树鼩成纤维样滑膜细胞分离鉴定及TLR8通路相关分子检测方法的建立

doi:10.12307/2022.673

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3721-3727.doi: 10.12307/2022.673

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

树鼩成纤维样滑膜细胞分离鉴定及TLR8通路相关分子检测方法的建立

周凡琦1，2，3，李宝莹1，2，王凯涛1，谭荃荃1，运晨霞1，2，冷静1，2

1广西中医药大学基础医学院，广西壮族自治区南宁市 530200；2广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530200；3柳州人民医院检验科，广西壮族自治区柳州市 545000

收稿日期:2021-07-14 接受日期:2021-08-13 出版日期:2022-08-18 发布日期:2022-02-23
通讯作者: 运晨霞，教授，广西中医药大学基础医学院，广西壮族自治区南宁市 530200；广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530200 冷静，教授，广西中医药大学基础医学院，广西壮族自治区南宁市 530200；广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530200
作者简介:周凡琦，女，1996年生，贵州省纳雍县人，汉族，硕士，主要从事天然免疫识别受体及机制研究。李宝莹，女，1993年生，广东省江门市人，汉族，硕士，主要从事中医药防治疾病的现代科学基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金地区项目(31660632)，项目负责人：运晨霞；广西科技厅自然基金面上项目(2016GXNSFAA380179)，项目负责人：运晨霞；广西中医药大学硕士研究生创新项目(YCSZ2020018)，项目负责人：李宝莹

Isolation and identification of fibroblast-like synoviocytes from tree shrews and establishment of TLR8 pathway related molecular detection methods

Zhou Fanqi1, 2, 3, Li Baoying1, 2, Wang Kaitao1, Tan Quanquan1, Yun Chenxia1, 2, Leng Jing1, 2

1School of Basic Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating High-Incidence Infectious Diseases with Integrative Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Laboratory of Liuzhou People’s Hospital, Liuzhou 545000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2021-07-14 Accepted:2021-08-13 Online:2022-08-18 Published:2022-02-23
Contact: Yun Chenxia, Professor, School of Basic Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating High-Incidence Infectious Diseases with Integrative Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Leng Jing, Professor, School of Basic Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating High-Incidence Infectious Diseases with Integrative Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhou Fanqi, Master, School of Basic Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating High-Incidence Infectious Diseases with Integrative Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Laboratory of Liuzhou People’s Hospital, Liuzhou 545000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Li Baoying, Master, School of Basic Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating High-Incidence Infectious Diseases with Integrative Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Zhou Fanqi and Li Baoying contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (Regional Program), No. 31660632 (to YCX); Guangxi Natural Science Fund Project, No. 2016GXNSFAA380179 (to YCX); Master’s Graduate Student Innovation Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. YCSZ2020018 (to LBY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
成纤维样滑膜细胞：是关节滑膜层的最大细胞群体，在维持关节正常生理功能和内环境稳态方面发挥重要作用。在类风湿关节炎病变过程中，炎症性关节炎的一个最明显特征是滑膜衬里层成纤维样滑膜细胞的大量增殖，它能降解细胞外基质并向间充质细胞和浸润免疫细胞提供趋化和活化信号。
TLR8信号通路：TLR8是Toll样受体家族中重要的一员，主要位于细胞的内涵体中，通过识别病毒的单链RNA，其信号通路被激活，通过核因子κB的活化引发炎症反应。TLR8的过度激活与自身免疫疾病的发生有着密切联系。

背景：成纤维样滑膜细胞在类风湿关节炎病变过程中发挥着重要的作用，当炎症性关节炎发生时滑膜衬里层成纤维样滑膜细胞会大量增殖，释放炎症因子能引起关节炎症和软骨的损伤。
目的：建立树鼩膝关节成纤维样滑膜细胞体外分离、培养纯化及鉴定的方法，并探讨其生物学特性；建立树鼩成纤维样滑膜细胞TLR8通路相关分子的检测方法，初探TLR8通路在细胞中的活化情况。
方法：利用组织块贴壁法和连续传代法分离、纯化树鼩成纤维样滑膜细胞，采用CCK-8法检测细胞增殖能力，苏木精-伊红染色观察细胞形态，免疫细胞化学染色法检测成纤维样滑膜细胞的标志性蛋白(波形蛋白)的表达。经人TLR8配体R848刺激前后，采用Western blot方法检测树鼩成纤维样滑膜细胞与人成纤维样滑膜细胞中TLR8及其信号通路蛋白的表达，采用RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测树鼩成纤维样滑膜细胞中TLR8通路及其下游基因mRNA的表达。
结果与结论：①倒置显微镜下可见，经过3代的传代培养后，树鼩成纤维样滑膜细胞多为梭形，大小相近，纯度高，在体外生长增殖状况良好；苏木精-伊红染色显示细胞形态多呈梭形，大小相近；免疫细胞化学染色显示，成纤维样滑膜细胞胞浆波形蛋白表达阳性；CCK-8实验结果显示，树鼩成纤维样滑膜细胞生长曲线为“S”型；②Western blot检测显示，经R848刺激48 h后，树鼩成纤维样滑膜细胞中的核因子κB蛋白表达升高(P < 0.05)，p-P38蛋白表达降低(P < 0.05)，TLR8、MyD88、P38、p-Erk1/2、和RANKL蛋白表达无明显变化(P > 0.05)；人成纤维样滑膜细胞中的p-P38蛋白表达降低(P < 0.05)，TLR7、TLR8、MyD88、核因子kB、P38、p-Erk1/2和RANKL蛋白表达无明显变化(P > 0.05)；③RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测显示，经R848刺激48 h后，树鼩成纤维样滑膜细胞中肿瘤坏死因子ɑ、白细胞介素6、干扰素β、TLR9-2、TLR9-1、TLR8-2、TLR8-1、TLR7-2、TLR7-1 mRNA表达无明显变化(P > 0.05)；④结果表明，采用组织贴壁法可分离树鼩成纤维样滑膜细胞，利用人来源抗体可建立树鼩成纤维样滑膜细胞TLR8通路相关分子检测方法。

https://orcid.org/0000-0002-7429-3155 (周凡琦)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 树鼩, 类风湿关节炎, 组织贴壁法, 成纤维样滑膜细胞, 分离培养, 细胞鉴定, TLR8信号通路

Abstract: BACKGROUND: Fibroblast-like synoviocytes play an important role in the pathological process of rheumatoid arthritis. When inflammatory arthritis occurs, fibroblast-like synoviocytes in the synovial lining layer will proliferate in large quantities, and the release of inflammatory factors during this period can cause joint inflammation and cartilage damage.
OBJECTIVE: To establish methods for isolation, culture, purification, and identification of tree shrew knee joint fibroblast-like synoviocytes in vitro, and explore their biological characteristics; to establish methods for detection of TLR8 pathway related molecules in fibroblast-like synoviocytes from tree shrews, and preliminarily explore the activation of TLR8 pathway in the cells.
METHODS: Fibroblast-like synoviocytes from tree shrews were isolated and purified using tissue block method and continuous passage method. Cell proliferation was detected using cell counting kit-8. Cell morphology was observed using hematoxylin-eosin staining. Immunocytochemical staining was used to detect the expression of vimentin in synoviocytes. Before and after stimulation with human TLR8 ligand R848, the expression of TLR8 and its signaling pathway proteins in tree shrew fibroblast-like synoviocytes and human fibroblast-like synoviocytes was detected using western blot assay, while the expression of TLR8 pathway and its downstream mRNAs in tree shrew fibroblast-like synoviocytes were detected using RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Under an inverted microscope, tree shrew fibroblast-like synoviocytes after 3 generations of subculture were mostly spindle-shaped cells with similar size, high purity, good growth and proliferation in vitro. Hematoxylin-eosin staining revealed that the cells were mostly spindle-shaped, similar in size. Immunocytochemical staining results showed that Vimentin positively expressed in fibroblast-like synoviocytes. Cell counting kit-8 testing results showed an “S”-shaped growth curve of tree shrew fibroblast-like synoviocytes. Western blot results revealed that at 48 hours after R848 stimulation, the expression level of nuclear factor-κB protein significantly increased (P < 0.05), the expression level of p-P38 protein decreased (P < 0.05), and there was no change in the expression of TLR8, MyD88, P38, p-Erk1/2, and RANKL proteins (in tree shrew fibroblast-like synoviocytes (P > 0.05). After R848 stimulation, the expression of p-P38 in human fibroblast-like synoviocytes also significantly decreased, and no changes were found in the expression of TLR8, MyD88, P38, p-Erk1/2, and RANKL proteins (P > 0.05). Findings from RT-PCR and agarose gel electrophoresis detection showed that the mRNA expression of tumor necrosis factor ɑ, interleukin 6, interferon β, TLR9-2, TLR9-1, TLR8-2, TLR8-1, TLR7-2, and TLR7-1 mRNA expression had no significant change after 48 hours of stimulation with R848 (P > 0.05). To conclude, the tissue block adherence method can be used to isolate tree shrew fibroblast-like synoviocytes, and TLR8 pathway-related molecular detection method for tree shrew fibroblast-like synoviocytes is successfully established.

Key words: tree shrew, rheumatoid arthritis, tissue block adherence method, fibroblasts-like synoviocyte, isolation and culture, cell identification, TLR8 signaling pathway

中图分类号:

周凡琦, 李宝莹, 王凯涛, 谭荃荃, 运晨霞, 冷静. 树鼩成纤维样滑膜细胞分离鉴定及TLR8通路相关分子检测方法的建立[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3721-3727.

Zhou Fanqi, Li Baoying, Wang Kaitao, Tan Quanquan, Yun Chenxia, Leng Jing. Isolation and identification of fibroblast-like synoviocytes from tree shrews and establishment of TLR8 pathway related molecular detection methods[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(23): 3721-3727.

图/表（结果） 8

2.1 树鼩关节滑膜组织细胞的分离及培养纯化分离得到的树鼩滑膜组织，经组织贴壁法于第4天起从组织块边缘游出，围绕组织块，细胞呈网状分布，随着细胞数量增多，最靠近组织块的细胞排列逐渐紊乱，镜下观察多为不规则多边形或圆形；细胞传代至第3代后，圆形形态细胞减少，多伸展为梭形、大小一致的细胞，初步鉴定为成纤维样滑膜细胞，见图2。

2.2 树鼩成纤维样滑膜细胞形态学观察苏木精-伊红染色显示，树鼩成纤维样滑膜细胞形态较规则，多呈梭形，其细胞核为卵圆形位于细胞中央并呈紫蓝色，而胞浆为淡粉色，见图3。

2.3 树鼩成纤维样滑膜细胞鉴定免疫细胞化学染色显示，树鼩成纤维样滑膜细胞的胞浆内分布着棕色的颗粒，即波形蛋白表达阳性，见图4。根据细胞的来源、形态特征和波形蛋白表达阳性的检测结果可判断出分离培养的细胞为成纤维样滑膜细胞。

2.4 树鼩成纤维样滑膜细胞的增殖活力 CCK-8实验检测结果显示，树鼩成纤维样滑膜细胞在传代后的1-3 d增殖速度较缓慢，生长曲线趋势平缓上升，在第4天开始成纤维样滑膜细胞的增长速度加快，在第7天进入平台期，成纤维样滑膜细胞的增殖速度趋于稳定，最后进入衰退，见图5。

2.5 可与树鼩成纤维样滑膜细胞TLR8蛋白及其信号通路蛋白结合的抗体通过Western Blot选用Invitrogen和Abcam中可以检测人源蛋白的抗体进行检测，并将提取的树鼩成纤维样滑膜蛋白与人成纤维样滑膜细胞蛋白进行了对照，筛选出了可以结合树鼩TLR7、TLR8、MyD88、核因子kB、P38、p-P38、p-Erk1/2、RANKL以及内参Tubulin的抗体，树鼩与人对应蛋白的检测结果一致，见图6，表明树鼩TLR8与人TLR8序列同源性很高，抗人TLR8 抗体能用于树鼩 TLR8 检测。此次实验也证实了人TLR8配体R848激活上调TLR8蛋白的表达，并且激活相应的信号通路蛋白。

实验结果显示：①树鼩成纤维样滑膜细胞：相较于空白对照组，R848刺激组核因子κB蛋白表达水平升高(P < 0.05)，p-P38蛋白表达水平降低(P < 0.05)，TLR8、MyD88、P38、p-Erk1/2和RANKL蛋白表达无明显变化(P > 0.05)，见表2；②人成纤维样滑膜细胞：相较于空白对照组，R848刺激组p-P38蛋白表达水平降低(P < 0.05)，TLR7、TLR8、MyD88、核因子kB、P38、p-Erk1/2和RANKL蛋白表达无明显变化(P > 0.05)，见表2。

2.6 树鼩成纤维样滑膜细胞中TLR8通路相关分子mRNA表达水平见图7。

经文献检索以及利用PubMed上发布的树鼩基因序列进行引物设计，通过RT-PCR检测了TLR8相关信号通路蛋白TLR7、TLR8、TLR9，及其信号通路下游炎症因子干扰素β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α以及内参GAPDH、β-actin mRNA的表达，空白对照组中，TLR7-1、TLR8-1，TLR8-2、TLR9-2、TLR9-1、干扰素β、白细胞介素6、GAPDH、β-actin条带清晰；R848刺激组中，TLR7-1、TLR8-1，TLR8-2、TLR9-2、TLR9-1、干扰素β、白细胞介素6、GAPDH、β-actin条带明显；但设计的TLR7-2、肿瘤坏死因子α引物结果不清晰，其他实验结果表明设计的引物合适，可用于后续研究中。与空白对照组比较，R848刺激组树鼩成纤维样滑膜细胞的TLR8通路相关mRNA表达水平无显著变化(P > 0.05)，见表3，后续还需继续探讨。

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引言

类风湿关节炎是一种以关节滑膜炎为主的慢性自身免疫性疾病[1]。成纤维样滑膜细胞是滑膜层最大的细胞群体，正常情况下在维持关节生理功能和内环境稳态方面发挥重要作用。在类风湿关节炎病变过程中，成纤维样滑膜细胞大量增殖[2] ，降解细胞外基质且向间充质细胞和浸润免疫细胞提供趋化和活化信号[3]。研究表明，体外培养的炎症性成纤维样滑膜细胞表现出独特的特性，即使脱离炎症环境仍可继续活化、异常增殖，并释放许多细胞因子和生长因子，这些因子能刺激或(在有些情况下)减弱炎症反应[4]。因此，体外分离培养成纤维样滑膜细胞是研究关节炎疾病的重要手段。目前，成纤维样滑膜细胞最理想的来源是类风湿关节炎患者的关节滑膜组织，大多采自关节置换手术的类风湿关节炎晚期患者，但是参与此外科治疗的患者较少，导致类风湿关节炎患者的滑膜组织较难获取。当前，体外实验研究多使用关节炎大鼠模型来源的成纤维样滑膜细胞[5]，但是啮齿类动物模型与人类疾病模型相比存在较大的种属差异[6-7]，而树鼩在神经系统、免疫系统及代谢类型信号通路方面与灵长类拥有高度的同源性[8]，因此以树鼩作为动物模型可以填补从啮齿类动物模型到犬再到高等灵长类研究之间的部分空缺[9]，但树鼩基础生物学数据和专有检测研究进展缓慢[10]，这种现象阻碍了树鼩作为人类疾病动物模型的研究进程。
相关研究表明，许多Toll样受体可以诱导或维持关节炎的症状，人类TLR8转基因小鼠嵌合体会发展成自发性关节炎，并且对胶原诱导性关节炎表现出更高的敏感性。有研究表明，TLR8在人类类风湿关节炎患者的滑膜组织和外周血细胞中上调，刺激肿瘤坏死因子α的产生[11]。综上研究表明，抑制TLR8通路可能为控制类风湿关节炎提供新的研究方向。
组织块贴壁法是原代细胞分离培养的主要方法[12]，也是成纤维样滑膜细胞常见的体外分离培养方法[13-14]。因此，此次实验将分离培养树鼩膝关节的成纤维样滑膜细胞，以简单易行的方法获得大量纯化和体外稳定生长的成纤维样滑膜细胞来满足类风湿关节炎机制研究，通过对树鼩成纤维样滑膜细胞上TLR8及其信号通路相关分子检测方法的建立，为进一步研究利用树鼩研究类风湿关节炎提供良好的实验基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞体外观察实验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年10月至2020年3月在广西中医药大学完成。
1.3 材料人成纤维样滑膜细胞由南方医科大学中医药学院袁立霞教授惠赠。
1.3.1 实验动物 1周岁滇西亚种树鼩10只，雄性，体质量(110±10) g，购于昆明医科大学，合格证号：SCXK(滇)K2020-0004，饲养于广西中医药大学动物房，合格证号：SYXK(桂)2019-0001。饲养期间，树鼩饲喂北京科澳协力饲料，合格证号：SCXK(京)2020-0010。饲养环境要求：无菌饲养，昼夜各半照明，温度控制在25-27 ℃，湿度恒定。所有操作均严格按照广西中医药大学实验动物伦理学要求，审批号：DW20181005-098，遵循实验动物使用3R原则。树鼩关节滑膜组织成纤维样滑膜细胞分离方法参照文献[15]。
1.3.2 实验主要仪器与试剂 CO2培养箱、NanoDrop超微量紫外光分光光度计(Thermo Science，美国)；倒置显微镜(徕卡，中国)；多功能酶标仪(BioTek，美国)；PTC-200梯度PCR仪(Bio-Rad，美国)；PBS(Sigma，美国)；DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶均购自Thermo Fisher(Thermo Science，美国)；青链霉素混合液(Solarbio，中国)；生物素羊抗鼠IgG(博士德，中国)；人TLR8配体R848(Invitrogen，美国)；Western blot实验相关系统及试剂购自Bio-Rad公司(美国)与碧云天(中国)；QuantiTect 反转录试剂盒(QIAGEN，德国)；鼠抗人vimentin抗体(ab8978)、TLR7(ab124928)、TLR8 (ab180610)、MyD88(ab133739)、核因子кB(ab209795)(Abcam公司，美国)；P38(ab1185593)、p-P38(MA5-15177)、p-Erk1/2(700012)、RANKL(ab2833477)、Tubulin(ab2792779)(Invitrogen，Thermo Fisher，美国)。
1.4 实验方法

1.4.1 树鼩成纤维样滑膜细胞的分离及原代培养[15] 使用3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉树鼩，取下后肢关节，见图1，去除皮毛后置于含青霉素和链霉素(含青霉素10 000 U/mL，链霉素1 000 mg/L)的PBS中浸泡清洗。手术剪去除肌肉暴露膝盖骨并找出关节囊，分离平滑光亮的滑膜组织置于含有青霉素与链霉素的PBS中清洗3次，用眼科剪将滑膜组织剪切成1 mm2大小，均匀置于60 mm的培养皿中，将培养皿倒置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中5 min。组织贴附后加入DMEM完全培养基(含体积分数10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素)，置于培养箱中培养，每天在倒置显微镜下观察细胞并拍照，每两三天换液一次。待细胞爬出汇合率达80%以上，弃去培养液，PBS洗涤后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化细胞，按1∶2或1∶3比例传代，经过3-5次传代培养后即可获取纯化的树鼩成纤维样滑膜细胞。每天倒置显微镜下观察爬出的细胞以及不同传代次数成纤维样滑膜细胞的形态，直到细胞汇合率达80%-90%，观察期间拍照记录。

1.4.2 CCK-8法检测细胞增殖能力取对数生长期树鼩成纤维样滑膜细胞重悬，接种于96孔培养板，每孔2×103个细胞，待细胞贴壁后，加入10 μL CCK-8试剂并置于培养箱中培养4 h，使用酶标仪在405 nm波长测量其吸光度值，每隔24 h重复实验，7 d后绘制出细胞增殖曲线。
1.4.3 苏木精-伊红染色观察细胞形态取第3代树鼩成纤维样滑膜细胞消化重悬，接种1 mL(含1×105个细胞)细胞悬液于放有盖玻片的6孔板，制备细胞爬片。待细胞长至70%-80%汇合后弃去培养液，PBS洗涤3次，使用40 g/L多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗涤3次，苏木精-伊红染色，中性树胶封固后显微镜下观察并拍照。
1.4.4 免疫细胞化学染色检测细胞波形蛋白表达取第3代树鼩成纤维样滑膜细胞消化重悬，接种1 mL(含1×105个细胞)细胞悬液于放有盖玻片的6孔板，制备细胞爬片。待细胞长至60%汇合率后弃去培养液，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛室温固定15 min，TritonX-100室温孵育15 min，体积分数3%H2O2孵育5 min，PBS洗涤3次，5%BSA室温封闭20 min，去除封闭液，加1滴鼠抗人波形蛋白抗体(1∶500)4 ℃ 过夜，洗涤后加生物素标记山羊抗小鼠IgG室温孵育15 min，洗涤后DAB显色1 min，苏木精复染，中性树胶封固后倒置显微镜下观察并拍照。
1.4.5 Western blot法筛选抗体采用Western blot法筛选可与树鼩成纤维样滑膜细胞TLR8及其信号通路蛋白结合的抗体，并用人成纤维样滑膜细胞中相关蛋白进行对照。
取对数生长期树鼩成纤维样滑膜细胞和人成纤维样滑膜细胞，皆分空白对照组和R848刺激组，R848刺激组加入终质量浓度为1 mg/L的人TLR8配体R848干预48 h。收集细胞，提取细胞总蛋白，采用BCA法对各组样品进行定量，10%丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜并封闭后，加入以1∶1 000比例稀释的抗TLR8、MyD88、核因子κB、P38、p-P38、p-Erk1/2、RANKL、Tubulin抗体，4 ℃孵育过夜，洗净后用1∶1 000稀释的马抗兔或马抗小鼠IgG抗体室温孵育1 h，最后按照ECL试剂盒说明书进行显影并拍摄。
1.4.6 琼脂糖凝胶电泳筛选相关引物采用琼脂糖凝胶电泳筛选可用于检测树鼩成纤维样滑膜细胞TLR8通路相关因子mRNA表达的引物。
取对数生长期树鼩成纤维样滑膜细胞，分为空白对照组和R848刺激组，R848刺激组加入终质量浓度为1 mg/L的人TLR8配体R848干预48 h。收集细胞，采用Trizol法提取并检测总RNA的浓度，按QuantiTect Rev. Transcription Kit试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA。根据自行设计的引物，见表1，进行PCR扩增，反应结束后，PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.5 主要观察指标树鼩成纤维样滑膜细胞生长状态；Western blot筛选可用于检测TLR8及信号通路蛋白的抗体，并检测TLR8通路在树鼩成纤维样滑膜细胞中的活化情况；RT-PCR法检测树鼩成纤维样滑膜细胞中TLR8信号通路及下游细胞因子mRNA表达。
1.6 统计学分析采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析，两组间比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，所有数据结果以x±s显示，P < 0.05 为差异有显著性意义。

讨论

类风湿关节炎的发病特征包括关节软骨、骨骼损坏和滑膜炎症等，病变多以手与脚的小关节向心性对称发病为特点[16]，老年患者还可能会波及到远端大关节，病程长者往往导致关节畸形，严重影响患者的行动生活能力[17-18]。类风湿关节炎的关节损伤是由持续性滑膜炎症细胞浸润导致成纤维样滑膜细胞增生异常，分泌大量的炎症因子及血管翳形成所致[19]，以此可见，在整个类风湿关节炎的发病进程中成纤维样滑膜细胞起着决定性的作用[20]。因此，成纤维样滑膜细胞体外培养体系的建立是研究类风湿关节炎发病的重要手段。
目前，成纤维样滑膜细胞主要来源于类风湿关节炎患者手术切除和大鼠、兔等动物模型的关节滑膜组织，但这些标本都有其缺点，临床提供的滑膜组织来源珍贵而稀缺，大鼠、兔等动物模型的滑膜组织又与人存在差异[21]。树鼩是外形酷似松鼠的小型哺乳动物，全基因组测序表明树鼩有许多高度保守的基因，最为接近于灵长类动物[22-24]，树鼩的免疫系统、内分泌系统和神经系统的组织形态特征亦与灵长类高度相似[25]，因此常作为某些人类重大疾病研究的动物模型，现已广泛用于病毒学、肿瘤学、内分泌学、神经生物学、免疫学等方面的研究[26]。
滑膜细胞包括成纤维样滑膜细胞和巨噬样滑膜细胞，其中成纤维样滑膜细胞占主要比例[27-28]。CD90、血管细胞黏附分子(CD106)、尿二苷磷酸葡萄糖脱氢酶、促衰变因子[29]、波形蛋白等通常作为成纤维样滑膜细胞的主要标志物，其中CD90和波形蛋白可作为不同解剖部位成纤维细胞的相同标志物[30]。此次实验采用组织块贴壁法分离培养成纤维样滑膜细胞，此方法简单易行，既可避免酶消化法剂量、时间的难控性，又可避免酶消化法所得细胞繁杂的困扰[31]。组织块贴壁培养法在组织块周围有细胞游出后，可见有成纤维样和巨噬样两种滑膜细胞，但成纤维样滑膜细胞贴壁及增殖能力强，消化时间不同，因此采用传代的方式可以获得大量纯化的成纤维样滑膜细胞。此次实验结果显示，细胞传至第2代时明显可见巨噬样滑膜细胞减少，至第3代以后就得到了纯化的成纤维样滑膜细胞，与参考文献报告相同[32]。纯化后成纤维样滑膜细胞经苏木精-伊红染色观察可见其形态较规则，多呈梭形，符合成纤维细胞形态；同时结合成纤维样滑膜细胞标记物波形蛋白的结果，证实所培养的树鼩滑膜组织来源细胞为成纤维样滑膜细胞。
目前研究发现，MyD88依赖性途径激活核因子кB，引起炎性因子的释放并促进破骨细胞分化成熟，导致炎症反应的发生和软骨损伤，参与了类风湿关节炎的发病过程[33-34]。Toll样受体家族中TLR2、TLR3和TLR4等与类风湿关节炎发病机制方面的研究报道较多[35-37]。但临床研究发现，类风湿关节炎患者的损伤组织中TLR8表达增高，大量体外研究也证实了应用TLR8配体刺激后，培养的成纤维样滑膜细胞可产生高水平炎性细胞因子和金属蛋白酶[38]；用TLR8抑制剂可抑制关节成纤维样滑膜细胞自发产生肿瘤坏死因子α[39]，这些都提示TLR8及其信号通路在成纤维样滑膜细胞炎症发生过程中具有重要的作用[40]。树鼩作为新的模式实验动物，在TLR8及其信号通路检测方法不完善，因此，此次实验成功筛选出了可用于检测树鼩TLR8通路及下游细胞因子mRNA的引物，初步探讨了R848刺激48 h后各蛋白及细胞因子mRNA表达的变化，结果显示TLR7-1、TLR8-1，TLR8-2、TLR9-2、TLR9-1、干扰素β、白细胞介素6、GAPDH、β-actin条带明显，可用于后续研究中；但R848刺激48 h后树鼩成纤维样滑膜细胞TLR8通路相关mRNA表达水平无显著变化，后续还需继续探讨刺激的时间和刺激剂的浓度等问题。其次筛选出了可用于树鼩TLR8及其信号通路蛋白检测用的抗体，以人成纤维样滑膜细胞作为对照，使用Invitrogen和Abcam公司检测人蛋白的兔源一抗可协助检测树鼩相应蛋白，R848刺激48 h后表现为TLR8信号通路中核因子κB蛋白表达水平升高，说明树鼩TLR8通路可以被激活，建立了树鼩TLR8通路相关分子检测方法。
综上所述，此次实验建立了一种新的与人类更为相似的动物(树鼩)的成纤维样滑膜细胞体外培养方法，通过苏木精-伊红染色和免疫细胞化学染色法检测成纤维样滑膜细胞进行鉴定，建立了树鼩成纤维样滑膜细胞体外分离培养、纯化及鉴定的方法，初步探讨树鼩TLR8相关通路蛋白及基因的研究途径，可能为研究如类风湿关节炎的关节疾病提供更好的手段，这些结果为后续利用树鼩成纤维样滑膜细胞在类风湿关节炎方面的研究提供了良好基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

树鼩成纤维样滑膜细胞分离鉴定及TLR8通路相关分子检测方法的建立

Isolation and identification of fibroblast-like synoviocytes from tree shrews and establishment of TLR8 pathway related molecular detection methods

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