类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡与MAPK/ERK5信号通路的介导

doi:10.12307/2021.114

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
机械激活性离子通道：当活细胞和有机体受到环境中的机械刺激时，机械信号随即转化成生物信号，使细胞作出反应，此过程被称为机械转导。机械敏感性离子通道是一类随细胞膜张力变化通道开放概率呈现相应变化的离子通道。当机械-电信号进行转换时，施加在分子膜上的机械力量信号就转换成电信号或生化信号。
促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路：是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。MAPK有4个主要亚族：ERK1/2、JNK、p38MAPK和ERK5，可在多种不同的信号转导途径中充当共同的信号转导成分，且在细胞周期调控中发挥重要作用。

背景：既往研究大多关注类风湿关节炎发病过程中的免疫因素，近年来生物力学因素在类风湿关节炎疾病发生和发展中的作用也越来越引起人们的重视。
目的：探究Piezo1通过MAPK/ERK5信号通路介导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的相关机制。
方法：采用组织块法分离培养类风湿关节炎滑膜细胞，利用Flexcell 5000T 细胞牵张应力系统构建体外细胞牵张应力模型，构建Piezo1 siRNA基因干扰载体和过表达质粒，根据预实验结果及处理方案，将类风湿关节炎来源滑膜细胞分成6组，即siRNA干扰组、过表达质粒组、空白对照组、siRNA干扰+BIX02188组、过表达质粒+BIX02188组、空白对照+BIX02188组。采用RT-PCR检测Piezo1、ERK5和凋亡相关基因的表达，Fluo-3 AM探针检测细胞内钙离子含量，AV-PI试剂盒检测细胞凋亡水平。
结果与结论：①siRNA干扰+BIX02188组细胞内钙离子含量要明显低于siRNA干扰组(P < 0.05)；过表达质粒+BIX02188组细胞内钙离子含量要明显低于过表达质粒组(P < 0.05)；②siRNA干扰组的Piezo1、ERK5 mRNA相对表达量要明显低于空白对照组(P < 0.05)，过表达质粒组明显高于空白对照组(P < 0.05)；MAPK/ERK5抑制剂BIX02188处理后，Piezo1 mRNA的表达量无明显变化，但是siRNA干扰+BIX02188组的ERK5 mRNA相对表达量要明显低于siRNA干扰组(P < 0.05)，过表达质粒+BIX02188组的ERK5 mRNA相对表达量要明显低于过表达质粒组(P < 0.05)；③siRNA干扰组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率要明显低于空白对照组(P < 0.05)；过表达质粒组明显高于空白对照组(P < 0.05)；④结果表明，Piezo1蛋白的过度表达可以促进类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡，并且促凋亡信号通过MAPK/ERK5信号通路介导，可以作为类风湿关节炎治疗的潜在基因靶点。
https://orcid.org/0000-0001-8767-4320 (曲向阳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 滑膜细胞, 类风湿关节炎, 机械敏感性离子通道, 凋亡, 钙离子, 通路, 牵张应力

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have mostly focused on immune factors involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Recently, increasing attention has been paid to the role of biomechanical factors in the occurrence and development of rheumatoid arthritis.
OBJECTIVE: To explore the mechanism by which Piezo1 mediates apoptosis of fibroblast-like synovial cells in rheumatoid arthritis through MAPK/ERK5 signaling pathway.
METHODS: The tissue block method was used to culture synovial cells of rheumatoid arthritis. The stretch stress model of cells in vitro was constructed by Flexcell 5000T cell stretch stress system, and piezo1 siRNA gene interference vector and overexpression plasmid were constructed. According to the preliminary experimental results and treatment plan, fibroblast-like synovial cells of rheumatoid arthritis were divided into six groups: siRNA interference group, overexpression plasmid group, blank control group, siRNA interference+BIX02188 group, overexpression plasmid+BIX02188 group, and blank control+BIX02188 group. The expression of Piezo1, ERK5 and apoptosis-associated genes were detected by RT-PCR, the intracellular calcium content was detected by Fluo-3 AM probe, and the apoptotic level was detected by AV-PI kit.
RESULTS AND CONCLUSION: The intracellular Ca2+ content of the siRNA interference+BIX02188 group was significantly lower than that of the siRNA interference group (P < 0.05); the intracellular Ca2+content of the overexpression plasmid+BIX02188 group was significantly lower than that of the overexpression plasmid group (P < 0.05). The relative expression of Piezo1 and ERK5 mRNA in the siRNA interference group was significantly lower than that in the blank control group (P < 0.05), and that in the overexpression plasmid group was significantly higher than that in the blank control group (P < 0.05). The expression of Piezo1 mRNA did not change after BIX02188 inhibition; however, the relative expression of ERK5 mRNA in the siRNA interference+BIX02188 group was significantly lower than that in the siRNA interference group (P < 0.05), and the expression of ERK5 mRNA in the overexpression plasmid+BIX02188 group was significantly lower than that in the overexpression plasmid group (P < 0.05). The early apoptotic rate, the late apoptotic rate and the total apoptotic rate in the siRNA interference group were significantly lower than those in the blank control group (P < 0.05), whereas the early apoptotic rate, the late apoptotic rate and the total apoptotic rate in the overexpression plasmid group were significantly higher than those in the blank control group (P < 0.05). To conclude, the overexpression of Piezo 1 protein can promote the apoptosis of rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells, and the apoptotic signal mediated by the MAPK/ERK5 signaling pathway can act as the potential target gene for treating rheumatoid arthritis.

Key words: synovial cells, rheumatoid arthritis, mechanical sensitive ion channels, apoptosis, calcium ion, pathway, stretch stress

中图分类号:

曲向阳, 宋钦勇. 类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡与MAPK/ERK5信号通路的介导[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(26): 4156-4161.

Qu Xiangyang, Song Qinyong. Piezo 1 mediates apoptosis of fibroblast-like synovial cells in rheumatoid arthritis via MAPK/ERK5 signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(26): 4156-4161.

图/表（结果） 7

2.1 滑膜细胞的培养和鉴定结果原代滑膜细胞呈长梭形和多角形。免疫组化染色显示第3代滑膜细胞波形蛋白染色阳性，流式细胞仪结果显示第3代滑膜细胞CD68阳性率为0.51%，CD90阳性率为94.38%，见图1。

2.2 siRNA-Piezo1干扰序列和Piezo1过表达载体序列转染结果空病毒载体、siRNA-Piezo1干扰序列和Piezo1过表达载体序列均可以通过慢病毒转染滑膜细胞，而且转染效率较高，均在90%左右，见图2。

2.3 Piezo1、ERK5、凋亡相关基因的相对表达量见图3。各组的Piezo1 mRNA相对表达量比较差异有显著性意义(F=9.027，P=0.003 < 0.05)。siRNA干扰组的Piezo1 mRNA相对表达量要明显低于空白对照组(q=2.871，P=0.025 < 0.05)，过表达质粒组的Piezo1 mRNA相对表达量要明显高于空白对照组(q=3.002，P=0.017 < 0.05)，空白对照+BIX02188组的Piezo1 mRNA相对表达量与空白对照组比较差异无显著性意义(q=0.109，P=0.216 > 0.05)，siRNA干扰+BIX02188组的Piezo1 mRNA相对表达量与siRNA干扰组比较差异无显著性意义(q=0.186，P=0.197 > 0.05)。

各组的ERK5 mRNA相对表达量比较差异有显著性意义(F=9.014，P=0.003 < 0.05)。siRNA干扰组的ERK5 mRNA相对表达量要明显低于空白对照组(q=2.096，P=0.021 < 0.05)，过表达质粒组的ERK5 mRNA相对表达量要明显高于空白对照组(q=2.941，P=0.012 < 0.05)，空白对照+BIX02188组的ERK5 mRNA相对表达量要明显低于空白对照组(q=2.027，P=0.009 < 0.05)，siRNA干扰+BIX02188组的ERK5 mRNA相对表达量要明显低于siRNA干扰组(q=2.431，P=0.011 < 0.05)，过表达质粒+BIX02188组的ERK5 mRNA相对表达量要明显低于过表达质粒组(q=3.146，P=0.000 < 0.05)。
凋亡相关基因Bax、Bad和Caspase-3的mRNA表达量与ERK5的mRNA表达趋势相同，而抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达量与ERK5的mRNA表达趋势相反。
2.4 各组细胞的凋亡水平检测结果 siRNA干扰组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率要明显低于空白对照组(q=2.907，2.008，3.097；P < 0.05)；过表达质粒组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率要明显高于空白对照组(q=2.112，2.143，2.903；P < 0.05)；空白对照+BIX02188组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率要明显低于空白对照组(q=2.174，2.219，3.129；P < 0.05)；siRNA干扰+ BIX02188组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率要明显低于siRNA干扰组(q=2.143，2.714，2.906；P < 0.05)，过表达质粒+BIX02188组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率要明显低于过表达质粒组(q=2.774，3.011，3.174； P < 0.05)，见图4和图5。

2.5 各组滑膜细胞内钙离子含量 siRNA干扰组细胞内Ca2+含量要明显低于空白对照组(q=2.017，P=0.015 < 0.05)；过表达质粒组细胞内Ca2+含量要明显高于空白对照组(q=2.149，P=0.012 < 0.05)；siRNA干扰+BIX02188组细胞内Ca2+含量要明显低于siRNA干扰组(q=2.121，P=0.009 < 0.05)；过表达质粒+BIX02188组细胞内Ca2+含量要明显低于过表达质粒组(q=2.199，P=0.011 < 0.05)，见图6和图7。

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引言

类风湿关节炎是一种累及多关节的免疫性疾病，其病理特点是滑膜细胞增殖与凋亡的失衡，滑膜炎症的释放，侵及关节软骨及关节下骨等组织，从而影响关节的功能，降低患者的生活质量[1-2]。既往研究中，大多关注类风湿关节炎发病过程中的免疫因素[3-4]，但是生物力学因素在类风湿关节炎疾病发生和发展中的作用也越来越引起人们的重视。国内学者周薇等[5]研究聚焦于周期性机械牵张应力对于类风湿关节炎患者膝关节滑膜细胞增殖的影响，他们发现在Flexcell周期性牵张应力加载系统干预下，滑膜细胞的增殖率明显增加，并且可以促进滑膜细胞中骨形态发生蛋白2的表达，说明生物牵张应力在类风湿关节炎的发生中起到重要作用。基于此，该研究利用Flexcell 5000T多通道牵张应力加载系统体外构建细胞牵张应力模型，其目的是探究机械牵张应力对类风湿关节炎来源滑膜细胞生物学行为的影响，以期探索生物力学和类风湿关节炎的关系，为类风湿关节炎的治疗提供新的靶点。

新型机械激活性离子通道Piezo1是最近发现的与生物力学信号密切相关的跨膜蛋白分子[6-7]。有研究证明，Piezo1蛋白参与骨关节炎软骨细胞的凋亡，并且可以通过MAPK/ERK1/2信号通路介导细胞的过度凋亡[8]。还有研究表明，利用siRNA沉默Piezo1后，可以对牵张应力刺激下髓核细胞的凋亡起到一定程度的保护作用，但是其具体的信号通路未知[9-10]。在此基础上，该实验探究新型机械激活性离子通道Piezo1介导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的分子机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外对比观察实验。
1.2 时间及地点实验于2017年1月至2018年12月在滨州医学院烟台附属医院中心实验室完成。
1.3 对象 2017年1月至2018年1月收治入关节外科的类风湿关节炎患者11例，其中女8例，男3例，年龄41-58岁，均符合2009年ACREULAR 类风湿关节炎的诊断标准，获取关节镜下切除的增生滑膜组织。所有入组者均签署知情同意书，该研究方案通过滨州医学院烟台附属医院伦理委员会批准，批准项目号：GD2017028789。
实验试剂和仪器：胎牛血清、DMEM/F12培养基(北京碧云天生物有限公司)；AV-PI试剂盒和Fluo-3 AM探针试剂盒(武汉默沙克生物科技有限公司)；荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)；周期性机械牵张应力仪(FlexCell公司)；流式细胞仪(德国Partec公司)；MAPK/ERK5抑制剂BIX02188(美国Selleck公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 滑膜细胞的培养和体外细胞牵张应力模型的构建采用组织块法对类风湿关节炎滑膜组织进行培养，利用眼科剪将关节镜下获得的滑膜组织块修剪成1 mm3大小，加入5%胶原酶处理4 h，2.5%胰蛋白酶处理30 min，过细胞筛后，加入含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置入37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中进行培养，3 d换液1次，细胞融合率达80%以上时，进行细胞换代。
取第3代滑膜细胞，均匀接种于FlexCell公司的膜性6孔板中，待细胞融合率>60%时，加载机械牵张应力。根据预实验结果，设置周期为6次/s，幅度为20%，强度为50 Hz，时间梯度为24 h。

1.4.2 滑膜细胞的鉴定收集第3代滑膜细胞进行流式鉴定，采用流式细胞仪检测滑膜细胞中CD68和CD90等分子标志物的表达。同时收集第3代滑膜细胞进行免疫组化染色鉴定，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，5%牛血清白蛋白孵育30 min，PBS清洗3遍，加入4%Triton X-100进行细胞破膜，加入5%牛血清白蛋白封闭后，加入波形蛋白一抗避光孵育过夜，PBS清洗3遍，加入20%生物素-辣根过氧化物酶复合物二抗避光孵育30 min，树胶封固，光学显微镜下观察。

1.4.3 siRNA-Piezo1干扰载体的构建 Piezo1 siRNA基因干扰载体的构建和筛选由上海吉凯公司完成。首先通过PubMed Genebank 查询人源Piezo1蛋白的基因序列以及ORF序列和3’-UTR序列。根据siRNA靶点设计原理，构建siRNA-Piezo1的干扰序列。选取上海吉凯公司提供的hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒载体作为酶切对象，加入siRNA-Piezo1干扰序列后，转染类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞进行克隆测定，然后进行质粒抽提、慢病毒包装以备用。
1.4.4 Piezo1 过表达载体的构建 Piezo1 基因过表达载体的构建和筛选由上海吉凯公司完成。首先对目的基因进行过表达引物设计，设计序列为：Piezo1(4589-11)P1，ACG GGA CTA AGC GCA TTG CAA TTT CC；Piezo1(4589-11)P2，GAA TCG CGT TGC ATG CCG TAA，然后RT-PCR扩增目的基因序列，将目的基因扩增序列加入线性化表达载体，选取上海吉凯公司提供的hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒载体作为酶切对象，加入Piezo1基因过表达载体序列后，转染类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞进行克隆测定，然后进行质粒抽提、慢病毒包装以备用。
1.4.5 实验分组根据预实验结果及处理方案，将类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞分成6组：①siRNA干扰组：滑膜细胞加入慢病毒介导的siRNA-Piezo1干扰序列；②过表达质粒组：滑膜细胞加入慢病毒介导的Piezo1过表达序列；③空白对照组：滑膜细胞加入等剂量的PBS溶液；④siRNA干扰+ BIX02188组：滑膜细胞加入慢病毒介导的siRNA-Piezo1干扰序列和25%MAPK/ERK5抑制剂BIX02188；⑤过表达质粒+BIX02188组：滑膜细胞加入慢病毒介导的Piezo1过表达序列和25%MAPK/ERK5抑制剂BIX02188；⑥空白对照+BIX02188组：滑膜细胞加入等剂量的PBS溶液和25%MAPK/ERK5抑制剂BIX02188。各组滑膜细胞浓度是5×109 L-1，接种于6孔板中培养，干预时间为72 h。
1.4.6 Fluo-3 AM探针检测细胞内钙离子含量利用胰蛋白酶消化上述各组细胞，PBS清洗3次，接种于预先铺有细胞圆形玻璃爬片的24孔板，加入不含钙离子的DMEM/F12培养基孵育24 h，HBSS清洗3次，加入预先1∶5稀释的Fluo-3 AM 工作液，避光孵育30 min，树胶封固，倒置荧光显微镜观察细胞内钙离子的荧光强度，利用Image J软件分析荧光强度进行半定量分析。

1.4.7 RT-qPCR检测Piezo1、ERK5和凋亡相关基因Bad、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达利用胰蛋白酶消化上述各组细胞，PBS清洗3次，1 500 r/min常温离心5 min，收集细胞沉淀，加入1 mL Trizol提取细胞总RNA，然后采用TAKARA反转录试剂盒将20 μL反应体系反转录为cDNA，-80 ℃保存，采用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒进行荧光定量PCR分析，熔解曲线确定Tm值为73.7 ℃，统计并记录各组样本的Ct值，采用2-∆∆Ct法对Piezo1、ERK5和凋亡相关基因Bad、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达进行统计。各基因引物序列见表1。

1.4.8 流式细胞仪检测细胞凋亡水平利用胰蛋白酶消化上述各组细胞，按照AV-PI试剂盒说明书操作，流式细胞仪分析各组细胞凋亡率。Annexin V+/PI-为早期凋亡细胞，Annexin V+/PI+为晚期凋亡和坏死细胞，Annexin V-/PI+为正常细胞。
1.5 主要观察指标各组细胞钙离子含量、凋亡水平以及Piezo1、ERK5和凋亡相关基因Bad、Bcl-2、Bax和Caspase-3的相对表达量。
1.6 统计学分析应用SPSS 19.0统计学软件进行数据学统计，定量资料采用x±s表示，多组间比较采用方差分析(F检验)，两两组间比较采用q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

类风湿关节炎主要是由于滑膜组织增生而侵犯的关节软骨和软骨下骨的病理改变，其主要是由滑膜细胞的增殖和凋亡失衡而导致的[11-12]。既往研究聚焦于降低类风湿关节炎滑膜组织中的炎性因子表达[13-14]，但是从滑膜细胞凋亡角度探讨可以从根本上解决问题。该研究以类风湿关节炎滑膜组织为研究对象，培养人类风湿关节炎滑膜细胞，构建Piezo1的siRNA干扰质粒和过表达质粒，从两个方向上沉默Piezo1蛋白和过表达Piezo1蛋白表达，并且通过MAPK/ERK5抑制剂BIX02188研究ERK5作为Piezo1蛋白下游信号分子的手段，进一步对滑膜细胞的凋亡机制进行探究，以期为临床上类风湿关节炎的治疗提供新的思路和方法。
生物力学信号与骨关节炎的发生发展密切相关，随着对生物力学的进一步研究，类风湿关节炎的发生与生物力学信号的关系也越来越引起学者的兴趣[15-16]。既往研究中利用Flexcell-4000T处理滑膜细胞，观察在生物力学刺激下滑膜细胞明显增殖，但是具体的作用机制尚未进一步研究。孙晓雷等[17]研究发现在机械牵张应力作用下体外培养的骨性关节炎软骨细胞的增殖活性与牵张应力的形变量有关，当超过10%时，可以促进软骨细胞的凋亡。新型机械敏感性离子通道Piezo1蛋白是最新发现的与真核生物力学密切相关的跨膜蛋白分子，并且有研究发现Piezo1蛋白参与生物力学刺激下软骨细胞的凋亡[18-19]，但是尚未有实验探究Piezo1蛋白在人类风湿关节炎滑膜细胞过度凋亡机制中的作用。该研究siRNA干扰组的凋亡相关因子Bad、Bax、Caspase-3表达明显降低，抗凋亡因子Bcl-2表达明显增加，并且siRNA干扰组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率明显低于空白对照组。过表达质粒组的凋亡相关因子Bad、Bax、Caspase-3明显增加，抗凋亡因子Bcl-2明显降低，并且过表达质粒组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率明显高于空白对照组。结果表明，Piezo1蛋白的过度表达可以促进滑膜细胞的凋亡，Piezo1蛋白的siRNA沉默表达可以抑制滑膜细胞的凋亡。
MAPK信号通路参与细胞的凋亡与增殖，既往研究表明MAPK信号通路参与各种细胞的凋亡，比如骨关节炎软骨细胞、肝癌细胞等[20-21]。该研究利用MAPK/ERK5抑制剂BIX02188作为沉默ERK5表达手段，通过阻断MAPK/ERK5信号通路，观察Piezo1介导的力学信号是否通过MAPK/ERK5信号通路激活凋亡相关因子Bad、Bax、Caspase-3的表达，从而进一步引起细胞凋亡。结果表明，BIX02188可以抑制人类风湿关节炎滑膜细胞的ERK5表达，但是不能抑制Piezo1的表达，分析其原因可能ERK5是Piezo1蛋白的下游信号分子。另外，siRNA干扰+BIX02188组的凋亡相关因子Bad、Bax、Caspase-3明显降低，抗凋亡因子Bcl-2明显增加，并且siRNA干扰BIX02188组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率明显低于siRNA干扰组。结果表明，阻断ERK5的表达可以进一步抑制细胞凋亡。
钙离子是最为活跃的第二信使，可以参与细胞的各个生理过程，比如增殖、凋亡和分化[22]。WINKLMAYR等[23]研究表明大麻二酚可以通过促进软骨细胞内钙离子水平的提高，从而介导软骨细胞的过度凋亡。KIM等[24]研究表明莫能菌素通过活性氧生成和钙稳态破坏诱导PC-3前列腺癌细胞凋亡。前人的结果充分说明，钙离子与细胞的凋亡密切相关。为了探究在机械牵张应力作用下钙离子的作用，利用Fluo-3 AM探针检测各组细胞内钙离子含量，结果表明：siRNA干扰组钙离子水平较空白对照组明显降低，较过表达质粒组明显增加，而siRNA干扰+BIX02188组钙离子水平要明显低于siRNA干扰组，结果说明将Piezo1蛋白阻断后，可以抑制细胞内钙离子的释放，进而影响细胞内钙离子的稳态，而且ERK5抑制剂BIX02188抑制ERK5蛋白表达后，钙离子的含量再次降低，因此，作者推论Ca2+可以作为第二信使而存在，通过Piezo1蛋白激活的MAPK/ERK5信号通路传导力学信号，从而进一步介导滑膜细胞的凋亡。
综上所述，Piezo1蛋白的过度表达可以促进人类风湿关节炎滑膜细胞的凋亡，可能是通过MAPK/ERK5信号通路介导的。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程