脐带间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮树鼩模型的效果评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2140

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (1): 90-95.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2140

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脐带间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮树鼩模型的效果评价

阮光萍1，2，3，姚翔1，2，3，蔡学敏1，2，3，李自安1，2，3，庞荣清1，2，3，潘兴华1，2，3

1解放军联勤保障部队第920医院基础医学实验室，云南省昆明市 650032；2干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省昆明市 650032；3云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032

收稿日期:2020-01-23 修回日期:2020-02-13 接受日期:2020-03-11 出版日期:2021-01-08 发布日期:2020-11-19
通讯作者: 潘兴华，博士，主任医师，解放军联勤保障部队第920医院基础医学实验室，云南省昆明市 650032；干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省昆明市 650032；云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032
作者简介:阮光萍，女，1974年生，云南省昆明市人，汉族，2007年南方医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事干细胞基础与应用研究。
基金资助:
云南省科技计划项目重大科技专项(2018ZF007)；云南省重点项目(2018FA041)；云南省重点项目(2017FA040)；国家自然科学基金(31970515)；中国人民解放军联勤保障部队第920医院院管课题(2019YGB17)；中国人民解放军联勤保障部队第920医院院管课题(2019YGA05)

Effect of umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation for treating systemic lupus erythematosus in a tree shrew model

Ruan Guangping1, 2, 3, Yao Xiang1, 2, 3, Cai Xuemin1, 2, 3, Li Zian1, 2, 3, Pang Rongqing1, 2, 3, Pan Xinghua1, 2, 3

1Basic Medical Laboratory of 920th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China; 2Integrated Engineering Laboratory of Cell Biological Medicine of State and Regions, Kunming 650032, Yunnan Province, China; 3Transfer Medicine Key Laboratory of Cell Therapy Technology of Yunan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Received:2020-01-23 Revised:2020-02-13 Accepted:2020-03-11 Online:2021-01-08 Published:2020-11-19
Contact: Pan Xinghua, MD, Chief physician, Basic Medical Laboratory of 920th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China; Integrated Engineering Laboratory of Cell Biological Medicine of State and Regions, Kunming 650032, Yunnan Province, China; Transfer Medicine Key Laboratory of Cell Therapy Technology of Yunan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Ruan Guangping, MD, Associate chief physician, Basic Medical Laboratory of 920th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China; Integrated Engineering Laboratory of Cell Biological Medicine of State and Regions, Kunming 650032, Yunnan Province, China; Transfer Medicine Key Laboratory of Cell Therapy Technology of Yunan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the Major Science and Technology Project of Science and Technology Plan Project of Yunnan Province, No. 2018ZF007; the Yunnan Province Applied Basic Research Program Key Project, Nos. 2018FA041, 2017FA040; the National Natural Science Foundation of China, No. 31970515; a grant from 920th Hospital of the PLA Joint Logistics Support Force In-hospital Technology Plan, Nos. 2019YGB17 , 2019YGA05

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
系统性红斑狼疮：是一种原因不明的自身免疫疾病，血清中出现自身抗体和免疫复合物，同时有严重肾小球肾炎。研究证实T细胞免疫异常与系统性红斑狼疮的发生发展和预后有较大关系。辅助性T细胞17型是近年来发现的一种新型CD4+效应性T细胞，可分泌白细胞介素17，参与到固有免疫及适应性免疫应答中，在系统性红斑狼疮发病中起重要作用。
树鼩：是非人灵长类替代动物，具有资源丰富、成本较低、与人类亲缘关系较近等优势，近年来人类疾病的树鼩模型受到越来越多的关注。

背景：系统性红斑狼疮是一种原因不明的自身免疫疾病，建立系统性红斑狼疮树鼩模型，有利于弄清其发病机制，并为干细胞移植治疗自身免疫疾病提供依据。
目的：建立系统性红斑狼疮树鼩模型以及脐带间充质干细胞移植的治疗效果评估。
方法：树鼩分组腹腔注射降植烷、脂多糖和联合注射，注射后3周筛选成模树鼩12只分为治疗组和模型对照组各6只，另选6只为正常对照组。治疗组每只树鼩尾静脉回输1×106个DiR标记的树鼩脐带间充质干细胞，回输后2周取树鼩的心、肝、脾、肺、肾做病理切片进行苏木精-伊红染色，肾组织进行masson染色和免疫复合物检测，同时取3组树鼩的心、肝、脾、肺、肾进行体外成像。
结果与结论：①苏木精-伊红染色表明模型对照组心、肝、脾、肺、肾有不同程度的病理改变，肾组织有大量免疫复合物沉积，治疗组病理改变好转，结构恢复到接近正常对照组；②体外成像表明DiR标记细胞主要分布于治疗组树鼩的肺、肝和脾，治疗组树鼩的荧光强度值明显大于正常对照组和模型对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果表明，腹腔联合注射降植烷和脂多糖是诱导树鼩发生系统性红斑狼疮病理改变的最佳方法，用脐带间充质干细胞治疗后病理改变发生好转，说明脐带间充质干细胞对树鼩系统性红斑狼疮模型有一定的治疗效果。
https://orcid.org/0000-0002-3784-7040(阮光萍)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脐带间充质干细胞, 移植, 系统性红斑狼疮, 树鼩, 动物模型, 免疫

Abstract: BACKGROUND: Systemic lupus erythematosus is an autoimmune disease with unknown causes. To establish a tree shrew model of systemic lupus erythematosus is helpful to understand its pathogenesis and provide evidence for stem cell transplantation in the treatment of autoimmune diseases.
OBJECTIVE: To establish a tree shrew model of systemic lupus erythematosus and to assess the therapeutic effect of umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation.
METHODS: Tree shrews were grouped and intraperitoneally injected pristane, lipopolysaccharide, and their combination. At 3 weeks after injection, 12 tree shrew models were divided into treatment group and model control group (n=6 per group). An additional 6 models were selected as a normal control group. In the treatment group, each tree shrew was injected with 1×106 DiR-labeled umbilical cord mesenchymal stem cells through caudal vein. Two weeks later, the heart, liver, spleen, lung and kidney of tree shrews were taken for pathological sections. The sections received hematoxylin-eosin staining, kidney Masson staining and immune complex detection. Simultaneously, the heart, liver, spleen, lung and kidney of the three groups of tree shrews were taken for in vitro imaging.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hematoxylin-eosin staining showed pathological changes of the heart, liver, spleen, lung and kidney in the model control group; and there were a lot of immune complex deposits in renal tissue in the model control group. The pathological changes in the treatment group improved, and the structure recovered to close to the normal control group. (2) In vitro imaging showed that DiR-labeled cells were mainly distributed in the lung, liver and spleen of the tree shrews in the treatment group. The fluorescence intensity of tree shrews in the treatment group was significantly higher than that in the normal control group and model control group (P < 0.05). (3) Results demonstrated that intraperitoneal injection of pristane and lipopolysaccharide is the best method to induce pathological changes of systemic lupus erythematosus in tree shrews. The pathological changes after treatment with umbilical cord mesenchymal stem cells have improved, indicating that umbilical cord mesenchymal stem cells have certain treatment effects on tree shrew models of systemic lupus erythematosus.

Key words: stem cells, umbilical cord mesenchymal stem cells, transplantation, systemic lupus erythematosus, tree shrew, animal model, immunity

中图分类号:

阮光萍, 姚翔, 蔡学敏, 李自安, 庞荣清, 潘兴华. 脐带间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮树鼩模型的效果评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 90-95.

Ruan Guangping, Yao Xiang, Cai Xuemin, Li Zian, Pang Rongqing, Pan Xinghua. Effect of umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation for treating systemic lupus erythematosus in a tree shrew model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(1): 90-95.

图/表（结果） 7

2.1 树鼩脐带间充质干细胞的分离培养和鉴定结果树鼩脐带间充质干细胞贴壁培养第3天可见有许多细胞贴壁存活，换液3次后细胞均匀分布，呈梭形，长满后可传代。流式检测结果表明CD29-PE阳性率为97.5%，CD44-FITC阳性率为98.2%，CD34-FITC阳性率为0.861%，FITC同型对照的阳性率为0.017%，PE同型对照的阳性率为0.035%，证明分离培养的树鼩脐带间充质干细胞具有间充质干细胞的表面标记，见图1。

2.2 定量PCR检测IL-17D、Foxp3基因相对表达量注射降植烷和脂多糖后2周，4组的外周血基因检测结果见图2，可见IL-17D基因表达在联合诱导组升高最明显，而单独注射降植烷组也升高，单独注射脂多糖组IL-17D表达量升高不多。Foxp3基因的检测结果正好相反，在联合诱导组降低最明显，单独注射降植烷组也降低，单独注射脂多糖组Foxp3表达量降低不多。

2.3 ELISA检测树鼩血清IgG水平变化联合诱导组树鼩血清IgG水平升高最明显，其次为降植烷组，最后是脂多糖组，见图3A。联合诱导组补体C3水平在注射后3周升高最明显，与其他组比较差异有显著性意义(P < 0.01，n=10)，见图3B。

2.4 病理切片苏木精-伊红染色和肾脏masson染色结果移植细胞后2周，病理切片苏木精-伊红染色显示模型对照组心、肝、脾、肺、肾均发生了不同程度的病变，正常对照组均正常，而治疗组与模型对照组相比病变有明显好转，见图4。模型对照组肾脏masson染色显示肾间质有纤维化，可见较多蓝染的纤维分布，正常对照组没有肾间质纤维化，而治疗组恢复正常，蓝染纤维明显减少，见图4。

2.5 肾免疫复合物沉积情况用兔抗猴IgG与肾切片孵育，结果表明模型对照组有大量肾免疫复合物沉积，而正常对照组没有荧光物质沉积，治疗组也没有大量肾免疫复合物沉积，见图5。

2.6 体外成像结果移植细胞后2周，将治疗组、正常对照组、模型对照组树鼩处死，取心、肝、脾、肺、肾做体外成像，在小动物活体成像仪中将各脏器放在平皿中，观察DiR标记细胞的分布。图6分别为每组1只树鼩的体外成像结果，实验重复3次。各脏器的荧光强度值见表2。

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引言

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种原因不明的自身免疫病，血清中出现自身抗体和免疫复合物，同时有严重肾小球肾炎[1]，至今还没有治疗系统性红斑狼疮的良好措施。在研究系统性红斑狼疮治疗方法上，建立合适的动物模型是一种较好的研究手段。近年来小鼠模型的研究对揭示系统性红斑狼疮发病原因、发病机制及探索治疗方法具有重要价值。树鼩的系统性红斑狼疮模型还没有相关研究，树鼩作为非人灵长类替代动物具有资源丰富、成本较低、与人类亲缘关系较近等优势，近年来受到越来越多的关注[2-4]。
系统性红斑狼疮最易累及的脏器是肾脏，狼疮肾炎表现为免疫复合物沉积在肾小球不同部位[5]。当狼疮肾炎不能控制时，最终将发展为晚期肾衰竭[6]。总的来说，环磷酰胺药物疗法能控制大部分狼疮性肾炎，但不能全部控制。因此，分析疾病的发病机制对提高系统性红斑狼疮的治疗效果是很重要的。
间充质干细胞是一类存在于脂肪、骨髓、肌肉等多种组织中，可多向分化并具有免疫调节作用的非造血干细胞[7]。成人间充质干细胞主要存在于骨髓中，构成造血微环境，调节造血干细胞的生长和分化。脐带间充质干细胞较骨髓间充质干细胞具有容易获得的优点，成为目前临床治疗的研究热点[8]。
系统性红斑狼疮发病的机制还不清楚，研究证实T细胞免疫异常起着重要的作用，与疾病的发生发展和预后有较大关系。辅助性T细胞17型(T help cell 17，Th17)是近年来发现的一种新型CD4+效应性T细胞，可分泌白细胞介素17，参与到固有免疫及适应性免疫应答中，在系统性红斑狼疮发病中起重要作用[9]。脐带间充质干细胞移植可下调系统性红斑狼疮患者的Th17细胞水平，可能是脐带间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮的有效机制之一[10]。Foxp3+调节性T细胞是具有免疫抑制功能的CD4+T淋巴细胞的一个亚群，在自身免疫性疾病、器官移植免疫耐受、抗肿瘤免疫及过敏性疾病中均发挥重要作用。在系统性红斑狼疮模型动物中可检测到IL-17D基因表达明显升高[9]，Foxp3基因表达明显降低[11]，还可检测到血清IgG水平明显升高。CD4+CD25+T细胞是调节性T细胞的亚群之一，主要来源于胸腺，其功能主要与抑制自身反应性T细胞的免疫反应、抑制传统T细胞的活化及促进一些抑制性细胞因子的分泌等有关，对维持机体内环境稳定、肿瘤免疫监测、诱导移植耐受和自身免疫性疾病的发生发挥重要作用。系统性红斑狼疮患者外周血中Th17细胞增加，CD4+CD25+T细胞减少，因此外周血中IL-17基因表达升高，Foxp3基因表达降低。
近年来自身免疫病的发病率也呈上升趋势，系统性红斑狼疮是一个摆在人们面前的未能解决的难题，动物模型是一种较好的研究工具来助力遗传易感性和发病机制研究，利用树鼩模型可以控制环境因素对实验动物的影响，有利于弄清发病机制和找出致病性基因位点。该研究主要探讨脐带间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的机制和疗效。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2018年6月至2019年6月在中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院临床实验科完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 60只树鼩用于造模，普通级，雌性，10周龄，体质量120-150 g；10只树鼩用于细胞培养，普通级，雌性，15周龄，体质量150-160 g。所有树鼩为中缅树鼩滇西亚种，购自中科院昆明动物所，实验动物机构许可证号为SYXK(军)2017-0051。实验步骤由解放军联勤保障部队第九二〇医院实验动物伦理委员会审批通过。
1.3.2 实验试剂和仪器胎牛血清、DMEM/F12培养基(BI公司)；CD29-PE、CD44-FITC、CD34-FITC以及FITC和PE的同型对照(BD公司)；降植烷和脂多糖(Sigma公司)；ELISA板(康宁公司)；HRP标记的兔抗猴IgG抗体(Sigma公司)；血RNA提取试剂盒(百泰克公司)；反转录试剂盒和定量PCR试剂盒(Thermo公司)；0.25%胰蛋白酶(BI公司)；DiR(Sigma公司)；小动物活体成像仪(Caliper Life Sciences公司，型号：IVIS Iuminar XR)。
1.4 实验方法
1.4.1 树鼩脐带间充质干细胞的分离培养和鉴定收集进行剖腹产的树鼩脐带，用盐水冲洗，双抗浸泡，用小剪刀尽量将脐带剪碎，放入培养瓶中贴壁培养，两三天可出现贴壁细胞，换液，培养基为含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12，待细胞长满可传代培养。第3代树鼩脐带间充质干细胞用流式抗体标记，上流式细胞仪检测。抗体包括CD29-PE、CD44-FITC、CD34-FITC以及FITC和PE的同型对照。

1.4.2 树鼩分组及造模 60只树鼩随机分为4组，每组15只，降植烷组腹腔注射1 mL降植烷，脂多糖组腹腔注射 1 mL脂多糖，联合诱导组腹腔注射1 mL降植烷和1 mL脂多糖，正常对照组不进行注射。降植烷为液体，纯度大于95%，脂多糖质量浓度为0.25 g/L。降植烷和脂多糖每周注射1次，共3周，注射后1，2，3周，从腹股沟静脉采血，分离血清包被ELISA板，用HRP标记的兔抗猴IgG抗体观察血清IgG水平变化，检测波长为450 nm，然后每只树鼩血清送到检验科检测补体C3水平变化。
1.4.3 定量PCR检测IL-17D和Foxp3的相对表达量注射降植烷和脂多糖后3周，各组树鼩从腹股沟静脉采血0.5 mL，用血RNA提取试剂盒按操作说明提取RNA，用反转录试剂盒按操作说明进行反转录，再用定量PCR试剂盒进行定量PCR检测IL-17D和Foxp3的相对表达量。引物序列及产物长度见表1。

1.4.4 成模树鼩分组根据定量PCR结果和ELISA结果，联合诱导组有12只成模，成模标准为ELISA实验检测的吸光度值为正常对照组吸光度均值的2倍以上，定量PCR检测到IL-17D基因表达明显升高，Foxp3基因表达明显降低，分为模型对照组和治疗组各6只，再随机挑选6只正常树鼩做为正常对照组。
1.4.5 树鼩脐带间充质干细胞标记与移植用0.25%胰蛋白酶将培养的第4代树鼩脐带间充质干细胞消化分散后用含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止，吹打均匀后吸入到15 mL离心管中计数，按1 mL细胞浓度为1×109 L-1的细胞悬液加入5 μL 3 mmol/L的DiR储存液进行标记，37 ℃
孵育10 min，然后用预热的无血清DMEM/F12培养基洗涤3遍(2 000 r/min离心5 min)。造模成功后4周，治疗组每只树鼩尾静脉注射1×106个DiR标记后的脐带间充质干细胞，模型对照组和正常对照组注射生理盐水。
1.4.6 病理切片苏木精-伊红染色移植细胞后2周，将正常对照组、模型对照组和治疗组各3只树鼩的心、肝、脾、肺、肾泡于40 g/L多聚甲醛中，送至武汉谷歌生物技术有限公司进行苏木精-伊红染色，肾脏加做Masson染色，并拍照分析切片。
1.4.7 肾免疫复合物沉积检测肾脏石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，一抗为兔抗猴IgG，4 ℃过夜，滴加与一抗相应种属的二抗(CY3-羊抗兔1∶300)覆盖组织，避光室温孵育
60 min，DAPI复染细胞核，封固，镜检拍照。
1.4.8 体外成像实验移植细胞后2周，将治疗组、正常对照组和模型对照组树鼩各2只处死，取心、肝、脾、肺、肾做体外成像，在小动物活体成像仪中将各脏器放在平皿中，观察DiR标记细胞的分布。
1.5 主要观察指标 ①各组树鼩心、肝、脾、肺、肾病理切片苏木精-伊红染色和肾Masson染色结果；②各组树鼩肾免疫复合物沉积情况；③各组树鼩脏器体外成像结果。
1.6 统计学分析通过SPSS 17.0统计软件进行数据处理，结果为x±s表示，组间对比用单因素方差分析，两两比较采用SNK和LSD方法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

间充质干细胞是一类来自中胚层的具有一定分化潜能的细胞，在特定条件下可以分化为多种组织细胞。脐带间充质干细胞容易获得，移植后无免疫排斥反应，具有很强的自我复制能力，方便在体外分离培养和扩增，在细胞移植、组织工程、基因治疗等方面被广泛应用，因此脐带间充质干细胞是较理想的种子细胞。
系统性红斑狼疮的病因还没有完全清楚，一般认为它的发病与遗传、激素、某些药物、感染等因素有关系。体内会产生针对自身抗原的自身抗体，形成大量免疫复合物，沉积在肾小球等组织的毛细血管，引起肾小球肾炎等全身多个系统的病变，其发生机制相似于Ⅲ型超敏反应。目前临床上多采用非特异性免疫抑制的治疗方法，对少数难治性病例利用造血干细胞移植治疗。该实验通过建立树鼩系统性红斑狼疮模型，观察脐带间充质干细胞输注治疗系统性红斑狼疮的有效性，探索其治疗机制。实验用兔抗猴IgG与肾切片孵育，结果表明模型对照组有大量肾免疫复合物沉积，而正常对照组没有红色荧光物质沉积，治疗组肾免疫复合物沉积较少，说明治疗后肾小球肾炎明显好转。
机体内CD4+CD25+T细胞约占CD4+T细胞总数的10%，其数量和活性可完成抑制自身反应性T、B淋巴细胞的活化增殖及维持自身免疫平衡的需要[12]。在系统性红斑狼疮患者易感个体中，由于环境、基因异常等因素影响胸腺内CD4+CD25+T细胞的产生，可导致系统性红斑狼疮的发生[13]。以前的研究结果显示，不管是活动组还是非活动组，系统性红斑狼疮患者外周血的CD4+CD25+T细胞表达水平均明显低于健康对照
组[11]。由于CD4+CD25+T细胞的减少，导致机体自身免疫抑制功能减弱，T辅助细胞活化，B淋巴细胞激活因子增多，B淋巴细胞功能亢进，进而产生多种自身抗体，引起多器官受损。
查阅国内外文献，有用脂多糖腹腔注射诱发小鼠发生系统性红斑狼疮的研究[14-16]，也有用降植烷腹腔注射诱发小鼠发生系统性红斑狼疮的研究[17-19]，而树鼩系统性红斑狼疮模型还未见相关研究。因此实验采用60只树鼩，分为4组，每组15只，采用注射不同试剂造模。研究表明降植烷和脂多糖联合注射的树鼩最易发生系统性红斑狼疮相关改变，包括外周血IL-17D基因表达升高[20]，Foxp3基因表达降低，血清IgG水平升高，多器官发生病变，肾切片免疫复合物沉积。将建模成功的12只树鼩分为模型对照组6只和治疗组6只，治疗组树鼩每只回输1×106个DiR标记的脐带间充质干细胞，2周后取心、肝、脾、肺、肾做体外成像，结果表明治疗组树鼩肺、肝、脾有标记细胞分布，而正常对照组和模型对照组树鼩所有脏器的荧光强度值都低于治疗组，大部分都低一个数量级，说明标记的树鼩脐带间充质干细胞主要定位于损伤的脏器。
总之，通过查阅大量国内外文献找到了建立树鼩系统性红斑狼疮模型的方法，病理切片和血清学、基因学结果都表明树鼩系统性红斑狼疮模型建立成功，而初步用脐带间充质干细胞治疗后标记细胞都定位于模型树鼩的心、肝、脾、肺、肾，荧光荧光强度值都高于模型对照组，荧光强度值大多相差一个数量级，为脐带间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮疾病提供了理论和实验基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脐带间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮树鼩模型的效果评价

Effect of umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation for treating systemic lupus erythematosus in a tree shrew model

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