2.1  BMSCs形态及表型鉴定结果  大鼠骨髓冲洗液培养48 h后出现群聚样贴壁生长细胞，通过连续半量换液可逐步去除悬浮杂质细胞，体外培养至第3代贴壁生长细胞融合成片，以梭形或扁平样形态为主，见图1A。流式细胞鉴定结果显示贴壁生长细胞高表达CD90(95.05%)，低表达CD34(0.62%)，见图1B，1C。

2.2  重组载GDNF、GFP基因腺病毒转染BMSCs  各组细胞转染、体外培养72 h后荧光显微镜观察Ad-GDNF- GFP转染组可见GFP绿色荧光，该组部分细胞胞体收缩，胞体周围见神经细胞突触样结构，见图2A；Ad-GFP转染组中可见GFP绿色荧光，但BMSCs基本维持梭形或扁平样形态，见图2B；未转染组中未见绿色荧光表达，见图2C。



2.3  BMSCs表达GDNF、Wnt3a、Wnt7a蛋白  Western blot检测结果显示Ad-GDNF-GFP转染组细胞体外培养1，3，7 d后GDNF蛋白表达量较Ad-GFP转染组及未转染组明显提高，见图3A，进一步检测结果表明过表达GDNF基因BMSCs体外培养7 d后Wnt信号通路Wnt3a、Wnt7a蛋白表达量亦显著高于Ad-GFP转染组及未转染组，见图3B。

2.4  BMSCs表达神经元特异性烯醇化酶及微管相关蛋白2  免疫荧光检测结果表明Ad-GDNF-GFP转染组BMSCs体外培养3 d后可见神经元特异性烯醇化酶红色荧光表达，见图4A，细胞胞体收缩，胞体周围可见神经元轴突样结构，体外培养7 d后可见微管相关蛋白2红色荧光表达，细胞胞体周围可见神经细胞轴突样结构并相互连接成网，见图4D。Ad-GFP转染组BMSCs仅表达GFP绿色荧光，见图4B，E，细胞仍维持梭形或扁平样形态，未见红色荧光标记神经元特异性烯醇化酶及微管相关蛋白2表达，未转染对照组未见GFP表达，亦未见神经元特异性烯醇化酶及微管相关蛋白2表达，见图4C，F。

2.5  脊髓损伤大鼠后肢神经功能评分变化  实验成功造模后大鼠表现为双下肢立即瘫痪，BBB评分为0分。术后1-4周，各组大鼠关节活动次数，运动负荷及范围，前肢、后肢及尾巴的协调度均有不同程度恢复，各组大鼠BBB评分均有不同程度提高，但BMSCs-GDNF移植组在任意相同检测时间点BBB评分均较BMSCs移植组及PBS移植组明显提高且差异有显著性意义，见表1。

2.6  细胞移植4周后脊髓损伤大鼠组织学观察结果  苏木精-伊红染色结果显示，PBS移植组大鼠脊髓形态不完整，组织结构紊乱，细胞及血管周围间隙扩大，脊髓损伤区域大量炎性细胞浸润、脊髓空洞明显，见图5A。与PBS移植组对比，BMSCs移植组脊髓损伤区域空洞面积减小，但损伤区域仍有较明显的炎性细胞浸润，见图5B；BMSCs-GDNF移植组脊髓损伤空洞面积相对最小，脊髓形态组织结构相对完整，炎性细胞浸润明显减少，见图5C。

2.7  免疫组化检测脊髓损伤局部神经元特异性烯醇化酶、突触素Ⅰ及胶质纤维酸性蛋白表达  免疫组化染色结果显示BMSCs-GDNF移植治疗后4周脊髓损伤局部可见较多神经元特异性烯醇化酶阳性细胞分布，BMSCs移植组脊髓损伤局部亦可见神经元特异性烯醇化酶阳性细胞散在分布，但阳性细胞数较少，而PBS移植对照组未见明显阳性细胞。BMSCs-GDNF移植组与BMSCs移植组脊髓损伤局部可见棕褐色突触素Ⅰ蛋白表达，PBS移植组仅少许突触素Ⅰ蛋白表达，统计学分析比较各组神经元特异性烯醇化酶蛋白平均光密度值差异有显著性意义。另外，PBS移植组脊髓损伤局部可见棕褐色胶质纤维酸性蛋白阳性细胞大量分布，BMSCs移植组亦可见明显胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分布，BMSCs-GDNF移植组脊髓损伤局部虽可见胶质纤维酸性蛋白表达但平均光密度值较PBS移植组、BMSCs移植组明显降低，差异有显著性意义，见图6，7。

2.8  Western blot检测脊髓损伤局部组织肿瘤坏死因子α、Bcl-2表达  GDNF-BMSCs、BMSCs以及PBS移植治疗后4周，脊髓损伤局部可检测肿瘤坏死因子α、Bcl-2蛋白表达，与PSB移植组及BMSCs移植组相比较，GDNF-BMSCs移植组中肿瘤坏死因子α相对表达量最低且Bcl-2蛋白相对表达量最高，见图8。

近年来，过表达神经营养因子基因的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在移植治疗脑损伤、脊髓损伤领域取得了较好的治疗效果^[1-4]，胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)基因诱导干细胞分化及促进轴突再生起到重要作用，已有研究证实外源性GDNF蛋白可诱导BMSCs向神经样细胞分化，有学者进一步通过病毒转染方法促进BMSCs过表达GDNF基因，然后移植治疗脊髓损伤动物模型，并取得了一定的疗效^[5-6]，但关于过表达GDNF基因诱导作用下BMSCs分化方向、分化状态以及移植时机的选择对脊髓损伤修复效果的影响目前仍缺乏充足研究说明。Wnt信号通过复杂的信号传导通路调控细胞分化、增殖，研究发现该信号通路各组分在BMSCs向神经元样细胞分化过程及脊髓损伤修复过程中均有不同程度表达^[7-9]，但Wnt信号通路是否参与GDNF诱导BMSCs分化及修复脊髓损伤过程，目前国内外鲜有研究报道。该实验拟通过腺病毒转染实现BMSCs过表达GDNF基因，观察GDNF持续诱导作用下BMSCs向神经元样细胞转化情况并移植治疗脊髓损伤大鼠，对比移植修复脊髓损伤效果及潜在的分子机制，进一步检测该过程中Wnt信号通路表达，以期为干细胞移植治疗脊髓损伤提供更佳的种子细胞并提高脊髓损伤治疗效果奠定进一步的实验研究基础。

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1.1  设计  细胞学体内移植观察实验。

1.2  时间及地点  2018年4月至2019年4月在扬州大学医院及苏北人民医院实验中心完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  SD大鼠4只，8周龄，雌雄不限，体质量100-150 g，用于骨髓间充质干细胞原代细胞培养；成年雄性SD大鼠50只，体质量220-250 g，用于制作脊髓损伤模型。以上大鼠均由扬州大学比较医学中心实验动物中心提供，许可证号为SCXK(苏)2012-0004。

1.3.2  实验试剂  DMEM培养基、胎牛血清、0.25% Trypsin-0.04%EDTA(加拿大WISENT公司)；单克隆抗体CD34、CD90(美国Santa Cruz公司)；神经元特异性烯醇化酶抗体、微管相关蛋白2抗体、胶质纤维酸性蛋白抗体、突触素Ⅰ抗体(美国Abcam公司)；兔抗鼠GDNF、Wnt3a、Wnt7a、肿瘤坏死因子α、Bcl-2一抗(美国Abcam公司)；DAPI染色试剂盒、Cy3 Conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)、辣根过氧化物酶标记的IgG(达文生物公司)；Western blot显色试剂盒(达文生物公司)。

1.3.3  实验仪器  恒温CO₂细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；脊髓打击器(HI-0400，美国)；倒置荧光显微镜、正置显微镜(日本Nikon公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  BMSCs分离、纯化及鉴定  依据课题组前期实验研究方法获取SD大鼠股骨骨髓混悬液^[10]，通过连续半量换液去除悬浮细胞、杂质，取第3代贴壁生长细胞，0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化，4 ℃条件下1 000 r/min离心5 min，PBS清洗细胞2次，转入流式管中，各管分别加入单克隆抗体CD34、CD90，避光冰上孵育45 min，PBS (含1%BSA)洗涤细胞3次，500 μL PBS(含1%BSA)重悬细胞，流式细胞仪检测分析。

1.4.2  载GDNF-GFP基因重组腺病毒转染BMSCs  取第3代BMSCs，以1×10⁵/孔接种于6孔板，待细胞贴壁生长后弃培养液并随机分为3组，参照课题组前期实验基础研究设置MOI=100，Ad-GDNF-GFP转染组以Ad-rGDNF-GFP转染BMSCs，Ad-GFP转染组以Ad-GFP转染BMSCs，未转染组中仅加入等体积的无血清DMEM培养液。各组细胞置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温细胞培养箱中培养2 h后，均更换为2 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养，荧光显微镜观察各组细胞形态及GFP表达情况。

1.4.3  Western blot检测BMSCs表达GDNF、Wnt3a、Wnt7a蛋白  第3代BMSCs以1×10⁵/孔接种于6孔板并随机分为3组，按上述实验步骤转染。体外培养1，3，7 d后收集各组细胞并加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，将裂解物以14 000×g离心15 min，收集上清液并使用BCA蛋白质测定蛋白浓度。按试剂盒说明配置10%SDS-PAGE浓缩胶、分离胶，蛋白样品以40 μg/孔加样，电泳后电转至PVDF膜，室温下将膜在封闭液中封闭2 h后浸于兔抗鼠GDNF一抗稀释液(1∶1 000)中4 ℃条件下静置2 h，TBST洗涤，将膜与山羊抗兔辣根过氧化物酶偶联二抗稀释液在室温下孵育2 h，TBST洗膜3次，应用ECL法显色，在凝胶成像系统中扫描显像。各组细胞体外培养7 d后相同方法检测Wnt3a、Wnt7a(1∶1 000)蛋白表达。

1.4.4  免疫荧光检测BMSCs表达神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2蛋白  将第3代BMSCs以2×10⁴/孔接种于预先置有细胞爬片的24孔板中，按上述实验步骤转染。各组细胞培养3 d后取出细胞爬片，PBS洗涤2次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，1 g/L Triton作用15 min，PBS洗涤3次，山羊封闭血清室温孵育30 min，弃血清后PBS冲洗细胞爬片，分别加入兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶(1∶1 000)一抗，避光湿盒中4 ℃过夜，PBS洗3次，加入生物素标记羊抗兔红色荧光的二抗(1∶250，DW-A0516)工作液室温孵育2 h，PBS洗涤3次，加入DAPI染色10 min，封固，倒置荧光显微镜观察各组细胞神经元特异性烯醇化酶表达情况。各组细胞体外培养7 d后，以相同方法检测并观察各组细胞微管相关蛋白2(1∶1 000)表达情况。

1.4.5  建立大鼠脊髓损伤模型、细胞移植  取50只SD大鼠，分别给予2.5%氯胺酮经腹腔注射(20 mg/kg)成功麻醉后俯卧位固定在实验台上，术区腰背部去毛备皮，常规消毒后自背部正中切口，显露出T_8-11棘突与椎板，切除T_9-10棘突及部分椎板，将该段脊髓组织显露，即为损伤区。参照改良Allen打击法制备T₁₀脊髓损伤动物模型^[6]，打击量为25 g/cm²。造模成功标标准：脊髓损伤后鼠尾痉挛性摆动且有后双肢呈迟缓性瘫。确认造模成功大鼠逐层缝合切口，造模后连续3 d经腹腔内注射青霉素20×10⁴ U，2次/d，术后每日给予脊髓损伤模型动物常规按摩膀胱促进排便排尿。将造模成功的45只脊髓损伤大鼠随机分为3组(n=15)：过表达GDNF基因BMSCs移植组(BMSCs-GDNF移植组)、BMSCs移植组、PBS移植组。细胞移植方法：将过表达GDNF基因BMSCs体外培养7 d后胰酶消化制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×10¹¹ L^-1，以Hanmihon微量注射器将  10 μL细胞液缓慢注入脊髓损伤局部，注射点为损伤头尾两端各2 mm，每点注射5 μL，每次注射时间持续5 min，注射完毕后留置针头1 min避免细胞悬液反流，BMSCs移植组注射等细胞数BMSCs悬液，PBS移植组注射等体积PBS。

1.4.6  行为学BBB评分  脊髓损伤后1，2，3，4周，采用 BBB评分评价各移植治疗组脊髓损伤大鼠后肢运动功能。BBB评分共22级。0分，后肢完全瘫痪；21分，功能正常。由2名独立观察者按照BBB运动评定量表观察关节活动次数，运动负荷及范围，前肢、后肢及尾巴的协调度，采用双盲法对大鼠运动功能进行评分和记录，得分范围从0分(无肢体运动或体质量支持)到21分(正常运动)，取2名观察者评分的平均值进行统计学处理，各组间数据做单因素方差分析。

1.4.7  组织学检测脊髓损伤形态变化  移植治疗4周后取各组5只大鼠以10%水合氯醛行腹腔麻醉，经心脏用生理盐水充分灌注以冲尽血液，然后给予40 g/L多聚甲醛灌注固定，取出脊髓组织1 cm(以损伤处为中心上下0.5 cm范围)，样本组织脱水后以石蜡进行包埋、制作5 μm厚度切片，二甲苯(5 min×2)脱蜡、梯度乙醇溶液脱水(体积分数为100%乙醇脱水5 min；体积分数为95%乙醇脱水3 min；体积分数为90%乙醇脱水3 min)。苏木精-伊红染色：切片经苏木精染色5 min，水洗3次，盐酸乙醇分色20 s，流水冲洗后置1%伊红液5 min，摄片观察脊髓组织结构变化。

1.4.8  Western blot检测肿瘤坏死因子α及Bcl-2蛋白表达  移植治疗4周后取各组5只大鼠，以10%水合氯醛麻醉后迅速取T₁₀节段脊髓组织，剥除脊膜后加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，使用组织匀浆器在冰上研磨30 min；然后将裂解物以14 000×g离心15 min，收集上清液并测定蛋白浓度。以1.4.3方法制备浓缩胶、分离胶，蛋白样品以40 μg/孔加样后进行电泳、转膜，PVDF膜室温下在用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗鼠肿瘤坏死因子α、Bcl-2一抗     (1∶1 000)，4 ℃条件下静置20 h，TBST洗涤，加入山羊抗兔辣根过氧化物酶偶联二抗稀释液在室温下孵育2 h，TBST洗膜3次，应用ECL法显色，在凝胶成像系统中扫描显像，Image J软件分析灰度值。

1.4.9  免疫组化检测神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、突触素Ⅰ蛋白表达  移植治疗4周后取各组5只大鼠以10%水合氯醛行腹腔麻醉，40 g/L多聚甲醛灌注固定后取出脊髓组织，脱水后制作石蜡切片，切片厚5 μm，脱蜡后加入体积分数为3%H₂O₂ 37 ℃孵育15 min阻断及灭活内源性过氧化物酶，PBS漂洗3 min×3次，0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)水煮修复10 min，自然冷却至室温，PBS冲洗3×3 min，5%正常小牛白蛋白(BSA)室温封闭2 h，加入兔抗鼠一抗神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、突触素Ⅰ(1∶100)，湿盒中4 ℃孵育过夜，PBS漂洗   3 min×3 次，滴加生物素化兔抗羊的二抗室温孵育1 h，加入ABC复合物37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS漂洗3 min×3次，DAB显色试剂盒37 ℃显色5 min，复染，二甲苯透明15 min，中性树脂封固。每张切片随机取5个视野，在400倍镜下摄取图像，计算阳性细胞个数，Image J软件分析随机视野吸光度值。

1.5  主要观察指标  ①BMSCs过表达GDNF蛋白鉴定；②过表达GDNF诱导作用下BMSCs体外分化情况及Wnt信号通路成分表达；③对比不同移植治疗方案脊髓损伤修复效果差异；④对比不同移植方案脊髓损伤局部神经元存活、胶质瘢痕形成以及局部炎症因子表达差异。

BMSCs来源广泛，体外易于纯化、扩增，具备多向分化潜能且无免疫原性、自体移植不受伦理学限制，近年来作为种子细胞在移植治疗脊髓损伤领域展现出了良好的应用前景^[11-14]，研究发现BMSCs作为种子细胞移植后可向脊髓损伤局部迁移并分化为神经元样细胞，在替代受损神经元同时合成包括外泌体在内的多种细胞因子抑制损伤局部炎症反应、细胞凋亡、促进轴突再生进而提高脊髓损伤模型动物的神经功能恢复^[15-16]，但亦有研究学者指出脊髓损伤局部复杂的病理生理微环境可导致移植BMSCs存活、分化率降低，抑制损伤局部神经元形成及细胞因子的分泌，进而严重影响脊髓损伤治疗效果^[17-19]，因此实现BMSCs自行分化并维持稳定的诱导分化作用对治疗脊髓损伤具有重要意义。

该实验通过连续半换液分离纯化BMSCs，荧光显微镜观察可见重组GDNF基因腺病毒成功转染BMSCs，与Ad-GFP转染组及未转染组比较持续提高了GDNF蛋白表达量，体外培养3 d免疫荧光检测结果表明过表达GDNF基因的BMSCs可表达神经元特异性烯醇化酶，在过表达GNDF持续诱导1周后BMSCs胞体皱缩明显，形成典型的神经细胞轴突样结构并表达成熟神经元标记蛋白微管相关蛋白2，说明在持续、过表达GDNF蛋白诱导作用下BMSCs可向成熟神经元样细胞自行分化。

近年来国内外大量研究发现多种诱导物可促进BMSCs向神经元样细胞转化，但关于BMSCs向神经元样细胞分化的分子机制尚不明确，已有研究证实Wnt信号通路与神经元轴突再生以及神经干细胞增殖、分化密切相  关^[20-23]，Wnt/β-catenin信号通路可能在BMSCs的神经分化过程中起到关键的作用，在神经营养因子诱导体系中静默β-catenin基因表达后神经元特异性蛋白表达量显著下降，而在加入Wnt3a后神经元特异性蛋白表达量明显提     高^[24-25]。另有研究发现经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路均可促进BMSCs向特定类型神经元样细胞分化，在神经营养因子诱导体系中加入Wnt7a后突触标志物SYN1、BSN、SYTG表达量增加，同时胆碱能神经元标志物ChAT、多巴胺神经元标志物DBH表达量亦增加，而采用SP600125特异性阻断非经典Wnt/c-JNK信号通路后，ChAT与DBH的表达完全受阻而微管相关蛋白2与SYN1的表达量未见明显变化^[26-27]。该实验通过病毒转染方式促进BMSCs过表达GDNF蛋白，在GDNF蛋白持续诱导7 d后呈现典型神经元样细胞形态且表达成熟神经元标记蛋白，Western blot结果表明Ad-GDNF-GFP转染组Wnt3a、Wnt7a蛋白表达阳性，而Ad-GFP转染组与未转染组中BMSCs仍维持梭形或扁平样形态，未见神经元特异性蛋白表达，Wnt3a、Wnt7a蛋白表达量也较低，初步说明Wnt信号通路一定程度上参与了GDNF诱导BMSCs向成熟神经元分化过程。

GDNF作为新近发现的生物活性最强的神经营养因子，可显著促进神经元的存活、分化并对脊髓损伤的修复起到极其重要的作用，但GDNF于脊髓损伤局部快速降解显著限制其对脊髓损伤的修复作用，因此实现GDNF基因蛋白持续表达对脊髓损伤及神经元分化具有重要意     义^[28-30]。LU等^[31]采用慢病毒载GDNF基因转染BMSCs后进一步移植治疗脊髓损伤，与对照组比较发现过表达GDNF基因移植组治疗效果最佳，但对过表达GDNF基因的BMSCs分化方向及分化状态尚缺乏充分研究，SHAHREZAIE等^[2]亦采用慢病毒载GDNF基因转染BMSCs，转染后进一步采用神经营养因子诱导BMSCs分化2周后移植至大鼠脊髓损伤局部，结果证实分化后的BMSCs表达神经干细胞特异性蛋白Nestin，分化后细胞移植可促进脊髓损伤局部轴突再生、促进大鼠后肢运动功能恢复。腺病毒可将目的基因转导至靶细胞，在不影响靶细胞染色体正常基因表达及细胞增殖活力情况下显著提高目的基因表达量并维持较长时间^[32-34]，该研究中以腺病毒为载体转染BMSCs，过表达GDNF后BMSCs在体外可自行分化表达神经元特异性蛋白神经元特异性烯醇化酶及成熟神经元蛋白标记物微管相关蛋白2；进一步将分化后的细胞移植治疗脊髓损伤大鼠，与同类研究相比较BMSCs-GDNF移植组同一检测时间点脊髓损伤大鼠获得更高的BBB评分且脊髓损伤局部神经元特异性烯醇化酶、突触素Ⅰ蛋白表达明显提高。

BMSCs移植后可迁移至脊髓损伤局部分化为神经元并表达神经元特异性蛋白，在替代损失的神经细胞的同时通过神经元突触连接重建神经传导通路，进而达到脊髓损伤修复目的^[17]，突触素作为突触的特异性蛋白是突触形成过程最重要的标志物，主要位于神经元胞体及轴突，可调节神经元轴突延伸^[35]，参与突触囊泡的介导转运、神经递质释放，对促进脊髓损伤所造成的神经功能障碍恢复起到重要作用^[36-37]，该实验将过表达GDNF基因BMSCs (GDNF-BMSCs)、BMSCs及PBS分别移植至脊髓损伤局部，移植4周后取脊髓损伤组织以免疫组化检测神经元特异性烯醇化酶、突触素Ⅰ蛋白表达，结果表明BMSCs-GDNF移植组脊髓损伤部位神经元特异性烯醇化酶及突触素Ⅰ蛋白表达量较BMSCs移植组及PBS移植组明显提高，表明在GDNF-BMSCs移植后脊髓损伤局部有更多的神经元存活、更多的突触素Ⅰ蛋白表达，而脊髓损伤局部神经元存活数量以及突触素Ⅰ蛋白表达量的提高更有利于移植细胞与脊髓神经元之间形成功能性突触连接进而促进脊髓损伤修复，结合苏木精-伊红染色结果发现GDNF-BMSCs移植组脊髓损伤局部空洞面积较BMSCs移植组及PBS移植组显著缩小，移植后4周内不同时间点GDNF-BMSCs移植组大鼠BBB评分亦高于BMSCs移植组及PBS移植组且差异有显著性意义，说明GDNF-BMSCs移植对脊髓损伤修复及促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复效果显著优于单纯BMSCs移植组及PBS移植组。

研究发现脊髓损伤亚急性期微环境中炎性细胞及小胶质细胞可产生包括肿瘤坏死因子α在内的多种炎性因子并诱导脊髓损伤局部星形胶质细胞过度活化，后者加剧脊髓损伤局部胶质瘢痕形成、抑制神经元轴突延伸连接同时进一步分泌大量炎性因子，进一步加重了亚急性期脊髓损伤局部神经元的凋亡，进而抑制脊髓损伤后肢体运动功能恢复^[38-39]。胶质纤维酸性蛋白作为星形胶质细胞活化标记蛋白，在该实验研究中发现GDNF-BMSCs移植4周后脊髓损伤局部胶质纤维酸性蛋白表达量显著低于单纯BMSCs移植组及PBS移植组，Western blot结果显示GDNF-BMSCs移植组脊髓损伤组织中可检测肿瘤坏死因子α表达，但表达量明显低于BMSCs移植组及PBS移植组，另外抗细胞凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达量却明显高于BMSCs移植组及PBS移植组。因此可认为过表达GDNF基因BMSCs移植较单纯BMSCs移植可有效缓解脊髓损伤局部炎性浸润和细胞凋亡，并抑制损伤局部胶质瘢痕的形成，一定程度上改善了脊髓损伤局部病理生理微环境，为损伤局部轴突再生创造更佳的微环境。

综上所述，腺病毒转染可实现BMSCs持续过表达GDNF基因，Wnt信号通路参与GDNF诱导BMSCs向成熟神经元分化过程，以BMSCs为载体携带GDNF基因移植到脊髓损伤局部可进一步抑制星形胶质细胞过度活化、降低炎性因子表达、改善损伤局部微环境，促进脊髓损伤局部神经元存活并提高突触素蛋白表达量，实现了干细胞分化替代和基因治疗的双重作用，对脊髓损伤后神经元轴突再生重建及大鼠运动功能恢复较单纯BMSCs移植起到更佳的治疗作用。

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文题释义：

胶质细胞源性神经营养因子：作为轴突再生的一种重要神经营养因子，可诱导间充质干细胞向神经样细胞分化并对中枢神经系统退行性疾病、脊髓损伤后神经功能恢复起到重要作用。

突触素：作为突触的特异性蛋白是突触形成过程中最重要的标志物，主要位于神经元胞体及轴突，可调节神经元轴突延伸，参与突触囊泡的介导转运、神经递质释放，对促进脊髓损伤后神经功能恢复起到重要作用。

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近年来以骨髓间充质干细胞来源的纳米级颗粒外泌体作为新的治疗策略治疗脊髓损伤展现出了良好的应用前景并成为研究热点。与单纯移植骨髓间充质干细胞相比较，骨髓间充质干细胞来源外泌体具有体内存活期更长、低致癌性、高传递效率等优势，新近研究发现骨髓间充质干细胞来源外泌体通过有效抑制星形胶质细胞活化、降低脊髓损伤微环境中炎性因子及凋亡基因表达进而促进脊髓损伤修复，然而外泌体细胞来源和获取分离外泌体的条件控制目前尚缺乏充足研究，此外现有研究发现外泌体为细胞外环境中直径为40-100 nm的有膜囊泡，其组成成分复杂，含多种蛋白质、脂质和核酸，其中修复脊髓的关键分子及机制仍缺乏进一步研究说明。与该实验研究相比较，过表达胶质细胞源性神经营养因子基因是否通过提高骨髓间充质干细胞外泌体表达量进而实现提高大鼠运动功能恢复效果以及主导分子机制仍需进一步深入研究。

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