明丰富环境饲养后，PSCI小鼠的学习记忆有所提升。但PSCI+丰富环境组和假手术组的差异仍有显著性意义(P < 0.05)，可见丰富环境干预一定程度上有助于提高PSCI小鼠的学习记忆能力，不过不能完全恢复，见图5。

2.4 丰富环境对PSCI小鼠前额叶及海马mGluR2 mRNA水平的影响与假手术+标准环境组小鼠相比，PSCI+标准环境组小鼠左侧前额叶皮质mGluR2 mRNA水平明显降低(P < 0.01)；经丰富环境饲养后，PSCI+丰富环境组小鼠mGluR2 mRNA水平较PSCI+标准环境组显著升高(P < 0.05)，但与假手术组相比差异仍有显著性意义(P < 0.05)；说明丰富环境饲养后，PSCI小鼠的mGluR2 mRNA有所提升，但还无法使其完全恢复至正常水平，见图6A。PSCI+标准环境组小鼠左侧海马mGluR2 mRNA水平明显低于假手术组(P < 0.01)，PSCI+丰富环境组小鼠的mGluR2 mRNA水平较PSCI +标准环境组明显改善(P < 0.05)，但与假手术组相比差异仍有显著性意义(P < 0.05)，见图6B。

2.5 各组小鼠mGluR2蛋白表达比较相对假手术组小鼠而言，PSCI+标准环境组小鼠卒中对侧前额叶及海马mGluR2蛋白表达显著降低(P < 0.01)，而PSCI+丰富环境组小鼠前额叶mGluR2蛋白表达相对PSCI+标准环境组显著增加(P < 0.05)，不过和假手术组相比差异仍有显著性意义(P < 0.05)，详情见图7。

2.6 各组小鼠Ac-H3蛋白表达比较与假手术组小鼠相比，PSCI+标准环境组小鼠卒中对侧前额叶及海马Ac-H3蛋白表达显著降低(P < 0.01)，而PSCI+丰富环境组小鼠前额叶Ac-H3蛋白表达较PSCI+标准环境组显著增加(P < 0.05)，不过和假手术组相比差异仍有显著性意义(P < 0.05)，详情见图8。

2.7 各组小鼠磷酸化CREB表达比较与假手术组小鼠相比，PSCI+标准环境组小鼠卒中对侧前额叶及海马磷酸化CREB表达显著降低(P < 0.01)，而PSCI+丰富环境组小鼠前额叶磷酸化CREB表达较PSCI+标准环境组显著增加(P < 0.05)，不过和假手术组相比差异仍有显著性意义(P < 0.05)，详情见图9。

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引言

脑卒中是急性脑血管病引起的局部脑功能障碍，其临床症候持续超过24 h，是一种老龄高发危险性疾病，表现出高死亡、高致残、高复发等特点[1-2]。根据全国医院统计数据显示，国内每年新发脑卒中患者约200万人，这里面56.6%的患者于3个月内呈现卒中后认知障碍(post-stroke cognitive impairment，PSCI)，它是脑卒中的常见并发症[3-5]。PSCI的主要表现包括：注意力、记忆力、感知觉、执行力等出现不同程度损害[6-8]，不仅影响患者对外界环境的感知和适应，更导致了患者自理能力下降、工作能力减退、社会功能受损、心理健康缺陷，在给患者本人带来极大痛苦的同时，也会给家庭带来沉重的负担，并且会带来一定的社会危害[9-10]。丰富环境是一种结合了声、光、色等综合干预的治疗方法，不论从空间的大小还是内置物品相对于标准环境而言都有利于增加感官刺激、运动刺激、社交、空间探索、认知等，具有无创性、低成本、低风险方面的独特优势，可以改善卒中后的认知和肢体功能障碍[11-13]。当前有关丰富环境对PSCI所带来的影响和作用机制尚未形成统一的看法。谷氨酸是广泛存在于脑内的兴奋性神经递质，可对谷氨酸神经元的结构和功能产生长期影响，且谷氨酸介导的兴奋性信号传导可以影响哺乳动物的认知功能[14-15]。谷氨酸的功能多由谷氨酸受体进行介导，以维持其稳定和精准作用，其中代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)起到重要的调控作用。mGluRs共有8个亚基，根据氨基酸序列同源性、药理学的特性、以及激动剂特异性，可分成3组：Ⅰ组mGluRs包括mGluR1和mGluR5；Ⅱ组mGluRs包括mGluR2和mGluR3；Ⅲ组mGluRs包括mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8。其中Ⅱ组mGluRs主要位于大脑皮质和海马等处，一般分布在突触前膜，调节Glu神经递质的释放，激活时可对神经细胞产生保护作用[16]。研究发现，缺血性脑卒中会导致动物的海马或前额叶皮质中mGluR2蛋白水平降低，出现相应的认知功能受损[17-18]。通过使用药物激动等手段，海马或前额叶皮质中mGluR2蛋白的表达有所提升，可改善认知功能障碍[19]，由此可见，mGluR2和认知功能有着一定的相关性。此文据此展开研究，对PSCI小鼠模型进行丰富环境干预，探索丰富环境干预对PSCI小鼠认知、代谢型谷氨酸受体所带来的影响，以便为临床防治、提高患者预后提供参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，光栓卒中小鼠造模，单因素方差分析或秩和检验，组间比较采用LSD方法进行两两比较。
1.2 时间及地点实验于2019年1月至2020年9月在扬州大学护理学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取雄性8周龄成年ICR小鼠30只，体质量25-30 g，由扬州大学实验动物中心提供，批准号：201802058S。将小鼠放在室温为21-25 ℃、湿度45%-55%、7：00-19：00光照及19：00-7：00黑暗的环境中，提供食物和水。
1.3.2 主要试剂玫瑰红(货号：B7767，美国APExBIO公司)，FastKing一步法RT-PCR试剂盒(货号：KR123，天根生化科技有限公司)，BCA试剂盒(货号：KGP902，凯基公司)，mGluR2(货号：ab150387，Abcam公司)，Ac-H3(货号ab4729，Abcam公司)，磷酸化环磷腺苷反应元件结合蛋白(CAMP response binding protein，CREB，货号ab32096，Abcam公司)，山羊抗兔IgG H二抗(货号ab205718，Abcam公司)，GAPDH(货号ab181602，Abcam公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物模型制备使用光栓方法诱导局灶性额叶卒中，模型制作方法参照文献[20]。首先20只小鼠经1%的戊巴比妥钠溶液(10 μL/g)腹腔注射麻醉，将1%的光敏剂玫瑰红按10 μL/g注进小鼠对侧腹腔内，5 min后切开头皮，以前囟点为基准原点，沿矢状缝右侧2.0 mm平行的位置做一垂直线、冠状缝后侧2.0 mm平行的位置做一水平线，两线交叉点的位置为卒中模型窗口中心点，将局部颅骨区域(面积1.5 mm×1.5 mm)用冷光源(ULP-L20-S，苏州倍特嘉光电科技有限公司)照射15 min，促使光敏剂在颅骨局部照射引起光化学反应，阻塞微小血管导致局部血栓形成[21]。手术期间，监测呼吸和体温，直到小鼠恢复意识。
假手术组10只小鼠接受了同样的手术，腹腔麻醉后用生理盐水代替玫瑰红注射其对侧腹腔，切开头皮后同样给予了15 min的光照。

1周后，所有经光栓手术且存活的小鼠用Y迷宫筛选出具有认知障碍的小鼠。合乎下述条件的小鼠即为PSCI鼠：①不存在显著的肢体偏瘫及绕圈爬行行为；②Y迷宫内其入臂总数和假手术组小鼠差异无显著性意义(P > 0.05)；③在Y迷宫中，其自发交替率与假手术组小鼠间差异有显著性意义(P < 0.05)。

1.4.2 分组及环境干预
(1)分组：模型制备成功后，将造模成功小鼠按随机数字表法分为2组(n=10)，即PSCI+标准环境组和PSCI+丰富环境组。假手术组(假手术+标准环境组)、PSCI+标准环境组的实验小鼠置于标准环境下笼养，PSCI+丰富环境组的小鼠饲养于丰富环境下笼养。
(2)环境干预：丰富环境的笼中饲养PSCI+丰富环境组的小鼠，鼠笼规格：长80 cm，宽28 cm，高60 cm，分为上下3层，每层之间设置楼梯联通。笼内除了供应水和食物外，还放置了多种多样的物品，例如楼梯、隧道、跑笼、小木屋、秋千、各种形状颜色的积木玩具等。以往他人的研究对于丰富环境的干预形式各异，涉及了运动、空间位置、气味、听觉等[22-24]，但归纳起来，丰富环境干预的主体包括感觉刺激、认知活动和运动这三部分[25]。此文围绕丰富环境的主要组成部分进行干预，利用内置物品对小鼠触觉、视觉、社交、运动等进行刺激。小鼠每天都要接受24 h的丰富环境干预，连续14 d。研究人员每天都要对笼内物品摆放位置进行更换，每隔3 d更换1次笼内整体布局，以保持新鲜感。丰富环境干预见图1。

标准环境为长30 cm，宽20 cm，高15 cm的常规鼠笼。假手术组和PSCI+标准环境组的小鼠分开饲养2周。笼内只有垫料、水、食物，小鼠可自由饮水进食，垫料定期更换。
1.4.3 Y迷宫测试运用Y臂迷宫，利用动物对新异环境探索的天性，评估小鼠额叶的工作记忆，测试在1 d内完成。该装置由3个相同的臂组成，由长30 cm、宽8 cm、高16 cm的有机玻璃板制成，各臂呈120°。正式测试前，允许小鼠标自由探索迷宫8 min，以适应环境。正式测试时，小鼠放在固定臂的中间并面向中心，当小鼠的4个爪子都进入一臂被记录为进臂1次。正确的交替方案为小鼠依次进入迷宫3个不同的臂(ABC或BCA或ACB或BAC或CAB或CBA)，最大变化次数等于进入臂总和减去2。自发交替率使用以下公式计算：自发交替率(%)=(正确交替率/最大变化数)×100%[26-27]。Y迷宫装置见图2。

1.4.4 新物体识别测试运用新异物体识别，基于动物研究新事物的自然倾向，测试评估小鼠海马学习记忆能力。在纯色方形箱(尺寸：长40 cm，宽20 cm，高45 cm)中进行测试。在行为测试的前2 d，每天将动物在箱子内放10 min，第3天进行正式测试。在箱子里放置了2个相同的物体，小鼠背朝两物放入，允许其自由探索10 min；之后将小鼠放回饲养笼，1 h后再次测试时将2个相同物体中的一个被一个新物体取代。记录小鼠与物体探索的情况，包括鼻子或嘴巴触及物体的次数和距离物体2 cm范围内探索物体的次数(前爪搭在物体上、鼻子嗅物体、舔物体都属于探索物体，爬到物体上不动不能算是对新物体的探索)。测量总探索新物体率(%)=探索新物体的次数/总物体探索次数×100%)[28-29]。新物体识别测试见图3。

1.4.5 mRNA提取和RT-PCR 行为学测试完成后即刻经1%的戊巴比妥钠溶液(10 μL/g)腹腔注射麻醉后断头取脑进行检测，总RNA是通过Trizol试剂严格根据说明书予以提取，DEPC水溶解，紫外分光光度计展开纯度、浓度检测，紫外测定A260∶A280为1.8-2.0。按FastKing一步法RT-PCR试剂盒(KR123)说明书操作步骤将所提的RNA进行一步法反转录和扩增。使用正向引物和反向引物检测mGluR2[30]，以GAPDH特异性引物为对照[31]，PCR反应条件为：42 ℃ 30 min，95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，35个循环，见表1。将反应产物采取1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，将结果通过UVP凝胶成像系统予以拍照和分析。

1.4.6 各小鼠Western blot蛋白检测行为学测试完成后即刻经1%的戊巴比妥钠溶液(10 μL/g)腹腔注射麻醉断头取脑进行检测，采用Western blot方法检测左侧(即光栓对侧)海马和前额叶内mGluR2、Ac-H3、磷酸化CREB水平。小鼠断头取脑，取左侧完整海马和前额叶组织，提取蛋白。蛋白裂解液裂解，4 ℃、14 000 r/min离心30 min，取上清。BCA试剂盒(货号：KGP902，凯基公司)检测蛋白浓度，95 ℃10 min。取蛋白样品10 μL，10%SDS-PAGE凝胶电泳，转移到硝酸纤维素膜。室温封闭1 h，加入mGluR2(1∶10 000)；Ac-H3(1∶5 000)；磷酸化CREB(1∶2 500)一抗，4 ℃隔夜孵育。第2天TBST洗涤3次，室温加入山羊抗兔IgG H二抗(1∶50 000)孵育90 min，内参用GAPDH(1∶10 000，货号ab181602，Abcam公司)作为对照，Image J测定条带相对密度。
1.5 主要观察指标分组饲养2周后即刻行为学观察：①小鼠自发交替率；②新物体探索率。
行为学测试完成后即刻分子生物学检测：①额叶及海马的mGluR2 mRNA表达水平；②额叶及海马mGluR2、Ac-H3、磷酸化CREB表达水平。
1.6 统计学分析运用SPSS 16.0软件进行数据分析，此次研究所得计量数据结果用x±s表示。3组资料若满足正态性和方差齐性，则使用单因素方差分析进行检验；若不满足，则使用秩和检验；组间比较采用LSD方法进行两两比较；P < 0.05表明差异有显著性意义。通过Graph pad Prism5绘制相应图表。

讨论

Y迷宫测验是一种广泛应用于工作记忆评估的测验[32-34]，新物体识别实验是在模仿测试人类失忆症的识别任务的基础上发展起来的，利用动物对新异物体的自发探索的天性，评价啮齿动物的海马识别记忆能力[35-37]，这些行为学测试可以较为全面地评价小鼠的记忆功能。此次研究结果显示，PSCI小鼠Y迷宫的自发交替正确率较假手术小鼠显著下降，PSCI小鼠的旧物体识别指数明显升高，新物体识别指数明显降低，提示光栓法能使实验小鼠脑部功能发生卒中损害，该卒中能使小鼠认知功能发生损害，这与以往的报道基本一致[38]。经丰富环境干预后PSCI小鼠Y迷宫的自发交替正确率有所提升，新物体识别指数明显改善，提示丰富环境可以改善PSCI小鼠的记忆，这与他人的研究结果相似[39-41]。但遗憾的是，丰富环境的干预无法使得PSCI小鼠的认知功能恢复正常。
丰富环境改善认知功能的机制还不完全明了，由于海马、额叶相关脑区与认知功能有着明确相关性，因而此次研究以海马、前额叶为重点研究脑区。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，其介导的兴奋性信号传导可以影响哺乳动物的认知功能[15]，海马和皮质都含有丰富的谷氨酸[42]，mGluR2是谷氨酸受体的一种类型，涉及海马功能和认知[43]。因此作者观察丰富环境干预对PSCI小鼠认知功能的影响时，着重观测了海马和前额叶中谷氨酸受体mGluR2的变化，结果显示PSCI小鼠卒中对侧海马和前额叶内mGluR2 mRNA和mGluR2蛋白较假手术小鼠显著降低，提示PSCI小鼠认知功能下降可能与卒中对侧谷氨酸受体表达下降有关，这与他人的研究结果相似[44-45]。此次研究结果显示，经丰富环境干预后，PSCI小鼠的mGluR2 mRNA转录和mGluR2蛋白水平均得到提升，提示丰富环境改善PSCI小鼠认知功能与谷氨酸受体蛋白的表达有关，但其具体机制是什么，仍需进一步探讨。
近期有研究报道，丰富环境改善认知的机制可能涉及组蛋白乙酰化，例如有研究发现，丰富环境能改善年龄相关记忆障碍小鼠的认知功能，是通过提高海马中组蛋白乙酰化程度来实现的[46]。组蛋白乙酰化是一种常见的表观遗传修饰形式，对学习和记忆的调节至关重要。组蛋白乙酰化稳态是通过2种酶来实现平衡的：即组蛋白乙酰转移酶及组蛋白去乙酰化酶。组蛋白乙酰转移酶有助于组蛋白乙酰化，促进基因转录，组蛋白去乙酰化酶将起到抑制基因转录作用；它们之间彼此拮抗，令细胞中乙酰化与去乙酰化达到动态化的平衡，精确调控基因转录和表达[47-48]。在前人的研究中，组蛋白去乙酰化酶被发现与Grm2启动子结合，抑制了mGlu2受体表达，而组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以逆转mGluR2蛋白的降低[17]。因此组蛋白乙酰化可对mGluR2受体表达起到一定的调控作用。此次研究发现，与假手术小鼠比较，PSCI小鼠卒中对侧海马和前额叶内Ac-H3蛋白显著降低，提示卒中对侧组蛋白乙酰化内稳态失衡；丰富环境干预后，PSCI小鼠的Ac-H3蛋白表达有所提升，同时mGluR2 mRNA及其蛋白的变化与Ac-H3蛋白变化相一致，提示丰富环境改善PSCI小鼠认知功能与组蛋白乙酰化内稳态有关，并且丰富环境改善mGluR2的表达依赖于组蛋白内稳态。
丰富环境如何提升乙酰化内稳态还不完全清晰，此次研究进一步观测了PSCI小鼠磷酸化CREB的变化，研究显示，PSCI小鼠卒中对侧海马和前额叶内磷酸化CREB较假手术组小鼠显著降低，提示PSCI卒中对侧CREB磷酸化发生改变。CREB属于亮氨酸拉链家族，通过与数百种基因序列的启动子和增强子区域内的环磷酸腺苷反应元件相结合而发挥转录调节作用[49-50]。环磷腺苷激活蛋白激酶后，诱导CREB磷酸化，磷酸化使CREB活性增强，招募CREB相应蛋白结合形成复合物，其复合物具备内源性组蛋白乙酰转移酶活性。进一步研究显示，CREB很可能是丰富环境调控组蛋白乙酰化、进而改善认知的重要桥梁。在进行丰富环境干预后，与正常小鼠相比，CREB基因敲除小鼠海马内组蛋白乙酰化提升程度和认知改善程度都相对较低[51]。由此可见，CREB通过磷酸化活化后，使乙酰化内稳态增强，这与NAQVI等[52]的观点一致。此次研究发现，经丰富环境干预后，PSCI小鼠的磷酸化CREB水平提升，并与Ac-H3蛋白变化一致，提示丰富环境改善PSCI小鼠认知功能与增强CREB磷酸化的程度有关，且组蛋白乙酰化依赖于磷酸化CREB的活性。因此，推断丰富环境对PSCI的神经保护机制可能是：丰富环境通过增强卒中对侧海马、前额叶脑区中CREB的磷酸化程度，改善了乙酰化内稳态失衡，使得mGluR2 mRNA转录和mGluR2蛋白表达增加，从而进一步改善了认知功能。但遗憾的是，丰富环境干预并不能使PSCI小鼠的认知功能恢复至完全正常水平。
综上所述，此次研究结果显示，光栓法可以导致小鼠发生认知功能障碍，这与脑卒中对侧的海马和前额叶谷氨酸受体蛋白表达下降、组蛋白乙酰化内稳态失衡、CREB磷酸化降低有关。丰富环境干预可以改善卒中后小鼠的记忆，作用机制可能是丰富环境通过增强卒中对侧海马、前额叶脑区中CREB的磷酸化程度，改善乙酰化内稳态失衡，增加mGluR2 mRNA转录和蛋白表达，最终改善其认知功能。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

代谢型谷氨酸受体在丰富环境改善卒中后认知功能障碍中的作用

Metabotropic glutamate receptor improves post-stroke cognitive impairment in enriched environments

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