丹酚酸A对缺血性脑卒中模型大鼠海马区蛋白影响的串联质谱标签蛋白组学分析

doi:10.12307/2022.672

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3714-3720.doi: 10.12307/2022.672

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

丹酚酸A对缺血性脑卒中模型大鼠海马区蛋白影响的串联质谱标签蛋白组学分析

许雯珊1，江萍利1，刘雨露1，丁妍怡1，余燕1，杨敏光1，柳维林2，3，陈立典3

1福建中医药大学康复医学院，福建省福州市 350122；2福建中医药大学康复产业研究院，福建省福州市 350122；3康复医疗技术国家地方联合工程研究中心，福建省福州市 350122

收稿日期:2021-09-13 接受日期:2021-10-22 出版日期:2022-08-18 发布日期:2022-02-22
通讯作者: 柳维林，副教授，福建中医药大学康复产业研究院，福建省福州市 350122
作者简介:许雯珊，女，1998年生，福建省政和县人，汉族，福建中医药大学在读硕士，主要从事神经康复与认知科学研究。
基金资助:
中央本级重大增减支项目“名贵中药资源可持续利用能力建设项目”(2060302)，项目负责人：柳维林

Salvianolic acid A effects on hippocampal protein expression in ischemic stroke rats: a tandem mass tag-based proteomic analysis

Xu Wenshan1, Jiang Pingli1, Liu Yulu1, Ding Yanyi1, Yu Yan1, Yang Minguang1, Liu Weilin2, 3, Chen Lidian3

1College of Rehabilitation Medicine, 2Academy of Rehabilitation Industry, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; 3National & Local Joint Engineering Research Center for Rehabilitation Medical Technology, Fuzhou 350122, Fujian Province, China

Received:2021-09-13 Accepted:2021-10-22 Online:2022-08-18 Published:2022-02-22
Contact: Liu Weilin, Associate professor, College of Rehabilitation Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; Academy of Rehabilitation Industry, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
About author:Xu Wenshan, Master candidate, College of Rehabilitation Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Supported by:
the Major Expenditure Increase/Decrease Project at the Central Level, No. 2060302 (to LWL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
串联质谱标签技术：是通过串联质谱对多肽及蛋白质进行精确定量的一种同位素标记分析技术。该技术可实现多个蛋白样品的平行检测，相比于其他检测技术其在标记效率、识别准确度及灵敏度等方面更具优势，是近年临床常用的定量蛋白组学技术之一。
丹酚酸A：是从具有活血化瘀功效的中药丹参根茎中提取而来的一种水溶性有效药用成分，具有抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡等显著药理活性，近年来广泛应用于防治缺血性疾病。

背景：丹酚酸A对缺血性脑卒中后缺血侧海马区蛋白表达的影响及其作用机制尚未明确。
目的：观察丹酚酸A对缺血性脑卒中大鼠海马区蛋白差异表达的影响，探讨其可能的神经保护机制。
方法：采用改良Longa方法制备缺血性脑卒中大鼠模型，造模后随机分为生理盐水组与丹酚酸A组(n=6)。丹酚酸A组于线栓拔出后尾静脉注射2 mg/kg丹酚酸A；生理盐水组注射等体积的生理盐水。采用改良神经功能缺损评分标准评价大鼠神经功能；T2加权成像检测脑梗死体积；旷场实验及Morris水迷宫测试观察各组大鼠的自主行为、学习记忆能力；串联质谱标签定量蛋白组学技术分析缺血性脑卒中模型大鼠缺血侧海马区蛋白的差异表达。
结果与结论：①与生理盐水组相比，丹酚酸A组大鼠改良神经功能缺损评分显著降低；②T2加权成像显示，丹酚酸A组较生理盐水组脑梗死体积明显减少；③旷场实验结果发现，丹酚酸A组大鼠自主活动及自由探索行为表现更佳；④Morris水迷宫测试结果表明，丹酚酸A组大鼠在定向航行实验中逃避潜伏期明显缩短、穿越平台次数相较于生理盐水组显著增加；⑤缺血侧海马区差异蛋白质分析结果发现，丹酚酸A组与生理盐水组之间筛选出50个上调及3个下调差异蛋白；基因本体论分析表明它们主要参与binding，catalytic activity等分子功能；京都基因和基因组百科全书信号通路分析显示，它们主要涉及Complement and coagulation cascades，Staphylococus aureus infection等信号通路；⑥结果显示，丹酚酸A可能通过调控缺血性脑卒中大鼠缺血侧海马区差异蛋白、补体及凝血级联信号通路，对缺血性脑卒中大鼠发挥神经保护作用。
缩略语：串联质谱标签：tandem mass tag，TMT；京都基因和基因组百科全书：Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG；改良神经功能缺损评分：modified Neurological Severity Scores，mNSS

https://orcid.org//0000-0003-2405-5295 (许雯珊) ；https://orcid.org//0000-0001-7212-3147 (柳维林)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 丹酚酸A, 缺血性脑卒中, 蛋白组学, 串联质谱标签技术, 神经保护, 海马, 差异蛋白, 生物信息学

Abstract: BACKGROUND: It is unclear about the effect of salvianolic acid A on hippocampal protein expression after ischemic stroke and its mechanism.
OBJECTIVE: To observe the effect of salvianolic acid A on differential protein expression in the hippocampus of ischemic stroke rats, and to explore its possible neuroprotective mechanism.
METHODS: The modified Longa method was used to prepare a rat model of ischemic stroke. After modeling, the rats were randomly divided into normal saline group (n=6) and salvianolic acid A group (n=6). Salvianolic acid A (2 mg/kg) was injected through the tail vein after the cord plug was pulled out. The normal saline group was injected with the equal volume of normal saline. Neurological function of the rats was evaluated by the modified neurological deficit score. T2-weighted imaging was used to detect infarct volume. Open field test and Morris water maze test were used to observe the autonomous behavior, learning and memory ability of rats in each group. Tandem mass tag-based quantitative proteomics technique was used to analyze differential protein expression in the ischemic hippocampus of ischemic stroke model rats.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal saline group, the modified neurological deficit score of rats was significantly decreased in the salvianolic acid A group. T2-weighted imaging results showed that the cerebral infarction volume in the salvianolic acid A group was significantly lower than that in the normal saline group. Results from the open field test showed that the rats in the salvianolic acid A group had better performance of autonomous activity and free exploration. Morris water maze test results showed that in the directional navigation experiment, the escape latency was significantly shortened and the number of platform crossings was significantly increased in the salvianolic acid A group compared with the normal saline group. Analysis of differentially expressed proteins in the ischemic hippocampus revealed that 50 differentially expressed proteins were up-regulated and 3 differentially expressed proteins were down-regulated between salvianolic acid A group and normal saline group. Gene ontology analysis showed that these differentially expressed proteins were mainly involved in several molecular functions such as binding and catalytic activity. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysis showed that these differentially expressed proteins were mainly involved in several signaling pathways, such as complement and coagulation cascades, and Staphylococus aureus infection. All these findings indicate that salvianolic acid A may play a neuroprotective role in ischemic stroke rats by regulating differentially expressed proteins and complement and coagulation cascade signaling pathways in the ischemic hippocampus.

Key words: salvianolic acid A, ischemic stroke, proteomics, tandem mass tag technology, neuroprotection, hippocampus, differentially expressed protein, bioinformatics

中图分类号:

许雯珊, 江萍利, 刘雨露, 丁妍怡, 余燕, 杨敏光, 柳维林, 陈立典. 丹酚酸A对缺血性脑卒中模型大鼠海马区蛋白影响的串联质谱标签蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3714-3720.

Xu Wenshan, Jiang Pingli, Liu Yulu, Ding Yanyi, Yu Yan, Yang Minguang, Liu Weilin, Chen Lidian. Salvianolic acid A effects on hippocampal protein expression in ischemic stroke rats: a tandem mass tag-based proteomic analysis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(23): 3714-3720.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析实验制备12只大鼠缺血性脑卒中模型，分为2组，实验过程中无脱失，均纳入结果。
2.2 mNSS评分给药后第1天，丹酚酸A组大鼠mNSS评分低于生理盐水组，差异有显著性意义(P < 0.05)；给药后第7天，两组大鼠mNSS评分均降低，丹酚酸A组评分随时间下降更为明显，且与生理盐水组相比差异有显著性意义(P < 0.01)，表明丹酚酸A对缺血性卒中模型大鼠神经功能缺损症状具有改善作用，见表1。

2.3 脑梗死体积生理盐水组与丹酚酸A组左侧T2WI灰度值均升高，即呈 “白色”区域为梗死病灶。给药后第1天，丹酚酸A组与生理盐水组脑梗死体积无明显差异，两组大鼠左侧海马区均可见明显梗死病灶；给药后第7天，丹酚酸A组较生理盐水组脑梗死体积缩小(P < 0.05)，尤以海马区梗死病灶减少显著，表明丹酚酸A对缺血性卒中大鼠脑部病变恢复具有促进作用，见图1及表2。

2.4 旷场实验结果给药后第1天，与生理盐水组相比，丹酚酸A组大鼠在旷场实验中自主运动距离、中央区域持续时间及中央区域进入次数均增加(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.05)，表明丹酚酸A对缺血性脑卒中大鼠自主活动及自由探索能力有一定的改善，见表3。

2.5 Morris水迷宫测试定向航行实验结果显示，两组大鼠逃避潜伏期随训练时间的推移而缩短；丹酚酸A组较生理盐水组第3，4天逃避潜伏期明显缩短(P < 0.05，P < 0.01)；空间探索实验结果显示，在第5天撤除平台后，丹酚酸A组大鼠穿越平台次数为(6.67±1.37)次，较生理盐水组(4.33±1.86)次明显增加(t=-2.475，P < 0.05)；表明丹酚酸A可提高缺血性脑卒中大鼠的学习记忆能力，见表4。

2.6 蛋白质鉴定及差异表达蛋白质筛选采用TMT标记定量蛋白组学的方法分析两组大鼠海马区蛋白表达的差异，结果分析得到7 257个共有蛋白。根据标准筛选差异表达蛋白表达变化的倍数超过1.5倍，同时满足P < 0.05。与生理盐水组相比，丹酚酸A组大鼠海马区的53种蛋白质水平发生显著变化，其中50个差异表达蛋白表达上调，3个差异表达蛋白表达下调，蛋白定量结果统计以火山图形式展示。对差异蛋白逐一进行检索，发现这些差异蛋白主要参与肿瘤转移、细胞周期调控、氧化应激、炎症反应、免疫调控、血流调节、血管生成等，其中具有神经保护作用的蛋白包含热休克蛋白B1(Heat shock 27 kD)、波形蛋白、膜联蛋白A1等，见图2及表5。

2.7 差异蛋白基因本体论分析基因本体论分析用于评估差异表达蛋白的生物过程、细胞组成和分子功能。结果表明，丹酚酸A组与生理盐水组大鼠海马区差异蛋白主要参与single-organism process，cellular process及biological regulation等生物过程；包含cell，organelle及membrane等细胞组分；具有binding，catalytic activity及molecular function regulator等分子功能，见图3。

2.8 差异蛋白KEGG通路富集分析通过对丹酚酸A组及生理盐水组大鼠海马区差异表达蛋白富集分析，共富集到11条KEGG通路。其中富集度较高的信号通路为Complement and coagulation cascades，Staphylococus aureus infection，Antigen processing and presentation等，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，数据满足正态分布，组间比较采用两独立样本t检验；数据不符合正态分布，则选用非参数检验。
1.2 时间及地点实验于2020年7-12月在福建中医药大学康复产业研究院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选用SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠12只，8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，在福建中医药大学实验动物中心分笼并进行适应性喂养1周至(280±30) g，许可证号：SYXK(闽)2020-0003，随后对大鼠编号并称质量。实验过程均严格按照国际动物保护和使用指南的规定操作。
1.3.2 实验药物、试剂与仪器丹酚酸A(纯度>99%，上海陶术生物科技有限公司)；胰酶(Promega公司)；乙腈(Fisher Chemical公司)；三氟乙酸(Sigma-Aldrich公司)；碘乙酰胺(Sigma公司)；β-巯基乙醇(Sigma公司)；尿素(Sigma公司)；四甲基乙二胺(Sigma公司)；BCA试剂盒(碧云天公司)；三羟甲基氨基甲烷(生工生物工程上海股份有限公司)；TMT标记试剂盒(Thermo公司)；线栓(瑞沃德生命科技有限公司)；小动物MRI成像仪9.4T(Bruker公司)；Morris水迷宫(上海欣软科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 造模、分组及给药 12只健康雄性SD大鼠参考改良Longa方法制备缺血性脑卒中模型[7]，利用随机数字表法将造模后大鼠分为生理盐水组和丹酚酸A组。

各组大鼠术前12 h开始禁食，予自由饮水。2%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位固定于小动物手术台上，沿正中切开颈部皮肤，剥离肌肉和筋膜并暴露左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉及深部分支翼腭动脉。依次结扎颈总动脉近心端、颈外动脉远心端，并于颈部总动脉分叉处即颈内动脉近心端穿线预留结扎，用微动脉夹夹闭翼腭动脉及颈内动脉远端。距颈总动脉结扎点上方近侧端处用显微剪刀剪一“V”型切口，并将已备好的线栓用显微镊沿此口插入颈内动脉，直至线栓到达大脑中动脉分支处，完全阻断大脑中动脉血供造成局灶性脑缺血，清创后颈部切口常规缝合。90 min后行再灌注，缓慢回抽部分线栓至颈总动脉分叉处并剪断线栓暴露在创口外的部分。术后根据Longa评分判断造模是否成功，1-3分表明造模成功可纳入实验，其余予以剔除。于线栓拔出后，丹酚酸A组尾静脉注射2 mg/kg丹酚酸A，生理盐水组则尾静脉注射等体积生理盐水。

1.4.2 神经行为学评价所有大鼠给药后第1，7天分别评价改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores，mNSS)[8]。mNSS主要包括大鼠运动、感觉、平衡及反射4个方面的评价，得分越高表明损伤越严重，正常为0分，得分最重为18分。2名研究人员分别单独进行所有操作，取平均值。
1.4.3 脑梗死体积测定给药后第1，7天分别使用9.4T小动物核MRI分析系统对实验大鼠进行 T2加权成像(T2 weighted image，T2WI)扫描，观察大鼠左侧大脑梗死体积。扫描参数：TR=2 500 ms，TE=33 ms，FoV=32×32 mm，Averages=4，Matrix=256×256，Slices=21，Slice Thickness=1 mm，Time=5 min 20 s。脑梗死区域的计算用MATLAB软件进行。
1.4.4 旷场实验给药后第1天采用旷场实验检测各组大鼠自主运动能力、自由探索能力[9]。将旷场箱底部等分为25方格，取中间9格为中央区域。将大鼠放入旷场自由探索5 min，记录大鼠运动的总距离、中央区域停留时间及进入中央次数。每只大鼠测试1次，测试结束后用体积分数75%的乙醇擦拭旷场箱除味。
1.4.5 Morris水迷宫测试给药后第2天采用Morris水迷宫检测各组大鼠的空间学习记忆能力[10]。将直径为120 cm，水深30 cm的圆形水池分为4个象限，平台放置于第三象限中心，实验期间将大鼠放置在水池中，令其寻找平台。该测试包括定向航行实验和空间探索实验两部分。
定向航行实验：为期4 d，大鼠分别从4个象限面朝池壁放入水中，测试其找到平台所需时间(逃避潜伏期)，限时90 min，检测空间记忆学习能力。
空间探索实验：为期1 d，移除放置在第3象限的平台，将大鼠从第1象限放入水中，记录90 s内大鼠穿越平台所在区域次数，检测空间记忆提取能力。
1.4.6 蛋白制备行为学测试结束后，各组大鼠使用2%的戊巴比妥钠麻醉后取材，取海马区脑组织用于提取蛋白。丹酚酸A组与生理盐水组各取3个蛋白样品用于检测。称取适量组织样品加液氮于研钵中充分研磨。加入裂解缓冲液(8 mol/L尿素，1%蛋白酶抑制剂)，超声裂解。离心取上清液转移至新的离心管，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
1.4.7 TMT标记及肽段分级取适量蛋白质进行胰酶酶解，酶解的肽段除盐后真空冷冻干燥。溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段。简单操作如下：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2 h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent 300Extend C18(5 μm粒径，4.6 mm 内径，250 mm长)。操作如下：肽段分级梯度为8%-32%乙腈、pH=9，60 min时间分离60个组分，随后肽段合并为18个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。
1.4.8 生物信息学分析方法通过多次全蛋白定量重复实验，分别得到了每个样本在多次重复中的定量值进行差异蛋白筛选。首先计算比较组中两个样本间蛋白的差异表达量，而后计算蛋白在两个样本中的差异表达显著性P值。差异蛋白筛选条件为：倍数变化>1.5倍且P < 0.05，符合条件进行后续基因本体论、KEGG通路分析。
基因本体论分析对蛋白质组学层面的注释来源于UniProt-GOA数据库(http://www.ebi.ac.uk/GOA/) ，将蛋白ID与GO ID进行匹配，并依据GO ID从UniProt-GOA数据库中调取相应的信息，之后按照细胞成分、分子功能或生理进程对此蛋白进行分类。
KEGG信号通路分析使用KEGG通路数据库对蛋白通路进行注释：首先使用KEGG在线服务工具KAAS(http://www.genome.jp/kaas-bin/kaas_main)对提交的蛋白进行注释，之后通过KEGG mapper (http://www.kegg.jp/kegg/mapper.html)将注释过的蛋白匹配入数据库中相应的通路中。
1.5 主要观察指标两组缺血性脑卒中大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积、自主行为及认知功能；两组大鼠缺血侧海马区差异表达蛋白，及其基因本体论功能富集分析、KEGG信号通路分析。
1.6 统计学分析及生物信息学分析此次研究应用SPSS 25.0统计软件对所有实验数据进行统计学处理。计量资料以x±s表示。mNSS评分、脑梗死体积、旷场实验、Morris水迷宫测试等数据满足正态分布，组间比较采用两独立样本t检验；数据不符合正态分布，则选用非参数检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。差异蛋白筛选条件为：倍数变化>1.5倍且P < 0.05，符合条件进行后续基因本体论、KEGG通路分析和展示。

讨论

缺血性脑卒中是最常见的脑血管疾病之一，约占脑卒中总数的80%[11]。据报道，脑卒中后约2/3患者伴有行为及认知功能障碍[12-13]，严重影响患者的日常生活[14]。海马是大脑重要组成部分之一，对脑内缺血极为敏感。已有多项研究表明，通过调节海马区不同蛋白水平可提高缺血性脑卒中大鼠的行为及认知功能[15-18]。缺血性脑卒中大鼠海马区梗死病灶于此次实验中具有明显改变，由此表明，海马损伤的改善是治疗缺血性脑卒中的关键。
丹参为传统活血化瘀要药，在临床治疗缺血性疾病中应用广泛[19]。丹酚酸A是丹参的水溶性有效药用成分之一，具有抗炎症反应、抗氧化应激等神经保护作用[5]。多项研究表明，丹酚酸A可对缺血性脑卒中大鼠产生脑保护作用，并在体内实验中常表现为对其脑梗死体积、神经功能缺损症状及认知行为表现的影响。WANG等[20]对缺血性脑卒中大鼠尾静脉注射丹酚酸A后可有效减小其脑梗死体积，并伴有海马CA1区可溶性环氧化物水解酶表达下调。CHIEN等[21]实验表明，丹酚酸A治疗后缺血性脑卒中大鼠神经功能损伤明显减轻，可显著上调海马齿状回微管相关蛋白及B淋巴细胞瘤2等蛋白表达。上述研究表明，丹酚酸A可有效减少缺血性脑卒中大鼠脑梗死体积并显著改善其神经功能缺损症状，与此次实验研究结果一致。此外，CHEN等[8]发现，丹酚酸A可有效提高缺血性脑卒中大鼠的学习记忆能力，发挥神经保护作用。而此次研究采用旷场实验、Morris水迷宫实验检测大鼠自主行为及学习记忆能力。研究发现，与生理盐水组相比，丹酚酸A组大鼠在旷场实验中自主活动及自由探索行为表现更佳；在Morris水迷宫测试中丹酚酸A组大鼠在定向航行实验中逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数相较于生理盐水组显著增加，表明丹酚酸A对缺血性脑卒中大鼠自主行为、学习记忆障碍的疗效显著。海马是负责学习记忆等认知行为能力的关键脑区，上述多项研究发现，丹酚酸A影响缺血性脑卒中大鼠认知行为表现的同时可观察到其海马区蛋白表达的变化，由此提示丹酚酸A对缺血性脑卒中大鼠发挥神经保护作用或与其对海马区蛋白的差异性调控有关，但其机制尚未明确，仍需进一步研究加以阐释。因而此次研究采用TMT标记定量蛋白组学技术研究缺血性脑卒中大鼠海马区的蛋白质组学变化，并结合缺血性脑卒中后病理生理特点及基因本体论分析、KEGG信号通路富集分析结果，筛选出具有神经保护作用的差异表达蛋白并进行重要通路分析。
从差异表达蛋白基因本体论分析来看，共筛选出若干个具有神经保护作用的差异蛋白，上调显著的3个关键差异蛋白为热休克蛋白B1、波形蛋白、膜联蛋白A1。作为热休克蛋白家族成员之一，热休克蛋白B1参与维持细胞蛋白质稳态[22]。缺血性脑卒中后梗死区脑细胞将做出应激反应，热休克蛋白B1上调则可激活机体内源性神经保护能力[23]。缺血性脑卒中小鼠经磷酸化重组热休克蛋白B1治疗后，通过抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性抑制神经元凋亡，并观察到小鼠神经功能改善[24]。TÓTH等[25]认为热休克蛋白B1上调有利于减少海马区神经细胞凋亡、增强神经元突触可塑性，进而减缓认知能力下降。波形蛋白是星形胶质细胞中间丝蛋白质之一，是反应性星形胶质增生的标志[26]。早年研究认为，波形蛋白在脑缺血损伤反应性星形胶质增生后随胶质瘢痕形成重新表达，对脑缺血损伤具有神经保护作用[27]。TAO等[28]通过激活缺血性脑卒中大鼠梗死区波形蛋白阳性细胞，促进反应性星形胶质增生进而增强梗死区神经发生并上调了脑源性神经营养因子局部表达，发挥神经保护作用。WILHELMSSON等[29]发现波形蛋白上调可促进神经可塑性，增加脑损伤后海马神经发生。膜联蛋白A1是一种天然内源性抗炎蛋白。缺血性脑卒中后大量炎症递质堆积致脑组织损伤，膜联蛋白A1可通过下调炎症递质并抑制神经元凋亡对缺血性脑卒中后受损大脑发挥神经保护作用[30]。RIES等[31]研究发现膜联蛋白A1可有效促进受损脑血管修复，同时增加脑损伤小鼠海马区突触密度具有脑保护效应。经过验证，此次研究发现热休克蛋白B1、波形蛋白、膜联蛋白A1在丹酚酸A组大鼠海马区中的表达水平相较生理盐水组均上调，由此推测丹酚酸A可能上调热休克蛋白B1、波形蛋白、膜联蛋白A1等蛋白表达水平发挥抗炎症反应、抑制细胞凋亡及促进神经发生等神经保护作用。
KEGG信号通路富集分析来看，主要富集于Complement and coagulation cascades，即补体及凝血级联信号通路。机体的补体及凝血级联由凝血、抗凝、纤溶及补体激活4个过程组成，属于内源性代谢级联，对维持机体正常血流具有重要作用[32]。相关研究表明具有抗缺血效用的药物成分可通过调控该通路对缺血性脑卒中发挥神经保护作用。WANG等[33]研究表明蒺藜果总皂苷通过调节补体及凝血级联信号通路中F2蛋白表达，改善缺血性脑卒中大鼠的神经功能。NIU等[34]从紫檀中提取活性成分天麻治疗缺血性脑卒中大鼠后，通过调控补体及凝血级联通路信号分子观察到大鼠脑梗死体积减少，神经功能缺损改善。丹酚酸A为丹参活性成分，亦具有抗脑缺血效用[35-40]，在此次研究中KEGG信号通路结果显示补体及凝血级联信号通路显著富集，提示丹酚酸A可能通过调控此通路减少缺血性脑卒中大鼠梗死体积，促进神经功能恢复发挥脑保护作用。
此次研究发现，丹酚酸A可有效改善缺血性脑卒中大鼠的神经功能缺损症状，减少缺血性脑卒中大鼠脑梗死体积，改善其神经功能缺损并提高自主行为及学习记忆能力。随后，此次研究基于TMT定量蛋白组学进一步分析丹酚酸A对缺血性脑卒中大鼠发挥神经保护作用的机制，结果显示丹酚酸A可能通过调控热休克蛋白B1、波形蛋白及膜联蛋白A1等差异蛋白、补体及凝血级联信号通路对缺血性脑卒中大鼠发挥神经保护作用。
此次研究目前仅对缺血性脑卒中大鼠缺血侧海马区差异蛋白进行了生物信息学分析，尚未进行相关机制验证。下一步研究中，首先会对筛选出的差异蛋白进行RT-qPCR和Western Blot实验，验证筛选出的差异蛋白与丹酚酸A之间是否存在调控关系。此外，将对KEGG信号通路富集分析筛选出的重要信号通路关键蛋白进行检测，随后进行相关抑制剂或激动剂注射，进一步探讨丹酚酸A对缺血性脑卒中大鼠发挥神经保护作用的机制。此次研究将为临床应用丹酚酸A治疗缺血性脑卒中提供实验依据，为中医药防治缺血性脑卒中提供新的研究思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

丹酚酸A对缺血性脑卒中模型大鼠海马区蛋白影响的串联质谱标签蛋白组学分析

Salvianolic acid A effects on hippocampal protein expression in ischemic stroke rats: a tandem mass tag-based proteomic analysis

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