抗瓜氨酸化蛋白抗体高表达类风湿关节炎动物模型的研究进展

doi:10.12307/2022.705

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (18): 2930-2937.doi: 10.12307/2022.705

• 骨与关节综述 bone and joint review • 上一篇下一篇

抗瓜氨酸化蛋白抗体高表达类风湿关节炎动物模型的研究进展

杨超1，仲格嘉2，刘春芳1，林娜1

1中国中医科学院中药研究所，北京市 100700；2中国藏学研究中心北京藏医院，北京市 100029

收稿日期:2021-09-03 接受日期:2021-11-04 出版日期:2022-06-28 发布日期:2022-01-30
通讯作者: 林娜，研究员，中国中医科学院中药研究所，北京市 100007 刘春芳，副研究员，中国中医科学院中药研究所，北京市 100007
作者简介:杨超，男，1995年生，汉族，广州中医药大学在读博士，主要从事中药抗炎免疫药理研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81974529)，项目负责人：刘春芳；国家自然科学基金面上项目(81974526)，项目负责人：林娜；北京市自然科学基金项目(7192139)，项目负责人：林娜；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(ZXKT17041)，项目负责人：刘春芳；中国中医科学院科技创新工程项目资助(CI2021A03808)，项目负责人：林娜；国家重大财政专项，项目负责人：仲格嘉

Research progress of rheumatoid arthritis animal model with high expression of anti-citrullinated protein antibodies

Yang Chao1, Zhong Gejia2, Liu Chunfang1, Lin Na1

1Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China; 2Beijing Tibetan Hospital, China Tibetology Research Center, Beijing 100029, China

Received:2021-09-03 Accepted:2021-11-04 Online:2022-06-28 Published:2022-01-30
Contact: Lin Na, Researcher, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China Liu Chunfang, Associate researcher, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China
About author:Yang Chao, Doctoral candidate, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81974529 (LCF); National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81974526 (to LN); Beijing Natural Science Foundation, No. 7192139 (to LN); Fundamental Scientific Research Expenses for Central Public Welfare Research Institute, No. ZXKT17041 (to LCF); the Science and Technology Innovation Project of China Academy of Chinese Medical Sciences, No. CI2021A03808 (to LN); National Major Financial Special Project (to ZGJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
抗瓜氨酸化蛋白抗体：是一类针对含有瓜氨酸化表位的自身抗体的总称，包括抗角蛋白抗体、抗纤维蛋白原及抗环瓜氨酸肽抗体等，其中抗环瓜氨酸肽为抗瓜氨酸化蛋白抗体的常用检测指标。抗瓜氨酸化蛋白抗体不仅在类风湿关节炎的早期诊断和病情评估中存在巨大价值，且与类风湿关节炎疾病进程以及骨破坏密切相关。
佐剂：佐剂是非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。

背景：抗瓜氨酸化蛋白抗体是类风湿关节炎特异性、早期诊断标志物，与类风湿关节炎发生发展及骨破坏的加重密切相关，该类抗体阳性患者的病情比阴性患者更严重而且更难治疗。胶原诱导型关节炎和佐剂诱导型关节炎等是典型的2种类风湿关节炎动物模型，但都不表达或不能稳定高水平表达抗瓜氨酸化蛋白抗体，从而严重影响了抗瓜氨酸化蛋白抗体阳性类风湿关节炎发病机制和治疗药物研发的深入研究。
目的：通过查阅国内外相关文献，综合分析抗瓜氨酸化蛋白抗体高表达的类风湿关节炎动物模型的研究现状，指出存在问题并提出建议。
方法：以“Rheumatoid Arthritis，ACPA”或“Rheumatoid Arthritis，anti-CCP”为英文检索词，以“类风湿关节炎、抗瓜氨酸化蛋白抗体” 为中文检索词，通过检索PubMed、Web of Science、中国知网、万方及维普数据库中2021年8月前发表的相关文献，最终纳入文献61篇进行综述分析。
结果与结论：①抗瓜氨酸化蛋白抗体高表达的类风湿关节炎动物模型建立的主要方法有抗瓜氨酸化蛋白抗体单克隆抗体诱导、瓜氨酸化蛋白诱导和牙龈卟啉单胞菌诱导等，不同的造模方法各有特点。②瓜氨酸化蛋白诱导模型报道文献最多、建模后动物关节炎特征最明显，且该类蛋白为类风湿关节炎发病的靶抗原之一，能很好地模拟人体病理变化，当属建模首选模型。③氨酸化蛋白诱导和抗瓜氨酸化蛋白抗体单克隆抗体诱导方式类似，但均具有造模剂制备繁琐和难以获得的缺点。④牙龈卟啉单胞菌诱导模型经济成本较低、造模材料相对简单易得，但缺陷是建模后易合并牙周炎等并发症。⑤因此，未来研究寻找合适的抗瓜氨酸化蛋白抗体单克隆抗体、瓜氨酸化蛋白或短肽作为免疫诱导剂，并选择遗传背景和免疫学因素与人类风湿关节炎发病适合的动物，探寻牙龈卟啉单胞菌的合理使用方法，优化造模条件，以期建立一个能反映人类抗瓜氨酸化蛋白抗体阳性类风湿关节炎疾病全过程的动物模型，这是未来类风湿关节炎研究领域的当务之急。

https://orcid.org/0000-0001-7389-1367 (杨超)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 模型, 动物, 抗瓜氨酸化蛋白抗体, 高表达, 类风湿关节炎, 牙龈卟啉单胞菌, 牙龈, 单克隆抗体, 蛋白

Abstract: BACKGROUND: Anti-citrullinated protein antibody is a specific and early diagnostic marker of rheumatoid arthritis, which is closely related to the occurrence and development of rheumatoid arthritis and the aggravation of bone destruction. The condition of patients with positive antibodies of this type is more serious and more difficult to treat than patients with negative antibodies. Collagen-induced arthritis and adjuvant-induced arthritis are two typical rheumatoid arthritis animal models, but they do not express or stably express anti-citrullinated protein antibody at a high level, which seriously affects the in-depth research regarding pathogenesis of anti-citrullinated protein antibody-positive rheumatoid arthritis and therapeutic drugs.
OBJECTIVE: To consult relevant domestic and foreign literature, to comprehensively analyze the current research status of the rheumatoid arthritis animal model with high anti-citrullinated protein antibody expression through the existing literature, to point out the existing problems, and to put forward research recommendations.
METHODS: Using “Rheumatoid Arthritis, ACPA” or “Rheumatoid Arthritis, anti-CCP” as English search terms, and “Rheumatoid Arthritis, anti-citrullinated protein antibody” as Chinese search terms, PubMed, Web of Science, CNKI, Wanfang, and VIP databases were searched for articles published before August 2021. Finally, 61 articles were included.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The methods for establishing rheumatoid arthritis animal models with high anti-citrullinated protein antibody expression include anti-citrullinated protein antibody monoclonal antibody induction, citrullinated protein induction, Porphyromonas gingivalis induction and other methods. Different modeling methods have their own characteristics. (2) The citrullinated protein induction model has the most reports and the most obvious features of arthritis. This type of protein is one of the target antigens for the onset of rheumatoid arthritis and can well simulate the pathological changes of the human body. It is the preferred model for establishment. (3) Citrullinated protein induction is the same as the anti-citrullinated protein antibody monoclonal antibody induction method. The preparation of the modeling agent is cumbersome and difficult to obtain. (4) The Porphyromonas gingivalis induction model has low economic cost and relatively simple and easy modeling materials. However, it will be combined with periodontitis and other complications. (5) Taken together, future research is to find suitable anti-citrullinated protein antibody monoclonal antibodies, citrullinated protein or short peptides as immune inducers, and select animals with genetic background and immunological factors that are suitable for the onset of human rheumatoid arthritis, and explore the rational use of Porphyromonas gingivalis, optimize the modeling conditions, and hope to establish an animal model that can reflect the entire process of human anti-citrullinated protein antibody-positive rheumatoid arthritis. This is an urgent task in the field of rheumatoid arthritis research in the future.

Key words: model, animal, anti-citrullinated protein antibody, high expression, rheumatoid arthritis, Porphyromonas gingivalis, gingiva, monoclonal antibody, protein

中图分类号:

杨超, 仲格嘉, 刘春芳, 林娜. 抗瓜氨酸化蛋白抗体高表达类风湿关节炎动物模型的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(18): 2930-2937.

Yang Chao, Zhong Gejia, Liu Chunfang, Lin Na. Research progress of rheumatoid arthritis animal model with high expression of anti-citrullinated protein antibodies[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(18): 2930-2937.

图/表（结果） 4

2.1 瓜氨酸化蛋白抗体单克隆抗体诱导模型瓜氨酸化蛋白抗体是类风湿关节炎发病过程中一类关键的致病性自身抗体[8]，其可通过活化多种免疫细胞，激活免疫活性因子发挥调控作用。一方面，这些免疫细胞的激活能够促进持续化炎症反应，导致病程反复、迁延不愈；另一方面，持续存在的炎症反应破坏局部组织，暴露大量自身抗原，促进自身免疫病理进程[9]。研究显示，瓜氨酸化蛋白抗体多克隆抗体无法诱导动物类风湿关节炎症状的产生[10]，而瓜氨酸化蛋白抗体单克隆抗体不仅能促进炎症因子的表达[11-12]，还诱导破骨细胞活化并介导骨丢失，进一步促进类风湿关节炎的病情发展[12]，这为建立瓜氨酸化蛋白抗体高表达的类风湿关节炎动物模型提供了重要思路。
如表1所示，瓜氨酸化蛋白抗体单克隆抗体诱导的类风湿关节炎模型共有7篇文献报道[13-19]，所采用的动物多选择DBA/1J，B10.Q，SKG以及BALB/c等小鼠；所采用的造模剂瓜氨酸化蛋白抗体单克隆抗体各文献报道的各不相同、不统一，基本来源于实验室自己制备，而且并不是所有报道的瓜氨酸化蛋白抗体单抗都可以直接诱导类风湿关节炎发生，如ACC1能直接诱导类风湿关节炎的发生，而ACC4则只能诱导类风湿关节炎复发并加重类风湿关节炎症状但不能直接诱导类风湿关节炎发生[14，18]；造模方法主要有2种：一种是ACC1，D10和B02等单抗单独使用，通过静脉、腹腔或关节腔注射等诱导动物出现明显的类风湿关节炎症状[12，14，16-19]，另一种是D513，ACC4等单抗结合Ⅱ型胶原(CII)或Arthrogen等免疫诱导动物类风湿关节炎发生[13-14]。

总之，通过动物注射瓜氨酸化蛋白抗体单抗，可直接诱导类风湿关节炎发生，或加重类风湿关节炎症状或诱导其复发，其中ACC1是研究较多的一类确有致病性的瓜氨酸化蛋白抗体单抗。值得注意的是：第一，瓜氨酸化蛋白抗体单抗单用诱导的类风湿关节炎临床症状普遍较轻；第二，由于动物种属、有无佐剂和所用造模方法的不同，不同实验条件下瓜氨酸化蛋白抗体单抗诱导所产生的类风湿关节炎疾病严重程度会出现差异；第三，由于单克隆抗体是由单一克隆B细胞杂交瘤产生，需经分离、纯化和内毒素检验等一系列复杂步骤后方可获得，成本高、难度大；第四，由于瓜氨酸化蛋白抗体阳性类风湿关节炎患者骨破坏并不是由某一特定的单抗导致，而更有可能是多种单抗的协同作用结果，所以用单一致病性单抗较难模拟患者体内复杂的病理状态。虽然这些不利因素可能会影响该模型的广泛使用(至今只有7篇文献报道)，但由于瓜氨酸化蛋白抗体直接用于动物，能客观反映其对类风湿关节炎发生、发展的影响，因此该造模方法是未来研究瓜氨酸化蛋白抗体阳性类风湿关节炎的重要选择之一。
2.2 瓜氨酸化蛋白诱导模型随着类风湿关节炎发病机制研究的深入，瓜氨酸化蛋白的重要程度也逐渐显现。虽然瓜氨酸化反应被认为是炎症过程中普遍存在的翻译后修饰过程，但是针对瓜氨酸化蛋白的耐受性丧失和相应产生的免疫反应几乎是类风湿关节炎所独有的[20]。甚至，一些学者认为瓜氨酸化蛋白就是诱导类风湿关节炎启动炎症反应的靶抗原，并且以瓜氨酸化蛋白为诱导剂成功建立瓜氨酸化蛋白抗体高表达的类风湿关节炎动物模型[21]。其造模方法为：首先，利用瓜氨酸化缓冲液，体外结合PAD酶催化蛋白发生瓜氨酸化反应后获取瓜氨酸化蛋白；进一步，利用瓜氨酸化蛋白免疫动物，通过适应性免疫反应诱导动物体内产生瓜氨酸化蛋白抗体。已知PAD酶有PAD 1，2，3，4，6共5种不同的亚型，分布在人体的各种组织中[22]。研究显示，在类风湿关节炎患者血清及关节滑膜内可检测到PAD2和PAD4，而未能检测到PAD1，PAD3和PAD6[23]，证明 PAD2和PAD4 是催化类风湿关节炎免疫原蛋白瓜氨酸化最可能的亚型。据此，体外瓜氨酸化实验中常用PAD2，PAD4或PAD2/PAD4 cocktail来诱导反应。
采用瓜氨酸化蛋白诱导的瓜氨酸化蛋白抗体高表达类风湿关节炎动物模型于2005年被首次报道，至今研究论文共有11篇[24-34]，是目前瓜氨酸化蛋白抗体高表达类风湿关节炎动物模型报道数量最多的一种，见表2。在该造模方法中，绝大多数(11篇中有9篇)采用瓜氨酸化蛋白与佐剂CFA、DDA、MPLA或MAA的乳化剂免疫动物，少数(仅2篇)单用瓜氨酸化蛋白免疫。在造模剂瓜氨酸化蛋白种类的选择上有多样，如瓜氨酸化CII最受欢迎有3篇文献报道，瓜氨酸化波形蛋白和瓜氨酸化波形蛋白短肽各有2篇文献报道，其他如瓜氨酸化纤维蛋白、氨酸化免疫球蛋白、瓜氨酸化人软骨蛋白聚糖、瓜氨酸化人血清白蛋白、环瓜氨酸多肽和瓜氨酸化牙龈卟啉单胞菌烯醇酶等各1篇。由于瓜氨酸化蛋白需要PAD通过酶促反应体外催化相关蛋白，并经分子生物学技术鉴定确认方可，步骤繁琐，难以获得，因此在一定程度上影响了该模型的推广应用。不过，肖长虹团队报道通过特定氨基酸序列可以合成具有免疫原性的环瓜氨酸化波形蛋白短肽，这或许可以有效降低瓜氨酸化蛋白的制备难度，为造模剂的来源提供了新的思路，该团队通过DBA/1小鼠和成年猕猴探究了该类合成肽的免疫原性，结果表明猕猴出现了十分明显的类风湿关节炎症状而小鼠的发病率仅为25%，由此可见不同物种对特定瓜氨酸化蛋白的反应性有很大差异[24-25]。总体来说，该类方法在造模动物的选择上与瓜氨酸化蛋白抗体直接诱导法类似，以DBA/1小鼠为主，也有部分选择转基因小鼠或Lewis大鼠、以及一项研究选择了与人类行为表现与神经系统结构和功能都高度相似的非人灵长类动物猕猴等。关于模型的特点，一方面，除了血清可检测到高水平表达的瓜氨酸化蛋白抗体外，关节均可出现红肿症状表现和病理特征，且绝大部分动物关节炎症状明显；需要特别注意的是，由于瓜氨酸化蛋白种类、诱导方式、注射剂量及实验动物品种和品系的不同，不同的造模方法所得的瓜氨酸化蛋白抗体的类型和表达水平也存在差异。

2.3 牙龈卟啉单胞菌诱导模型类风湿关节炎与牙周病是两种具有许多共同特征的炎症性疾病，如均具有局部炎症引起的骨丢失等 [35]。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)是一种革兰阴性厌氧球杆菌，是牙周病重要的致病菌之一[36]，也是惟一已知的产生肽酰基精氨酸脱亚胺酶(Porphyromonas gingivalis peptidylarginine deiminase，PPAD)的细菌。PPAD具有与PAD相同的生理活性，可致蛋白质瓜氨酸化，机体识别瓜氨酸化抗原后通过适应性免疫产生瓜氨酸化蛋白抗体，从而进一步诱导破骨细胞活化[37-38]，但其瓜氨酸化蛋白是片段化的，如纤维蛋白原和α-烯醇化酶被Pg产生的精氨酸特异性酶消化后的片段，不同于内源PPD产生的瓜氨酸化蛋白[39]。临床研究所证实，在类风湿关节炎患者的牙龈活检中发现牙龈卟啉单胞菌和牙龈瓜氨酸化蛋白，其血液中也含有高浓度的瓜氨酸化蛋白抗体和牙龈卟啉单胞菌抗体[40-41]。最近的一项研究证实PPAD能够瓜氨酸化天然人源蛋白质，包括纤维原蛋白、热休克蛋白、组蛋白、波形蛋白等[42]。同时，内源PAD相关的瓜氨酸化可被细菌来源的PPAD增强，并促进瓜氨酸化蛋白抗体的产生，且可能先于类风湿关节炎症状的出现[43-44]，证实了临床瓜氨酸化蛋白抗体出现于类风湿关节炎临床症状之前的认识。虽然目前类风湿关节炎与pg的相关性并不完全清楚，但利用pg诱导瓜氨酸化蛋白抗体高表达的类风湿关节炎动物模型已经被多次应用，并可用于瓜氨酸化和关节炎发展相关的机制研究[45-51]，见表3。

在表3的造模方法中，需要通过接种Pg并结合CII以及各类佐剂加强免疫，仅一篇文献报道了可以通过单独使用Pg感染建立模型，但实验周期长达8个月，这显然不利于该类模型的推广和应用[49]。Pg的接种方式包括口腔均匀涂抹、口腔注射、丝线结扎以及植入线圈等，其中口腔均匀涂抹操作简单，但常常需要每隔一两天操作1次，而后面3种方式的优缺点则恰恰相反。Pg的接种时间点上有类风湿关节炎造模剂注射之前、同时和之后3种情况，根据文献并没有发现不同的接种时间点对瓜氨酸化蛋白抗体表达量以及类风湿关节炎严重程度有明显影响。在造模动物的选择上，常选择DBA/1和SKG小鼠等，虽然也有研究人员选择DA或Lewis大鼠，其优点在于口腔接种Pg更加方便，但在造模成功率以及类风湿关节炎症状等方面，免疫易感小鼠更具优势。值得注意的是，在造模成功后，动物不仅具有关节炎临床症状特征外还有较明显的牙周炎症状，甚至还会诱导出现帕金森综合征[43]，多种并发症可能会影响发病机制的深入研究。但是，相对于前述两种造模方法，Pg感染的模型能诱导出高表达水平的瓜氨酸化蛋白抗体，且所需要的造模材料更易获取和经济，或能成为瓜氨酸化蛋白抗体阳性类风湿关节炎研究的重要选择之一。
2.4 其他建模诱导方法研究表明类风湿关节炎和HLA-DRB1等位基因有关，HLA-DR分子的作用是向辅助性T细胞呈递肽，帮助B细胞产生IgG抗体[51]。有学者选择PAD分别免疫C3H小鼠(C3H为健康小鼠，其IEβk链与β1链HLA-DRB1*04:01高度同源[52]，β1链是与人类类风湿关节炎关联最强的等位基因)和DBA/2小鼠(其IEβd链类似于HLA-DRB1*04:02，一种与类风湿关节炎无关的HLADR4亚型)，结果显示C3H小鼠产生了针对PAD的抗体和T细胞，以及针对瓜氨酸化纤维蛋白原肽的IgG抗体，而DBA/2小鼠不能。因此，研究者猜测T细胞对PAD蛋白的免疫可能通过半抗原或载体机制触发瓜氨酸化蛋白抗体，这种新的免疫方法或能构成类风湿关节炎高表达瓜氨酸化蛋白抗体小鼠模型的基础。
此外，爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)和类风湿关节炎之间也存在关联。在类风湿关节炎患者的血清中存在抗瓜氨酸化EBV肽的抗体，这表明EBV感染可能会诱导瓜氨酸化蛋白抗体的产生[53]。已有研究报道将EBV阳性和阴性类风湿关节炎患者滑膜组织的异位淋巴结构双移植到重症联合免疫缺陷小鼠中，结果显示EBV感染与类风湿关节炎滑膜中产生瓜氨酸化蛋白抗体的B细胞原位激活密切相关[54]，这或许也可以为建立瓜氨酸化蛋白抗体高表达的类风湿关节炎动物模型提供新思路。

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引言

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种世界性、难治性、全身性的自身免疫疾病[1]。瓜氨酸化蛋白抗体
(anti-citrullinated protein antibodies，ACPA)是存在于47%-84%的类风湿关节炎患者体内的一类高度特异性抗体[2]，2010年被美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟纳入类风湿关节炎的血清学诊断标准[3]，其可出现于类风湿关节炎临床症状之前，与疾病发生、发展和预后密切相关[4]。研究显示，与瓜氨酸化蛋白抗体阴性相比，瓜氨酸化蛋白抗体阳性类风湿关节炎患者具有关节破坏更严重、疾病活跃度更强、心血管疾病并发症发生率更高及预后更差等临床表现，更易发展成为难治性类风湿关节炎[5]。甚至已经有研究认为瓜氨酸化蛋白抗体阳性和瓜氨酸化蛋白抗体阴性类风湿关节炎是2种机制不同的疾病[6]。因此，选择合适的方法研究瓜氨酸化蛋白抗体阳性类风湿关节炎的发病机制及靶向瓜氨酸化蛋白抗体的治疗将是类风湿关节炎领域的研究热点。
众所周知，动物模型是研究疾病病理机制和研发创新药物的重要手段。虽然胶原诱导型关节炎和佐剂诱导型关节炎等经典类风湿关节炎动物模型能较好地模拟关节炎的临床症状和病理特征，但不表达或不能稳定高表达瓜氨酸化蛋白抗体。瓜氨酸化蛋白抗体是肽基精氨酸脱亚胺酶(peptidylarginine deiminase，PAD)瓜氨酸化的抗原，通过APC识别并递呈T细胞，进而活化B细胞并由其分泌产生的一类抗体[7]，见图1。

根据瓜氨酸化蛋白抗体的产生机制，学者们对瓜氨酸化蛋白抗体高表达的类风湿关节炎动物模型进行了许多有益的探索，并取得了一些进展。但是，目前尚没有关于瓜氨酸化蛋白抗体高表达动物模型建立的标准研究和文献综述报道。因此，文章通过梳理中外文献，依据瓜氨酸化蛋白抗体产生机制的不同进行分类，并分别从动物选择、造模方法以及模型特点等方面对瓜氨酸化蛋白抗体高表达的类风湿关节炎动物模型进行详细总结分析，以期为瓜氨酸化蛋白抗体阳性类风湿关节炎的深入研究提供依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

讨论

关于瓜氨酸化蛋白抗体高表达能导致类风湿关节炎更严重疾病严重度和骨破坏的结论已经被越来越多的学者所认可，但尚没有相应的靶向药物。目前的治疗药物中，虽有传统的抗风湿病情改善药甲氨蝶呤和生物制剂阿巴西普及托珠单抗等临床有效治疗瓜氨酸化蛋白抗体阳性这类难治类风湿关节炎患者的报道[55-58]，但相关作用仍有待进一步明确，作用机制也不清楚，且因不良反应或价格昂贵而使患者无法长期用药，这极大限制了瓜氨酸化蛋白抗体阳性患者的临床用药选择。而应用历史上千年的传统中药如雷公藤、白芍以及乌头汤复方等[59]，治疗类风湿关节炎疗效确切，具有“未病先防、既病防变”的作用特点，但由于研究基础薄弱，目前还没有被证明可用于瓜氨酸化蛋白抗体阳性类风湿关节炎的治疗。因此，迫切需要建立符合人类类风湿关节炎病理生理学特点的瓜氨酸化蛋白抗体高表达动物模型，用于中药创新药物筛选及作用机制研究，为传统中药在类风湿关节炎精准治疗领域开拓新视野。
类风湿关节炎动物模型以胶原诱导性关节炎、佐剂性关节炎、降植烷诱导性关节炎等常见，但这些普遍不能表达高水平瓜氨酸化蛋白抗体抗体，且由于胶原、佐剂、降植烷等诱导剂并非人体启动类风湿关节炎反应的靶抗原，也并不能较好地模拟人类类风湿关节炎临床症状出现之前的病理过程。而瓜氨酸化蛋白抗体是人体类风湿关节炎产生的重要致病型抗原之一，且出现在类风湿关节炎临床症状出现之前，其高表达的类风湿关节炎将能更好地用于考察类风湿关节炎机体发病过程、疾病特点、药物作用机制以及难治性类风湿关节炎的靶向治疗等。因此，文章首次提出瓜氨酸化蛋白抗体高表达类风湿关节炎动物模型的理念，且通过对大量文献进行总结，归纳瓜氨酸化蛋白抗体高表达模型的建立方式，并分析其优缺点，供研究者参考。
根据瓜氨酸化蛋白抗体的产生机制，研究证实通过瓜氨酸化蛋白抗体单克隆抗体诱导、瓜氨酸化蛋白诱导以及牙龈卟啉单胞菌感染等多种方式均可成功建立瓜氨酸化蛋白抗体高表达的类风湿关节炎动物模型。但是由于动物模型研究领域中尚没有瓜氨酸化蛋白抗体阳性类风湿关节炎的定义，目前的研究均是通过设计对照组而确定的实验组瓜氨酸化蛋白抗体相对高表达，且不同的研究报道瓜氨酸化蛋白抗体表达水平各不同。因此，至今没有形成一个规范的瓜氨酸化蛋白抗体高表达类风湿关节炎动物模型的建立标准和规范，亟待解决。需要注意的是，文章引用的实验报道中虽然能检测到高表达水平的瓜氨酸化蛋白抗体，但研究者都不是以建立瓜氨酸化蛋白抗体高表达类风湿关节炎动物模型为研究目的，所采用的造模方法各不相同、各有利弊，且尚处于探索阶段，亟需对瓜氨酸化蛋白抗体高表达类风湿关节炎动物模型进行深入研究。具体各种造模优缺点见表4。

文章所列举的动物模型还存在一些不足之处。首先，造模动物的选择不统一：通过对所列文献中所用动物种属次数进行排序，排在前3位的依次是DBA/1小鼠(7篇)、SKG小鼠(4篇)和转基因小鼠(3篇)，其中DBA/1和SKG小鼠是公认的类风湿关节炎免疫易感动物[60-61]，而转基因小鼠的特点和优势在于能为疾病发病机制的研究提供更好的平台，有一篇文献以猕猴为模型动物建模，且取得了良好的瓜氨酸化蛋白抗体表达水平和显著的类风湿关节炎症状，但是由于猕猴模型成本极高、操作难度较大，这将限制此类模型动物的广泛使用。其次，瓜氨酸化蛋白抗体产生与关节炎症状出现的时间不统一：临床患者瓜氨酸化蛋白抗体产生于类风湿关节炎症状出现之前，而在该文所列的文献中，绝大部分实验的瓜氨酸化蛋白抗体产生和类风湿关节炎发病时间几乎重叠，且在CII以及各类佐剂的强烈诱导下，高水平瓜氨酸化蛋白抗体对实验动物的影响常会被掩盖，这是因为各造模剂给予的时间和顺序不同所致，因此进行相关研究时应慎重考虑造模剂的使用策略。近期，课题组选择免疫易感的DBA/1小鼠和最为常用的SD大鼠为造模动物，对Pg诱导的瓜氨酸化蛋白抗体高表达动物模型做了有益的探索，实验结果初步显示单独使用含菌混悬液涂抹大小鼠牙龈均难以使Pg定植，常需要结合牙龈注射或槽牙丝线结扎等操作；同时，大小鼠虽然均能出现瓜氨酸化蛋白抗体表达高水平，但DBA/1小鼠的维持时间明显更长、水平更高、也更稳定，这些结果仍需进一步验证。
综上所述，文章开创性地对瓜氨酸化蛋白抗体高表达类风湿关节炎动物模型的相关文献进行总结分析，结果显示该模型尚处于探索阶段，需要深入研究。在后续的研究中，寻找合适的瓜氨酸化蛋白抗体单抗、瓜氨酸化蛋白或短肽作为免疫诱导剂，并选择遗传背景、免疫学等与人类类风湿关节炎发病适合的动物，合适pg的使用方法，优化造模条件，建立一个能反映人类瓜氨酸化蛋白抗体阳性类风湿关节炎疾病全过程的动物模型，是类风湿关节炎研究领域的当务之急。这对深入探讨瓜氨酸化蛋白抗体阳性类风湿关节炎的发病机制和新药研发，特别是针对瓜氨酸化蛋白抗体阳性类风湿关节炎患者超早期和早期防治的创新药物研发具有划时代意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

抗瓜氨酸化蛋白抗体高表达类风湿关节炎动物模型的研究进展

Research progress of rheumatoid arthritis animal model with high expression of anti-citrullinated protein antibodies

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