五脏温阳化瘀汤含药血清干预阿尔茨海默症细胞模型磷酸化tau蛋白的变化

doi:10.12307/2022.146

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (7): 1068-1073.doi: 10.12307/2022.146

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五脏温阳化瘀汤含药血清干预阿尔茨海默症细胞模型磷酸化tau蛋白的变化

温小雨，孙玉浩，夏猛

广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530000

收稿日期:2020-10-22 修回日期:2020-10-24 接受日期:2020-11-28 出版日期:2022-03-08 发布日期:2021-10-29
通讯作者: 夏猛，博士，副教授，广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530000
作者简介:温小雨，女，1995年生，广东省梅州市人，广西中医药大学在读硕士，主要从事中医藏象理论的基础与应用研究。
基金资助:
广西中医药大学第一批“歧黄工程”高层次人才团队培育项目(2018001)，项目负责人：夏猛；国家自然科学基金地区基金项目(81860805) ，项目负责人：夏猛；中医基础研究重点实验室系统课题(KJT14004，KJT1701202)，项目负责人：夏猛

Effects of serum containing Wuzang Wenyang Huayu Decoction on phosphorylated-tau protein expression in Alzheimer’s disease cell model

Wen Xiaoyu, Sun Yuhao, Xia Meng

Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2020-10-22 Revised:2020-10-24 Accepted:2020-11-28 Online:2022-03-08 Published:2021-10-29
Contact: Xia Meng, MD, Associate professor, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Wen Xiaoyu, Master candidate, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the First Batch of "Qihuang Project" High Level Talent Team Cultivation Project of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, No. 2018001 (to XM); the Regional Fund of National Natural Science Foundation of China, No. 81860805 (to XM); the Key Laboratory System of Basic Research of Traditional Chinese Medicine, No. KJT14004, KJT1701202 (to XM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
五脏温阳化瘀汤含药血清：原方为补肾健脾方的化裁，在临床中对阿尔茨海默症患者具有良好的疗效，通过对大鼠灌胃五脏温阳化瘀汤的方法，分离获得大鼠富含药物成分血清，用于体外细胞培养实验，研究药物的药理机制。
阿尔茨海默症细胞模型：获取孕17 d C57BL/6小鼠新生鼠海马中的原代神经元细胞，使用β-淀粉样多肽(1-42)干预小鼠原代神经元细胞，构建实验需要的阿尔茨海默症细胞模型。
背景：前期各项研究表明，五脏温阳化瘀汤对阿尔茨海默症具有良好的治疗效果，但其药理机制尚未完全阐明。
目的：探讨五脏温阳化瘀汤含药血清对阿尔茨海默症细胞模型过氧化物酶体增殖物激活受体γ和磷酸化tau蛋白表达的影响。
方法：通过β-淀粉样蛋白干预原代海马神经元细胞建立阿尔茨海默症细胞模型，给予五脏温阳化瘀汤含药血清、盐酸多奈哌齐含药血清干预72 h，采用免疫荧光法检测原代神经细胞树突长度及分支数，Western blot检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ和磷酸化tau蛋白表达。
结果与结论：与空白对照组比较，模型组神经元细胞树突长度及分支数明显下降(P < 0.05)，过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白表达下降，磷酸化tau蛋白表达升高(P < 0.05或P < 0.01)；与模型组比较，五脏温阳化瘀汤组与盐酸多奈哌齐组神经元树突长度及分支数增加，过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白表达升高，磷酸化tau蛋白表达显著下降(P < 0.05或P < 0.01)。结果表明，五脏温阳化瘀汤对β-淀粉样蛋白干预的阿尔茨海默症细胞模型具有神经保护作用，其机制可能与上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白表达，抑制Tau蛋白的磷酸化相关。

https://orcid.org/0000-0002-2973-6500 (夏猛)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 神经元, 阿尔茨海默症, 五脏温阳化瘀汤, β-淀粉样蛋白, 过氧化物酶体增殖物激活受体γ, 磷酸化tau蛋白

Abstract: BACKGROUND: Various previous studies have shown that Wuzang Wenyang Huayu Decoction has a good therapeutic effect on Alzheimer’s disease, but its pharmacological mechanism has not been fully elucidated.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Wuzang Wenyang Huayu Decoction drug-containing serum on the expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ and phosphorylated-tau protein in Alzheimer’s disease cell model.
METHODS: Beta amyloid protein was used to induce primary hippocampal neurons to establish the currently recognized Alzheimer’s disease cell model. Wuzang Wenyang Huayu Decoction drug-containing serum and donepezil hydrochloride drug-containing serum were given for intervention for 72 hours. The dendritic length and branch number of primary neurons cells were detected by immunofluorescence assay. The expression levels of peroxisome proliferator-activated receptor γ and phosphorylated-tau protein were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the length and branch number of dendritic cells in the model group were significantly decreased (P < 0.05), peroxisome proliferator-activated receptor γ expression decreased, and phosphorylated-tau protein increased (P < 0. 05 or P < 0. 01). Compared with the model group, the dendritic length and branch number of neurons in Wuzang Wenyang Huayu group and donepezil hydrochloride group increased, the expression of PPARγ increased, and the expression of phosphorylated-tau protein significantly decreased (P < 0. 05 or P < 0. 01). Results confirmed that Wuzang Wenyang Huayu Decoction has neuroprotective effect on Alzheimer’s disease cells induced by beta amyloid protein, and its mechanism may be related to upregulation of peroxisome proliferator-activated receptor γ protein and inhibition of phosphorylated-tau protein.

Key words: neuron, Alzheimer’s disease, Wuzang Wenyang Huayu Decoction, beta amyloid protein, peroxisome proliferator-activated receptor γ, phosphorylated-tau protein

中图分类号:

温小雨, 孙玉浩, 夏猛. 五脏温阳化瘀汤含药血清干预阿尔茨海默症细胞模型磷酸化tau蛋白的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1068-1073.

Wen Xiaoyu, Sun Yuhao, Xia Meng. Effects of serum containing Wuzang Wenyang Huayu Decoction on phosphorylated-tau protein expression in Alzheimer’s disease cell model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(7): 1068-1073.

图/表（结果） 4

2.1 五脏温阳化瘀汤含药血清对小鼠海马神经元β-淀粉样蛋白表达的影响对照组、空白对照组、模型组、五脏温阳化瘀汤组、盐酸多奈哌齐组海马神经元β-淀粉样蛋白的表达分别为0.82±0.17，0.82±0.13，3.11±0.12，1.45±0.12，1.09±0.15；对照组与空白对照组之间差异无显著性意义，说明大鼠空白血清对β-淀粉样蛋白表达无明显影响。与空白对照组比较，模型组经β-淀粉样多肽(1-42)寡聚体造模后，β-淀粉样蛋白异常表达明显上升(P < 0.01)，表明造模成功；与模型组比较，五脏温阳化瘀汤组和盐酸多奈哌齐组β-淀粉样蛋白表达明显下降，可能与含药血清干预后改善β-淀粉样蛋白的异常聚集有关(P < 0.01)，可见五脏温阳化瘀汤含药血清干预对β-淀粉样蛋白的异常表达具有明显的改善作用，见图1。

2.2 五脏温阳化瘀汤含药血清对阿尔茨海默症 C57BL/6小鼠海马神经元形态的影响对照组、空白对照组、模型组、五脏温阳化瘀汤组、盐酸多奈哌齐组海马神经元树突长度(μm)分别为719.94±49.45，747.52±62.10，523.14±47.21，636.29±55.43，664.49±39.59；对照组与空白对照组之间差异无显著性意义，说明大鼠空白含药血清对神经元树突长度无明显影响。对照组、空白对照组、模型组、五脏温阳化瘀汤组、盐酸多奈哌齐组海马神经元树突分支数量分别为10.38±0.60，12.22±0.71，5.25±0.43，7.75±0.39， 8.91±0.72；对照组与空白对照组之间差异无显著性意义，说明大鼠空白血清对神经元树突分支无明显影响。
与空白对照组比较，模型组神经元树突长度及分支数明显下降(P < 0.01)，说明造模成功；与模型组比较，五脏温阳化瘀汤组和盐酸多奈哌齐组神经元树突长度及分支数显著上调，可能与含药血清干预后对神经元的保护作用有关(P < 0.01)；五脏温阳化瘀汤组与盐酸多奈哌齐组比较，总长度差异无显著性意义，分支数差异有显著性意义(P < 0.01)，盐酸多奈哌齐组分支数多于五脏温阳化瘀汤组，见图2。

2.3 五脏温阳化瘀汤含药血清对阿尔茨海默症 C57BL/6小鼠海马神经元PPARγ蛋白表达的影响对照组、空白对照组、模型组、五脏温阳化瘀汤组、盐酸多奈哌齐组海马神经元PPARγ蛋白的表达分别为1.42±0.08，1.48±0.09，0.98±0.05，1.12±0.05，1.22±0.06；对照组与空白对照组比较差异无显著性意义，说明空白含药血清对神经元细胞无明显影响。与空白对照组比较，模型组PPARγ蛋白表达下降(P < 0.01)，表示造模成功；与模型组相比，经五脏温阳化瘀汤及盐酸多奈哌齐含药血清干预后，PPARγ蛋白表达上升(P < 0.05，P < 0.01)，五脏温阳化瘀汤组与盐酸多奈哌齐组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.4 五脏温阳化瘀汤含药血清对阿尔茨海默症 C57BL/6小鼠海马神经元磷酸化tau 蛋白表达的影响对照组、空白对照组、模型组、五脏温阳化瘀汤组、盐酸多奈哌齐组海马神经元磷酸化tau 蛋白的表达分别为0.40±0.06， 0.56±0.09，0.89±0.08，0.68±0.09，0.46±0.07；对照组与空白对照组比较差异无显著性意义，说明空白含药血清对神经元细胞无明显影响。与空白对照组比较，模型组海马神经元磷酸化tau 蛋白表达明显升高，差异有显著性意义(P < 0.01)，表明造模后Tau蛋白的异常磷酸化升高；与模型组相比，五脏温阳化瘀汤组、盐酸多奈哌齐组磷酸化tau 蛋白表达明显降低(P < 0.05，P < 0.01)，盐酸多奈哌齐组磷酸化tau 蛋白表达更低，与五脏温阳化瘀汤组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

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引言

阿尔茨海默症是一种中枢神经退行性疾病，其主要病理特征为过度磷酸化的 Tau 蛋白异常集聚形成的神经纤维缠结、毒性β-淀粉样蛋白引起的老年斑以及一些神经细胞的异常改变。脑内β-淀粉样蛋白聚集产生的神经毒性是阿尔茨海默症发病的核心因素[1-2]。阿尔茨海默症发病原因往往是多基因、多因素共同作用的结果，采用单一疗法难以取得理想的疗效，目前尚缺少特效药，现有治疗药物如盐酸多奈哌齐片、他克林、卡巴拉汀等短期内能改善患者症状，延缓疾病发展，但并不能从根本上改变过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-acti vated receptor γ，PPARγ)的下调以及Tau蛋白的过度磷酸化[3]。相关研究发现蛋白激酶Akt介导β-淀粉样蛋白导致的钙通道磷酸化及钙通道异常开放，同时PPARγ可与β-淀粉样蛋白降解酶IDE启动子中的PPRE结合调控IDE基因转录，从而促进β-淀粉样蛋白降解[4]。
五脏温阳化瘀汤为自拟方，在临床上颇有疗效[5]，同时多项研究表明，该方对阿尔茨海默症具有一定的治疗作用[6-7]，其中包括抑制Tau蛋白过磷酸化、减轻神经元纤维缠结、改善β-淀粉样蛋白异常沉积。五脏温阳化瘀汤是广西中医药大学唐农教授经验方，主要组成为附子、巴戟、半夏、干姜、桂枝、田七、石菖蒲、大黄、淫羊藿、生晒参等。陈炜等[8]将60例患者随机分为五脏温阳化瘀治疗组和盐酸多奈哌齐组，每组30例，五脏温阳化瘀组总有效率为86.67%，盐酸多奈哌齐组为73.33%；梁晓兵[9]也发现五脏温阳化瘀汤不仅可以改善老年痴呆患者认知功能，且对疾病预后好转有明显效果；同时唐农等[10]与翟阳等[11]提出五脏温阳化瘀胶囊对阿尔茨海默症患者行为能力和生活质量的改善不仅优于吡拉西坦和尼莫地平胶囊，而且脑神经递质去甲肾上腺素、多巴胺、乙酞胆碱等指标均优于尼莫地平组。五脏温阳化瘀汤较盐酸多奈哌齐治疗阿尔茨海默症有优势，可能与中医辨证论治有关，向军军[12]研究显示五脏温阳化瘀汤对阳虚型血管性痴呆患者疗效确切，优于多奈哌齐。前期各项研究表明，五脏温阳化瘀汤对阿尔茨海默症具有良好的治疗效果，但其药理机制尚未完全阐明[13]。该研究在前期工作基础上，进一步通过细胞实验观察五脏温阳化瘀汤含药血清对阿尔茨海默症神经元细胞模型树突生长发育以及PPARγ、磷酸化tau 蛋白表达的影响，进一步探讨其神经保护的作用机制。

材料方法

1.1 设计原代神经元细胞获取且进行体外细胞实验。
1.2 时间及地点实验于2019年7-9月在广西中医药大学科学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级8周龄雄性SD大鼠30只，体质量(250±20) g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[SCXK (湘) 2016-0002]，用于制备含药血清。孕17 d C57BL/6小鼠，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[SCXK(沪)2018-0016]，用于获取原代神经元细胞。实验大鼠均于广西中医药大学科学实验中心实验动物部动物房饲养，温度(20±2) ℃，相对湿度(55±15)%。所有动物实验操作均严格遵循实验动物管理相关条例及保护准则，且通过广西中医药大学伦理委员会的动物实验伦理审查。
1.3.2 实验药物及制备中药材制附子15 g、三七15 g、巴戟天15 g、石菖蒲15 g、桂枝15 g、法半夏15 g、干姜15 g、淫羊藿15 g、熟大黄 6 g、生晒参15 g，均购于广西中医药大学第一附属医院，经广西中医药大学中药植化室鉴定符合要求后使用。盐酸多奈哌齐片(国药准字H20010723，5 mg/片，
重庆植恩药业有限公司)。
药物处置方法：①五脏温和化瘀汤：所有中药材加纯水回流提取2次，第1次加10倍水提取2 h，第2次加8倍水提取1.5 h，药液过滤，合并浓缩至含生药浓度1 g/mL，分装后4 ℃无菌保存备用；②盐酸多奈哌齐：按照人与大鼠体表面积换算关系，取盐酸多奈哌齐8片碾碎，溶于76.2 mL蒸馏水制成混悬液，使药物浓度为0.525 g/L。
1.3.3 实验试剂 PPARγ抗体(ab45036)、磷酸化tau 蛋白抗体(ab109390)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)(ab205718)、MAP-2抗体(ab183830)购于Abcam公司；β-淀粉样多肽(1-42)购于上海吉尔生物公司；β-actin抗体(TA-09) 购于北京诺博莱德科技有限公司；青霉素-链霉素、胰蛋白酶抑制剂、体积分数为5%胎牛血清购于Sigma-Aldrich公司；DMEM/F12(1∶1) 购于美国HyClone公司；Neurobasal培养基购于赛默飞公司；Hepes缓冲液、Hank平衡盐溶液购于Amresco公司；B-27、Glutamax购于Bedford公司。
1.3.4 实验仪器正置荧光显微镜(BX41型，Olympus公司)；Zeiss 510共聚焦显微镜(Oberkochen公司)；制胶架、垂直电泳仪、湿电转膜仪(Bio-Rad公司)；倒置显微镜(E200，Nikon公司)；解剖显微镜(XTL-2400，上海唯准光学仪器有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 含药(对照)血清制备 SPF级SD大鼠30只，分成空白组、五脏温阳化瘀汤组、盐酸多奈哌齐组，每组10只。五脏温阳化瘀汤组、盐酸多奈哌齐组分别给予药物灌胃处理，空白组给予等量生理盐水灌胃，灌胃前预热药液。基于课题组前期研究发现使用五脏温阳化瘀汤高剂量组(5 g/kg)比低剂量组(1.25 g/kg)及中剂量组(2.5 g/kg)有较好疗效[14]，因此将中药浓缩后生药浓度控制为1 g/mL，以5 mL/kg灌胃，盐酸多奈哌齐组则以1 mL/kg灌胃。参照文献[15-16]，连续灌胃7 d，1次/d，末次给药后2 h行腹主动脉采血(5 mL/只)，4 ℃1 500 r/min离心10 min，取上清即为含药血清，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装灭活保存。
1.4.2 原代神经元细胞获取孕17 d的C57BL/6小鼠吸入CO2麻醉后，取出胎鼠，在冰上速冻后迅速断头，取出海马放入盛有Hank平衡盐溶液的培养皿中，加入0.1%胰酶在30 ℃下消化15 min，加入胰蛋白酶抑制剂终止消化，加入含体积分数为5%胎牛血清的Neurobasal培养基进行重悬(含B-27、谷氨酰胺、0.1%青霉素-链霉素)，转移至24孔培养板，第2天更换含体积分数为1%胎牛血清的Neurobasal培养基，以支持神经元生长，第3天向培养基中添加2 μmol/L阿糖胞苷以抑制神经胶质细胞增殖，以后每两三天进行半量换液。

1.4.3 阿尔茨海默症细胞模型构建及分组根据郑衍芳等[17-18]方法构建阿尔茨海默症细胞模型，用灭菌纯水稀释β-淀粉样多肽(1-42)，使其浓度达到2.5 mmol/L，37 ℃水浴箱中孵育3 d，待其变为聚集状态时，与小鼠原代神经元细胞共同培养24 h，随机分为以下5组：①对照组：神经元细胞+Neurobasal培养液；②空白对照组：神经元细胞+Neurobasal培养液+体积分数为10%空白血清；③模型组：神经元细胞+Neurobasal培养液+体积分数为10%空白血清+β-淀粉样多肽(1-42)；④五脏温阳化瘀汤组：神经元细胞+Neurobasal培养液+体积分数为10%五脏温阳化瘀汤含药血清+β-淀粉样多肽(1-42)；⑤盐酸多奈哌齐组：神经元细胞+Neurobasal培养液+体积分数为10%盐酸多奈哌齐含药血清+β-淀粉样多肽(1-42)。
1.4.4 免疫荧光检测含药血清干预72 h，将各组神经元细胞用PBS冲洗3次，在20 ℃下用40 g/L多聚甲醛在含4%蔗糖的PBS中固定1 min，含有0.2% Triton X-100的PBS混合体积分数为5%山羊血清在20 ℃封闭1 h，加入MAP-2一抗4 ℃孵育过夜，用含Triton X-100的PBS洗涤，加入相应的荧光偶联二抗在20 ℃孵育1 h，贴片、封固，通过共聚焦显微镜观察具有连续树突的MAP-2染色神经元，IMaris图像分析系统分析树突总长度、树突分支数量。
1.4.5 Western blot检测含药血清干预72 h，取各组神经元细胞，用含PMSF的RIPA细胞裂解液冰上裂解细胞15 min，BCA法进行蛋白定量，连接电泳装置及电源，120 V恒压1.5 h
后停止电泳；用含5%脱脂奶粉的TBST溶液在室温下封闭膜2 h，加入新鲜封闭液稀释的β-淀粉样蛋白、PPARγ、磷酸化tau 蛋白、β-actin一抗4 ℃孵育过夜；加入封闭液稀释的二抗室温下孵育膜1 h，PBST洗膜；加入ECL，在凝胶成像仪下曝光成像。采用Image Pro-Plus 6.0软件检测蛋白灰度值，以β-淀粉样蛋白、磷酸化tau 蛋白、PPARγ灰度值与β-actin灰度值的比值来表示蛋白相对表达水平。
1.5 主要观察指标 ①原代神经元细胞形态；②各组神经元细胞树突长度及分支数；③各组神经元细胞中β-淀粉样蛋白、PPARγ、磷酸化tau 蛋白的表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行多组样本间均数比较，计量数据均服从正态分布，以x±s表示，方差齐性数据采用单因素方差分析，组间相互比较采用LSD-t检验，
P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

阿尔茨海默病的主要表现为进行性记忆力下降，发病部位多见于脑，与五脏有密切的联系，在中医理论之中，“血、脉、营、气、精神，此五脏之所藏也，至其淫泆离脏则精失、魂魄飞扬、志意恍乱、智虑去身者”。人的精神变动都与人的五脏有密切关系，五脏各司其职，五脏虚衰则会出现气阴两虚，而生瘀阻。阳气亏损，阴液耗伤，则不能充养脑髓，气血津液则会阻滞生瘀，最终发展为脑失濡养，髓少精亏而神智失用[19]。唐农等[20]认为，老年人五脏虚损，脏腑阳气亏损容易出现痴呆之症，提出“五脏阳虚，痰瘀阻窍”是老年痴呆的关键病机，因此提出五脏温阳化瘀之法治疗老年痴呆。五脏温阳化瘀汤以温补五脏阳气、化痰逐瘀为法，方中附子、淫羊藿相须为用，相互协作，作为君药起温补肾阳之功；干姜温肺脾之阳，发挥回阳通脉的功效；桂枝具有温阳化气、温经通脉，能够助心阳；半夏则能化痰浊；巴戟天、田七，前者温肝阳助肾阳，后者活血化瘀[21-22]。全方共奏具有通阳元、益脑、消除痰凝瘀血、促进脏腑气化的功效，对阿尔茨海默症具有明显改善学习记忆功能的疗效。前期相关实验表现，PPARγ激动剂噻唑烷二酮类药物能减轻神经退行性病变且抑制促炎因子的表达，改善患者和动物模型的认知能力[23]。同时，五脏温阳化瘀汤通过减少PKA催化亚基或抑制蛋白磷酸酶2A甲基化，从而抑制Tau蛋白异常磷酸化及神经纤维缠结，发挥改善认知的作用[24-25]。
王金春等[26]认为阿尔茨海默病的发病关键因素是神经元β-淀粉样蛋白的沉积及神经元纤维缠结导致的神经元功能障碍，过度沉积的β-淀粉样蛋白引起突触传递障碍，进而导致突触丢失以及神经元死亡，最终影响神经元之间的信息传导和神经环路障碍[27]。β-淀粉样蛋白集聚形成老年斑，导致海马胆碱能神经元及其突触的大量丢失，进一步出现神经元内tau蛋白的异常，由此可见β-淀粉样蛋白具有加速神经细胞的退化作用[28]。相关研究发现激活PPARγ能够让IDE转录增加，以此促进β-淀粉样多肽(1-42)降解，因此激活PPARγ从而抑制小胶质细胞炎症反应而发挥神经保护作用[29]。通过药物激活脑中PPARγ能够抑制炎症反应，清除更多异常沉积的β-淀粉样蛋白，减少磷酸化Tau蛋白产生[30-31]。阿尔茨海默症会导致β-淀粉样多肽(1-42)蛋白前体的代谢障碍，因此β-淀粉样蛋白与疾病的发生与发展密切相关，该实验可见模型组原代神经元细胞中β-淀粉样蛋白和磷酸化tau 蛋白的表达均升高，而五脏温阳化瘀汤能够减少β-淀粉样蛋白在细胞中的表达水平。
PPARγ是位于人类3号染色体(3p25)短臂上的一种配体激活型转录因子。PPARγ可作为海马神经的重要保护靶点[32-33]。PPARγ 激活或者受体过表达均能够显著清除神经元和非神经细胞中的β-淀粉样蛋白异常沉积，从而改善β-淀粉样蛋白聚集导致的认知障碍，进一步证实PPARγ 的活化有可能作为包括阿尔茨海默症在内的神经退行性疾病、脑损伤等潜在的药物治疗靶点[34]。
Tau蛋白在神经元细胞中发挥关键作用，Tau 蛋白的异常磷酸化导致其与微管蛋白的结合力显著减退，导致其微管装配形成功能难以发挥作用，从而出现神经纤维缠结的现象，产生淀粉样蛋白斑块，成为痴呆的标志性病理标志物。由于神经元微管结构遭到破坏，出现相应的功能障碍，导致细胞突触丢失以及神经元功能损伤，从而发展成神经退行性病变[35-36]。
近年来，有研究表明PPARγ 的激动剂可能对轻中度的阿尔茨海默症患者产生有益影响。在小鼠海马中，高亲和力的PPARγ能够清除过度表达的β-淀粉样蛋白或抑制β-淀粉样蛋白活性，因此，当β-淀粉样蛋白减少或被抑制时可能使Tau蛋白引起的神经纤维缠结减少，达到挽救空间记忆受损和改善小鼠认知功能的作用[37]。
研究结果发现，五脏温阳化瘀汤含药血清干预β-淀粉样多肽(1-42)诱导的小鼠阿尔茨海默症体外细胞模型，上调了PPARγ表达，使β-淀粉样蛋白的活性被抑制，进而减少Tau蛋白的过度磷酸化，与盐酸多奈哌齐片无明显差异。由此推断，五脏温阳化瘀汤对神经元发育具有保护作用，其改善细胞炎症状态与保护神经的作用机制可能与中药多靶点多成分的特点有关。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

五脏温阳化瘀汤含药血清干预阿尔茨海默症细胞模型磷酸化tau蛋白的变化

Effects of serum containing Wuzang Wenyang Huayu Decoction on phosphorylated-tau protein expression in Alzheimer’s disease cell model

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