2.1  实验动物数量分析  实验所用66只新西兰大白兔均进入最终的结果分析。

2.2  实验动物行为学评分结果  模型组在进行右侧面神经上颊支压榨性损伤后，所有兔均出现患侧口角歪斜下垂，触须倒伏且运动减弱，眼睑上抬不能等面瘫症状，总分为5分。术后14 d以前，模型对照组及电针组动物面瘫症状无明显改善，实验动物行为学评分总分均大于3分；术后14 d以后，电针组动物面瘫症状逐渐减轻，总分逐渐降低，至术后28 d，电针组动物面瘫基本恢复完全(其中4只动物总分为0分)，而模型对照组在观察期内未恢复完全，总分仍高于3分，见图1。

2.3  面神经元定位及形态观察  为进行面神经元在脑干组织定位，实验进行苏木精-伊红染色，面神经元定位于中下部脑桥腹外侧，可见大多角形运动神经元团聚，胞质均匀红染，可见虎斑状的尼氏小体，细胞核大而圆，居中，蓝染。周围面神经损伤后4 d，两组神经元均出现胞体收缩，由多角形变为圆形或椭圆形，神经元与周围组织间隙增大，尼氏体减少或消失，核仁移位到周边等病理表现，但电针组程度较模型对照组轻。

术后第14天，电针组均可见部分神经元形态明显恢复，至术后28 d，电针组面神经元均形态基本恢复至术前，模型对照组面神经元可见部分恢复。

2.4  尼氏体的变化  尼氏体可作为观察神经元功能状态的灵敏指标^[17]。尼氏染色可见面神经元呈多角形，核周质中尼氏体染色呈紫色“虎斑”样，背景接近无色。术后4 d，两组均出现神经元分散，胞体收缩，胞内结构模糊，尼氏体减少、模糊甚至消失；术后7 d，电针组部分尼氏体再现，呈细颗粒状；术后14 d，电针组尼氏体形态基本恢复至术前，胞体大小逐渐恢复正常，模型对照组始开始逐渐恢复。尼氏染色的切片计数200倍镜下的面神经元数目，模型对照组和电针组术后各观察时间点与正常组比差异无显著性意义(P > 0.5)，见图2。

2.5  GDNF的免疫表达  在将兔面神经元组织进行苏木精-伊红染色确定面神经元定位后，予以行免疫组织化学染色。结果显示，GDNF阳性表达表现为胞质棕黄色深染。正常兔面神经元弱表达GDNF，免疫染色较淡；模型对照组及电针组面神经元细胞GDNF都有不同程度的表达。电针组面神经元组织GDNF的表达(阳性细胞数)，除术后1 d，在术后其余各时间点均高于正常组和模型对照组(P < 0.01)，见图3。

2.6  GDNF/PI3K/AKT通路的定量蛋白表达  与同一时期与模型对照组相比较，电针组的 GDNF、PI3K、P-AKT蛋白表达水平明显升高，有显著差异，而两组的总AKT蛋白表达基本相当，无明显差异，见图4。

周围性面瘫常由炎症、病毒感染、创伤、颅内外肿瘤以及脑桥延髓损伤引起^[1]，面神经损伤所致面瘫不仅会对患者造成严重的情感和心理创伤，而且面神经延迟或不完全恢复会造成严重的功能缺陷。据流行病学调查，周围性面瘫在中国的发病率高达4.25‰^[2]。目前，药物如皮质激素、抗病毒药物、血管扩张剂、维生素，物理治疗如按摩、功能训练，手术如面神经减压、面神经吻合术、整容手术等常用于周围性面瘫的治疗，但治疗效果仍然难以保证，临床上多只用于严重病例^[3-4]。

针灸在中国有着悠久的历史，作为神经损伤的替代或补充治疗，用于帮助恢复功能障碍(包括感觉运动障碍、认知障碍和抑郁症)以及疾病后康复，且没有明显的不良反 应^[5]。面瘫是针灸治疗最常见的疾病之一，疗效明确^[6]。翳风、颊车、四白、地仓、阳白和颧髎穴是治疗周围性面瘫最常选用的穴位^[7]。作者之前的研究也证实，于上述穴位进行电针可以促进面神经再生^[8]。然而，电针促进面神经元恢复的具体机制尚不清楚。

作为转化生长因子β超家族成员，胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)是目前促进体外运动神经元存活的最有效因子，不仅能使面神经元在体内保持活力，而且也是已知的唯一能预防轴突诱导运动神经元萎缩的因子^[9]。在颊车穴施以高频和长期的电针刺激，可能通过GDNF和PI3K/AKT信号通路诱导糖尿病大鼠肠内神经元的再生^[10]。

因此，实验假设电针可通过上调GDNF在面神经元中的表达，激活PI3K/AKT信号通路，从而发挥对面神经元的保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  随机分组对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年5月至2018年6月在西南医科大学实验动物中心以及附属医院中心实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  由西南医科大学实验动物中心提供成年健康新西兰大白兔66只，动物生产许可证号SCXK(川) 2018-17。雌雄各半，体质量3.5-5.5 kg，雌雄各半，单笼饲养，专用饲料喂食，不限水，但在手术前12 h禁食禁饮。动物室7：00-19：00进行人工照明。实验经西南医科大学动物伦理学委员会批准，实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

1.3.2  实验用主要试剂及仪器  电针仪(青岛鑫升公司)；一抗、二抗(Abcam公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(上海索莱宝公司)；免疫组化试剂盒(武汉博士德公司)；蛋白抽提试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；荧光显微镜(OLYMPUS公司)；蛋白质垂直电泳槽、稳压稳流电泳仪、图像分析软件(美国BIO-RAD公司)。

1.4  方法

1.4.1  实验动物分组  将66只成年健康新西兰大白兔，随机分成正常组(n=6)和模型组(n=60)。模型组动物均制作右侧面神经颊支压榨性损伤的病理模型，再将其随机分为模型对照组(n=30)和电针组(n=30)。

1.4.2  模型制备  60只模型组动物均做右侧面神经颊支压榨性损伤的病理模型^[11]。动物固定于兔台，10%水合氯醛(3.5 mL/kg)行腹腔注射麻醉成功后，右侧面部备皮、消毒、铺无菌孔巾，于口角与外耳连线、瞳孔下方约2 cm处作长约3 cm斜行切口，钝性分离皮下结缔组织及肌肉，显露面神经颊支，专用蚊氏钳满扣夹持面神经上颊支30 s，松开30 s，再卡压30 s^[12]，造成Sunderland Ⅳ度损伤，由同一人操作，分层缝合肌膜、皮肤。术后5 d连续给予克林霉素10 mg/d腹腔注射预防感染。

1.4.3  电针干预  模型对照组自然康复，电针组在造模后2 h开始第1次电针治疗，取右侧翳风、颊车、四白、地仓、阳白、颧髎穴^[13]，1次/d，每次30 min，之后每天在同一时间由同一人完成。穴位定位依据遵循国标GB/T12346-2006《腧穴名称与定位》。以直径0.25 mm，长25 mm的针灸针30°-60°斜行刺入穴位，连接G6805型电针仪，设置参数^[14]：频率18-20 Hz、电压1.5 V，疏密波。以实验动物颊肌轻微震颤且能忍受为宜。

1.4.4  造模成功的检测标准及动物行为学观察  造模后所有动物均存活。造模后模型组动物口角歪斜下垂，触须倒伏且运动减弱，眼睑上抬不能等面瘫症状。通过眨眼反射，触须运动和鼻尖位置评分进行动物行为学评分^[15]。①通过用5 mL注射器的18号针头将空气吹到眼睛上，引起眨眼反射2次，眨眼反射程度按0-2的等级进行评分：0分，两侧无差距；1分，与健侧相比，眨眼反射延迟；2分，眨眼反射完全消失；②观察触须运动30 s，并以0-2的等级进行评分：0分，两侧无差距；1分，触须运动比患侧运动弱；2分，触须运动完全消失；③鼻尖位置，以0至1的等级进行评分：0分，鼻尖居中；1分，鼻尖偏向健侧。 在总得分超过3分，认为存在面瘫；当总分低于3分，认为有恢复；总分为0分，则认为恢复完全^[16]。

1.4.5  检测方法

取材：正常组直接取材，模型对照组和电针组分别于术后 1，4，7，14，28 d取材。每组随机取3只动物，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，开腹后夹闭腹主动脉，开胸腔，将输液针从心尖插入主动脉，剪开右心耳，生理盐水经心快速灌注至肝脏发白，再以40 g/L多聚甲醛500 mL缓慢灌注。横断颈椎，去除其颅骨的顶部和两侧的颞骨、小脑、四叠体，取出菱形脑干组织，等分为3份，固定、包埋后用于切片染色，观察面神经元形态变化及GDNF的定位表达。每组余下的3只动物耳缘静脉空气注射处死后，于冰台上直接取含面神经元的脑桥组织，放入冰盒中迅速转移至-80 ℃冰箱保存，用于Western blotting检测3组各时间点面神经元组织中GDNF及PI3K/AKT通路蛋白的定量表达。

苏木精-伊红染色：石蜡切片常规脱蜡水化后，苏木精染液染色15 min，自来水冲洗。分化液分化10 s，自来水浸泡15 min。置伊红染液2 min，自来水冲洗，自来水浸泡2 min。脱水，透明，封固。

尼氏染色：石蜡切片常规脱蜡水化后，置于56 ℃恒温箱内尼氏染液浸染1.5 h，双蒸水冲洗，尼氏分化液分化   2 min，直接无水乙醇迅速脱水，二甲苯原液透明，封固。光学显微镜下观察尼氏小体的变化，并计数200倍下的阳性细胞数。

免疫组化染色：石蜡切片常规脱蜡水化。体积分数3%H₂O₂室温孵育5 min，消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗5 min×3次。抗原热修复。5%BSA封闭30 min，37 ℃，甩干勿洗。一抗37 ℃孵育4 ℃过夜，PBS冲洗，5 min×3次。滴加二抗，37 ℃，30 min。PBS冲洗5 min×3次。滴加SABC，37 ℃，30 min。PBS冲洗5 min×3次。DAB显色15 min，自来水冲洗。苏木精复染，脱水，透明，封固。光学显微镜下观察并计数200倍下的阳性细胞数。

Western blotting：将各组面神经元组织于裂解液中提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。制胶(12%的分离胶，5%的浓缩胶)，SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移到PVCF膜上(浓缩胶，80 V，30 min；分离胶，120 V 1.5 h)，5%BSA封闭2 h，加入1∶500稀释的一抗4 ℃ 过夜，用TBST洗膜。然后于摇床上进行二抗孵育1 h(稀释比例为1∶1 000)。孵育结束后用TBST洗膜。ECL A液B液混匀显色4 min后显影，采图，保存。内参采用GADPH，以目的蛋白和内参的灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.5  主要观察指标  ①动物行为学评分；②取各组兔含面神经元的脑桥组织，苏木精-伊红染色观察神经元形态；尼氏染色观察尼氏小体；免疫组化测定GDNF的阳性表达；Western blotting检测面神经元组织中GDNF、PI3K、AKT、P-AKT的蛋白表达。

1.6  统计学分析  实验数据全部采用SPSS 24.0(IBM, USA)进行分析，计量数据经正态检验和方差齐性分析，符合正态分布，以x(_)±s表示，多组间比较用单因素方差分析。两两比较方差齐选用LSD检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。

       周围神经损伤后再生其功能恢复不理想，一般仅能恢复到70%左右，且常伴随由于丧失支配神经的营养支持而发生的肌肉萎缩^[18-19]。临床资料表明，电针具有促进损伤后神经再生的作用，是一种加速神经再生、提高神经功能恢复的有效手段^[20]。关于电针治疗面瘫的机制，目前被普遍接受的观点为电针通过生物电场可促进神经相关生长蛋白、营养因子及受体表达的增多，从而促进许旺细胞增殖及生长因子——信使核糖核酸的表达等方面来修复周围神经^[21]。此次研究亦是从以上观点入手，旨在通过分子信号途径进一步探讨电针的治疗机制。

在面神经损伤模型中，急性期施以电针治疗可有效防止沃勒变性，促进轴索再生和再髓鞘化，明显缩短病程^[22]。疏密波作为急性期的首选波形，可以促进代谢、加速血液循环、消除炎症、改善水肿^[23]。在各种面神经损伤的临床类型中，压榨性损伤较为常见，故此次研究中，采用面神经颊支压榨性损伤的病理模型，在急性期采用电针刺激，结果表明电针组动物面瘫症状如口角歪斜下垂，触须倒伏且运动减弱，眼睑上抬不能等较模型组在观察期内恢复早且完全，验证了急性期电针治疗对于面神经压榨性损伤所致周围性面瘫的有效性。

面神经损伤后，神经元胞体从靶器官获取的神经营养因子减少，发生形态、代谢方面的逆行性改变，不可避免出现一定数量的运动神经元死亡^[24]。周围神经的成功再生，主要取决于中枢神经元的存活^[25-26]。此次研究中，面神经损伤后，电针组和模型组中枢神经元均出现胞体收缩，神经元与周围组织间隙增大等病理变化，尼氏体出现减少或消失，核仁移位到周边，尼氏染色模型对照组和电针组面神经元计数与正常组并无明显差异，说明面神经压榨性损伤与断裂伤不同，并不引起神经元的死亡，但电针组尼氏体均较模型对照组损伤轻且恢复早，体现了电针对面神经元的保护作用。  

GDNF被认为是多巴胺能神经元的特异性和强效靶源性神经营养因子^[27]，能有效地提高体外培养的胚胎运动神经元的存活率^[28]。BARRAS等^[29]在大鼠面神经切断后造成8 mm神经间隙模型中，运用1 cm长、能释放GDNF的合成引导管道，结果显示GDNF能有效促进神经再生，保护面部运动神经元免受轴突切断诱导的细胞死亡。作者的前期研究已表明，电针能通过上调面神经元组织中的GDNF表达，促进面神经压榨性损伤后的再生^[30]。由于GDNF蛋白在脑干中合成较少，由受它支配的外周靶组织合成分泌后经神经末梢摄取，沿轴突逆行转运至神经元胞体表达。外周神经损伤后，神经远端发生沃勒变性，与轴突连续性中断，GDNF的逆行运输被阻断，神经元胞体失去靶源性神经营养因子的供给^[31]。故在此次研究中，面神经周围性损伤后，模型对照组和电针组面神经元组织中的GDNF表达均较正常组降低；电针可能通过减轻周围神经及肌肉组织的炎性反应，促进轴突功能的恢复，使逆转运逐渐增多，所以GDNF的表达电针组较模型对照组高。

激活RET酪氨酸激酶受体，刺激磷酸肌肽3激酶PI3K途径，是GDNF的主要细胞内信号通路。PI3K/AKT信号通路是一个经典的抗凋亡、促存活的信号转导途径^[32]，在保护受损神经元方面发挥着重要作用^[33]。在脊髓背根神经节神经元的体外培养中发现，抑制PI3K通道活性可能导致神经元的死亡^[34]，即使有神经营养因子NGF和GDNF支持，抑制PI3K或AKT的活性也会导致神经元死亡，抑制PI3K可以减少自身轴突生长和神经生长因子及GDNF诱导的轴突生长^[35]。此次研究通过免疫染色方法，表明GDNF阳性表达于面神经元胞质，其阳性细胞数，除术后1 d，均高于正常组和模型组。蛋白定量试验亦表明电针组面神经元组织中的GDNF蛋白表达水平在术后各时间点明显升高，且电针能显著上调PI3K和P-AKT蛋白的表达。

综上所述，电针可以有效治疗由面神经压榨性损伤所致周围性面瘫，电针对中枢面神经元的保护作用可能与上调GDNF的表达，激活PI3K/AKT信号通路有关。此次研究的一个潜在局限性是每个检测指标下的动物样本量有点少，但各检测均提示两组之间有差异，作者将在未来的研究里增加样本量，进一步探索电针促进周围面神经再生的具体调控机制。

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文题释义：

胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)：是于1993年发现的由二硫键结合的同源二聚体蛋白质，含有134个氨基酸，分子质量为33-35 kD，是神经营养因子中的一种，属于转化生长因子超家族的远系成员，在全身各组织中均有表达，尤其在中枢神经系统内分布较广，具有显著的提高多巴胺能神经元存活与分化、抑制运动神经元凋亡、营养外周神经元、调整细胞间信息等作用。

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针灸在中国有着悠久的历史，作为神经损伤的替代或补充治疗，用于帮助恢复功能障碍(包括感觉运动障碍、认知障碍和抑郁症)以及疾病后和康复， 且没有明显的不良反应。面瘫是针灸治疗最常见的疾病之一，疗效明确。翳风、颊车、四白、地仓、阳白和颧髎穴是治疗周围性面瘫最常选用的穴位。

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