从肝论治取穴针灸治疗膝骨关节炎模型大鼠关节功能与昼夜节律的关系

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3121

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (14): 2192-2198.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3121

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从肝论治取穴针灸治疗膝骨关节炎模型大鼠关节功能与昼夜节律的关系

周晓红1，李柏村2，李佳1，彭锐1

1湖北中医药大学针灸骨伤学院，湖北省武汉市 430061；2华中科技大学同济医学院附属协和医院，湖北省武汉市 430030

收稿日期:2020-06-18 修回日期:2020-06-24 接受日期:2020-08-15 出版日期:2021-05-18 发布日期:2020-12-30
通讯作者: 彭锐，教授，主任医师，博士生导师，湖北中医药大学针灸骨伤学院，湖北省武汉市 430061
作者简介:周晓红，女，1986年生，湖北省崇阳县人，汉族，湖北中医药大学针灸骨伤学院在读博士，讲师，主治医师，主要从事骨与关节损伤疾病的防治研究。
基金资助:
湖北中医药大学2019年“青苗计划”资助项目(2019ZZX032)，项目负责人：周晓红

Relationship between joint function and circadian rhythm in a rat model of knee osteoarthritis undergoing acupuncture and moxibustion at acupoints selected based on liver theory

Zhou Xiaohong1, Li Bocun2, Li Jia1, Peng Rui1

1College of Acupuncture and Bone Injury, Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China; 2Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China

Received:2020-06-18 Revised:2020-06-24 Accepted:2020-08-15 Online:2021-05-18 Published:2020-12-30
Contact: Peng Rui, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, College of Acupuncture and Bone Injury, Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China
About author:Zhou Xiaohong, MD candidate, Attending physician, Lecturer, College of Acupuncture and Bone Injury, Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China
Supported by:
2019 “Young Crops Program” of Hubei University of Traditional Chinese Medicine, No. 2019ZZX032 (to ZXH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
昼夜节律：生物钟紊乱可引起多种疾病，在骨关节炎中软骨和滑膜的外周时钟遭到破坏，中央、外周时钟解耦连，生物钟蛋白的表达失去节律性，导致昼夜节律紊乱，引起骨关节炎病变。
从肝论治：生物钟机制与中医肝关系密切，肝主疏泄的昼夜节律变化可相应地引起机体气血的运行与昼夜节律分布，从而影响整体机能，包括骨关节系统，肝有主疏泄、藏血的功能，能调节昼夜节律，从肝论治膝骨关节炎具有鲜明的科学性。

背景：膝骨关节炎发病机制复杂，近年来有研究发现昼夜节律与膝骨关节炎关系密切，而肝与昼夜节律有一定联系，从肝论治取穴针灸影响昼夜节律的研究鲜见。
目的：探讨从肝论治针灸治疗膝骨关节炎对关节功能的影响及其与昼夜节律的关系。
方法：随机将40只3月龄SPF级雄性SD大鼠分为正常组、模型组、常规取穴组和从肝论治取穴组，每组10只。除正常组外，其余3组均制备右膝关节炎模型造模；常规取穴组取足三里+内、外膝眼；从肝论治取穴组取阳陵泉+肝俞+太冲。从造模术后第1周开始，每周进行旷场实验、足底痛阈测试实验和右膝关节活动度测量；治疗结束后，苏木精-伊红染色观察软骨组织病理结构，RT-PCR与免疫荧光法检测软骨组织中Bmal1、Clock基因与蛋白的表达。
结果与结论：①与正常组相比，模型组大鼠平均速度、总运动距离明显降低，休息时间明显延长(P < 0.05)，足底痛阈明显降低(P < 0.05)，关节活动度下降(P < 0.05)，组织学评分明显增高(P < 0.05)，且软骨组织中Bmal1、Clock基因与蛋白的表达均明显下降(P < 0.01)；②与模型组相比，常规取穴组和从肝论治取穴组各项指标均有改善(P < 0.05)，且从肝论治取穴组各项指标改善更明显(P < 0.05)；③提示从肝论治取穴可能通过影响软骨细胞昼夜节律，修复软骨组织，减轻膝骨关节炎疼痛，恢复关节功能。

https://orcid.org/0000-0001-5109-1916 (周晓红)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨, 膝关节, 骨关节炎, 针灸, 取穴, 从肝论治, 昼夜节律, 足底痛阈

Abstract: BACKGROUND: The pathogenesis of knee osteoarthritis is complex. In recent years, studies have found that circadian rhythm is closely related to knee osteoarthritis, and the liver is related to circadian rhythm to some extent. However, there are rare reports on the influence of acupuncture and moxibustion on the circadian rhythm from the liver theory.
OBJECTIVE: To explore the relationship between circadian rhythm and joint function of the articular cartilage when treating osteoarthritis with acupuncture at acupoints associated with the liver.
METHODS: Forty 3-month-old male SPF Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group, model group, conventional acupuncture group and acupuncture at acupoints associated with the liver group, with 10 rats in each group. In the latter three groups, the osteoarthritis model was constructed in the right knee joint of rats by surgical modeling. Zusanli+Neixiyan+Waixiyan were selected in the conventional acupuncture group, Yanglinquan+Ganshu+Taichong were selected in the group of acupuncture at acupoint associated with the liver. Open field test, plantar pain threshold test and range of motion of the right knee joint were performed and detected since the 1st week from modeling. After treatment, the pathological structure of cartilage tissues was observed by hematoxylin-eosin staining. RT-PCR and immunofluorescence were used to detect the expression of Bmal1 and Clock gene and protein in cartilage tissues.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal group, in the model group, the average speed and total movement distance were significantly reduced, the rest time was significantly prolonged (P < 0.05), the plantar pain threshold was significantly reduced (P < 0.05), the range of motion of the knee joint was reduced (P < 0.05), the histological score was significantly increased (P < 0.05), and the mRNA and protein expressions of Bmal1 and Clock were significantly reduced (P < 0.01). Compared with the model group, all indexes were improved in the conventional acupuncture group and in the group of acupuncture at acupoints associated with the liver (P < 0.05), and a better improvement of each index was in the group of acupuncture at acupoints associated with the liver (P < 0.05). Therefore, it is possible to repair cartilage tissue, relieve osteoarthritic pain and restore joint function by influencing circadian rhythm in chondrocytes.

Key words: bone, knee joint, osteoarthritis, acupuncture and moxibustion, acupoint selection, treatment based on the liver theory, circadian rhythm, plantar pain threshold

中图分类号:

周晓红, 李柏村, 李佳, 彭锐. 从肝论治取穴针灸治疗膝骨关节炎模型大鼠关节功能与昼夜节律的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2192-2198.

Zhou Xiaohong, Li Bocun, Li Jia, Peng Rui. Relationship between joint function and circadian rhythm in a rat model of knee osteoarthritis undergoing acupuncture and moxibustion at acupoints selected based on liver theory[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(14): 2192-2198.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠40只，随机分为4组，全部进入结果分析，无脱失。
2.2 各组大鼠旷场实验与足底痛阈测试实验结果见图2。

术后1周，从肝论治取穴组、常规取穴组、模型组3组之间比较大鼠旷场实验和足底痛阈测试结果相比差异无显著性意义(P > 0.05)，但与正常组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。术后第2-4周，从肝论治取穴组、常规取穴组、模型组大鼠右膝旷场实验和足底痛阈测试实验结果变化不明显。术后第5-8周，旷场实验和足底痛阈测试实验结果表明，从肝论治取穴组、常规取穴组大鼠运动速度和活动总距离逐渐增加、热痛阈值和机械痛阈值逐渐增大、休息时间逐渐减少，每周与正常组大鼠相比，模型组大鼠平均速度、活动总距离、热痛阈值和机械痛阈值明显降低，休息时间明显延长(P < 0.05)；与模型组相比，常规取穴组和从肝论治取穴组均能提高大鼠运动速度，提高活动总距离，提高热痛阈值和机械痛阈值并减少休息时间(P < 0.05)，且从肝论治取穴组明显优于常规取穴组(P < 0.05)。
2.3 大鼠关节活动度见图3。
术后1周，从肝论治取穴组、常规取穴组、模型组3组之间比较大鼠右膝关节活动度差异无显著性意义，但均明显小于正常组(P < 0.05)。术后第2-4周，从肝论治取穴组、常规取穴组、模型组大鼠右膝关节活动度变化不明显。术后第5周至第8周，从肝论治取穴组、常规取穴组大鼠右膝关节活动度逐渐增大，且每周从肝论治取穴组、常规取穴组和正常组右膝关节活动角度均大于模型组(P < 0.05)，并且每周从肝论治取穴组右膝关节活动角度大于常规取穴组，与常规取穴组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 软骨标本苏木精-伊红染色及Mankin′s评分正常组关节可见软骨表面光滑，各层结构清晰，软骨厚度正常；模型组关节软骨表面破损，表层细胞排列不均匀，软骨变薄；常规取穴组和从肝论治取穴组软骨表面较光滑，表层细胞呈梭形，近似水平排列，其中从肝论治取穴组改善最为显著，软骨厚度基本正常，见图4。从肝论治取穴组、常规取穴组和正常组Mankin′s评分均低于模型组(P < 0.01)，从肝论治取穴组最为显著，与常规取穴组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.5 各组大鼠膝关节软骨Bmal1、Clock基因与蛋白的表达比较从图6可见，RT-PCR与免疫荧光法检测显示，相较于正常组，膝骨关节炎模型组大鼠膝关节软骨组织中Bmal1、Clock基因与蛋白的表达水平均明显下降(P < 0.01)，而从肝论治取穴组与常规取穴组均能明显提高这2个基因的表达水平(P < 0.01)，且从肝论治取穴组表达量比常规取穴组更高(P < 0.01)。

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引言

膝骨关节炎是一种因年龄、体质量、创伤等多种因素导致关节内局限性炎症和疼痛为主的退行性变疾病，以疼痛、膝关节活动受限为主[1]，常影响患者的日常生活和工作，严重者甚至无法站立行走[2]。昼夜节律生物钟紊乱可引起多种疾病，在膝骨关节炎中软骨和滑膜的外周时钟遭到破坏，中央、外周时钟解耦连，生物钟蛋白的表达失去节律性，导致昼夜节律紊乱，引起膝骨关节炎病变[3-5]。许多存在昼夜节律的基因参与细胞的代谢与凋亡过程，对维护软骨组织内稳态至关重要，例如细胞外基质中的结构组件(如蛋白聚糖和胶原蛋白)和改造酶(例如Adamts1、Adamts4和Adamts9)、基质金属蛋白酶(例如Mmp14)、基质金属蛋白酶抑制剂(例如Timp3和Timp4)和生长因子等[6]。核心昼夜节律基因Bmal1可以调节软骨组织中时钟控制基因的表达并维持其完整性[7]。昼夜节律的循环机制为：Bmal1和Clock蛋白是核心时钟蛋白，能形成异二聚体复合物，此复合物结合E-box增强子元件，激活Per和Cry基因的转录，Per和Cry蛋白又能反向抑制Bmal1/Clock二聚体复合物的生成，降低Bmal1和Clock蛋白的表达；随之对Per和Cry基因的激活减少，Per和Cry蛋白生成减少，对Bmal1和Clock基因的抑制作用减弱，Clock、Bmal1蛋白的形成增多，如此循环调控机体的昼夜节律[8]。
生物钟机制与中医肝关系密切，肝主疏泄的昼夜节律变化可相应地引起机体气血的运行与昼夜节律分布[9]，从而影响整体机能，包括骨关节系统。西医多采用消炎、止痛、关节腔内注射及人工关节置换等方法治疗[10]，虽可临时缓解疼痛，但无法延缓或逆转关节软骨的退变，因此，最新的指南仍推荐使用保守非药物治疗膝骨关节炎[11]。中医治疗膝骨关节炎采用针灸疗效显著，肝有主疏泄、藏血的功能，能调节昼夜节律，从肝论治膝骨关节炎具有鲜明的科学性。针灸疗法作为一种安全有效、无毒副作用的保守治疗手段，越来越受众人推崇，实践证实，针灸治疗膝骨关节炎安全有效，在改善膝关节疼痛与日常活动的同时，可提高软骨的自身修复能力，延缓关节软骨退变，有明显的防治优势[12]。此次实验设计以昼夜节律为切入点，依据中医脏腑、经络辨证理论，从肝论治针灸选取肝俞、太冲、阳陵泉配伍治疗膝骨关节炎，探讨从肝论治针灸对膝骨关节炎关节功能的作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机分组对照动物实验。

1.2 时间及地点于2019年3月开始在湖北中医药大学针灸研究所进行，时间路线图见图1。

1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性SPF级SD大鼠40只，体质量(180± 10) g，3月龄，由湖北省实验动物研究中心提供，动物合格证号：SCXK鄂2015-0018号。适应性喂养1周后，采用纯随机抽样方法将大鼠分为正常组、模型组、常规取穴组、从肝论治取穴组，共4组，每组10只。实验严格遵守科技部[2006]398号文件《关于善待实验动物的指导性意见》要求。
1.3.2 主要试剂及仪器 Bmal1 B-1抗体：sc-365645，Santa Cruz公司；Clock C-8抗体：sc-271603，Santa Cruz公司；引物合成(上海生工公司)；DEPC水(美国，Sigma)；cDNA逆转录试剂盒；PCR试剂(美国，Thermo Fisher Scientific)；β-actin抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；华佗牌毫针(0.25 mm×13 mm；中国苏州；华佗牌)；直径1 cm特制香烟型纯艾条(南阳市卧龙汉医艾绒厂)，PL200足底热测痛仪(中国成都泰盟科技有限公司)，von frey纤维丝(Stoelting, Wood Dale，IL)，紫外分光光度计(德国，Nano NP80)，基因扩增仪(中国，西安天隆科技有限公司)；PCR仪(美国，Bio-Rad CFX96TM)；石蜡切片机(美国，Thermo Finesse 325)；荧光显微镜(德国，AX10 Carl Zeiss)。
1.4 方法
1.4.1 大鼠右膝关节炎模型制备除正常组以外，其余30只实验大鼠均进行右膝关节造模。实验大鼠采用10%水合氯醛3 mL/kg麻醉成功后，利用ZHOU等[13]改良Hulth法，在切断前交叉韧带的同时剔除内侧半月板手术造模方式构建大鼠右膝关节炎模型，术后予青霉素40×104 U肌肉注射，1次/d，连续3 d。手术后1周，将大鼠放入跑台运动装置每天跑30 min，持续3周以复制膝骨关节炎模型。改良Hulth法造模操作简单，手术创伤小，实验模型稳定，实验数据可靠，造模成功率高[14-15]。

1.4.2 干预方法用自制鼠衣固定大鼠，参照华兴邦[16]制定的实验动物穴位图谱，常规取穴组取内膝眼、外膝眼、足三里；从肝论治取穴组取阳陵泉、肝俞、太冲，用0.25 mm×13 mm华佗牌毫针针刺，针刺后留针，同时采用特制香烟型纯艾条离穴位2 cm处悬灸，1次/d，15 min后停止艾灸并取针。治疗从造模术后4周开始(即跑台3周结束后开始治疗)，7 d为1个疗程，共治疗4个疗程。
1.5 主要观察指标
1.5.1 旷场实验与足底痛阈测试实验造模术后第7天为第1周，术后至治疗结束，共8周，各组大鼠均每周进行旷场实验和足底痛阈测试实验。大鼠适应实验室30 min后，将大鼠置于旷场反应箱(底边100 cm×100 cm，高40 cm)的中心，正上方2 m处架一视野可覆盖整个旷场内部的数码摄像头，并允许大鼠在5 min的测试期内自由活动，用计算机记录大鼠的运动，计算其平均速度、休息时间、总运动距离，分析评价其探索行为和焦虑行为。热痛阈测试根据HARGREAVES等的方法，使用PL200足底热测痛仪，将一定强度的光辐射焦点对准大鼠右后肢足底中部, 记录其从照射开始到大鼠抬腿回避的时间(s)，间隔5 min后再测，连续测3次，取平均值[17]。机械痛阈测试根据up-down法[18]，使用von frey纤维丝垂直刺激大鼠右后肢足底，持续6-8 s，记录大鼠出现缩足反应时的痛反射阈值(g)。
1.5.2 大鼠关节活动度治疗结束后，各组大鼠麻醉状态下，针对右膝关节，伸膝后屈膝，屈至最大角度时，用量角器测量其活动的角度[19]。为尽量减少施力大小的误差对关节活动度的影响，实验过程中由同一个人操作。
1.5.3 软骨标本苏木精-伊红染色及Mankin’s评分处死大鼠后取出右膝关节，修剪多余骨质和肌肉软组织，用40 g/L多聚甲醛固定24 h后，放入10%EDTA脱钙液中脱钙，待骨质变软后，脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，制作软骨石蜡切片，用苏木精、伊红染色后梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封固，光学显微镜下观察胫骨平台处软骨。根据Mankin’s评分原则，取2位不同观察者对右膝关节切片评分的平均值作为Mankin′s得分。
Mankin′s评分的评估标准：软骨组织结构积分0-3分(正常0分、排列紊乱但层次可分1分、排列明显不规则且层次紊乱2分、严重紊乱3分)，细胞数量积分0-3分(正常0分、轻度增生1分、中度增生2分、重度增生3分)，软骨基质染色积分0-3分(正常0分、轻度减低1分、中度减低2分、严重减低3分、不着色4分)，潮线积分0-3分(正常0分、多层次1分、模糊2分、有血管穿过3分)。
1.5.4 RT-PCR软骨组织中Bmal1、Clock基因的表达取大鼠膝关节的软骨组织，放入预冷研钵中研磨，匀浆，采用Trizol法提取软骨组织总RNA，用紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，使用反转录试剂盒以组织总RNA为模板反转录成cDNA，Clock基因引物序列上游：5’-GCG GAG GTC ATC CTT CAG TA-3’，下游：5’-AAC TGT GAC ATG CCT TGT GG-3’，Bmal1基因引物序列上游: 5’-GGC GTC GGG ACA AAA TGA AC-3’，下游: 5’-TGC TGA ACA GCC ATC CTG AG-3’，内参基因为β-actin引物序列上游：5’-GAG GGA AAT CGT GCG TGA-3’，下游：5’-CTGGAA GGT GGA CAG TGA-3’，采用2-ΔΔCT法计算Bmal1、Clock基因的相对表达量。
1.5.5 免疫荧光法检测软骨组织中Bmal1、Clock蛋白的表达取得关节软骨组织经固定、脱钙、包埋后制成石蜡切片，再经脱蜡、抗原修复、孵育一抗、孵育二抗、DAPI染核、封片步骤后，将切片置于荧光显微镜下观察，并在合适且相同的曝光强度下进行观察、拍照。所得图像的荧光强度使用Image J软件进行统计分析。
1.6 统计学分析计量资料符合正态分布方差齐的，用x±s表示，不符合正态，方差不齐，则用四分位数表示；行为学指标每周进行检测，为重复测量数据，采用LSD Duncan对数据进行统计分析，其余数据采用单因素方差分析进行组间比较，以P < 0.05为差异有显著性意义。所有数据使用SPSS 20.0软件进行统计学分析。

讨论

中医学将膝骨关节炎归属“痹病”范畴，膝关节从生理功能上讲，有“肝主筋、膝为筋之府”之说，但其基础是肝主疏泄及主藏血两大生理功能。岳广欣等[20]认为肝主疏泄的核心是人的本能需求，肝主疏泄的调控中枢是情绪和动机中枢大脑边缘系统，其信息通路是交感-肾上腺髓质通路和下丘脑-脑干-自主神经通路，其功能得以实现的效应器是平滑肌系统，肌肉的舒缩运动可调节气血津液的分布从而使肝能疏泄，肌肉舒缩这种变化又可通过感觉传入系统传入边缘系统进行反馈调节，对其功能的维持和变化起主要调节作用的是肾上腺皮质激素。《素问·五脏生成》曰：“故人卧血归于肝……足受血而能步，掌受血而能握”。肝主藏血，能够贮藏一定的血液，以供人体代谢活动所需，当机体活动剧烈或情绪激动时，肝将血液向外输送；当机体安静或休眠时，血液归藏于肝。中医认为肝主疏泄、藏血，具有节律性，肝失疏泄、藏血失调时，人体生命活动亦会受影响，与昼夜节律失调存在相关性，有文献表明肝与昼夜节律有联系，但其具体分子机制如何有待进一步研究。中医认为肝主疏泄、藏血，具有节律性，肝失疏泄、藏血失调时，人体生命活动亦会受影响，与昼夜节律失调存在相关性，有文献表明肝与昼夜节律有联系，但其具体分子机制如何有待进一步研究[21-22]。肝血充盛，肝气条达，疏泄正常，关节局部昼夜节律正常，这样才能维持经筋的正常功能活动。若肝主疏泄或藏血功能失常，昼夜节律失常，筋聚之处得不到濡养，则可能导致膝骨关节炎症状加重。作者通过从肝论治取穴治疗膝骨关节炎，发现从肝论治取穴针灸对膝骨关节炎疗效优于常规取穴，这与以往临床上医家从肝论治治疗膝骨关节炎所得到的结论相一致。如张权义[23]比较2种方案治疗中老年女性膝骨关节炎的效果，证明调肝针刺法的临床疗效优于常规针刺法；有研究采用俞原配穴法[24]，即取肝俞与太冲治疗，能有效缓解疼痛，且远期效果良好；有人采用“相对穴”取穴法[25]，取阴陵泉、阳陵泉，合“从阴引阳，从阳引阴”的治疗原则，治疗膝骨关节炎具有奇效；刘康等[26]采用针刺内关、太冲穴治疗，与常规局部取穴疗效相当，证明前者取穴更精简便捷。此次研究取肝俞、太冲、阳陵泉穴从肝论治配穴。肝俞，为肝之脏腑元气输注于背部的腧穴，可调节肝脏；太冲，为肝之原穴，以治疗脏病为主，故《灵枢·九针十二原》曰：“五脏有疾者，应出十二原”；“五脏有疾也，当取之十二原”；阳陵泉，为筋之所会，主治筋病；《针灸大成》云：“最是阳陵泉一穴，膝间疼痛用针烧”。这说明肝俞、太冲可调节肝脏功能，而阳陵泉则可疏通局部经脉，远端取穴与局部取穴相结合，标本兼顾，可起到疏肝通络的作用，但是这种机制仍不甚明了。
众所周知，人和动物的生理功能(如睡眠-觉醒周期、体温、心率、血压)、生化代谢(如激素水平)、行为表现(如疼痛、焦虑、抑郁等)常以24 h为周期发生规律性变动，这种变化的节律称为昼夜节律。从细菌到哺乳动物体内都有控制昼夜节律的装置，称为生物钟。生物钟广泛存在于各个器官与组织中，使生物体可以更好地与自然界的节律性相通应，并具有正负反馈环路[27]。Bmal1和Clock是生物钟的主要正向调控元件，Cry1、Cry2、Per1和Per2则是主要的负向调控元件。众多研究表明，膝骨关节炎的发展伴随着软骨细胞生物钟的紊乱，软骨细胞生物钟运行机制中，最经典的模式为2个连锁的转录/翻译环路，包括4种生物钟基因，其中对生物钟起激活作用的有Bmal1和Clock基因，对生物钟起抑制作用的有PER和CRY基因，这为膝骨关节炎发病机制提供了新的理论基础[28-29]。膝骨关节炎最主要的表现为软骨损伤。DUDEK等[30]研究发现，Bmal1的表达量会随着膝骨关节炎病情的严重程度和病程进展而下降；Col2a1-Bmal1缺失小鼠的基因表达研究表明，Bmal1对维持软骨细胞内合成和分解相关代谢因子的平衡至关重要。为进一步明确Bmal1与炎症通路的相关性，在Bmal1-/-小鼠的基因筛查中发现，转化生长因子β受体ALK1的表达量持续上调，但ALK5的表达量却保持不变，而ALK1/ALK5的比值正好为软骨的分解代谢产物，由此看来，昼夜节律的失衡可能导致了膝骨关节炎软骨的降解[31]。另外，与Bmal1相关的除了转化生长因子β通路，NAFTC2通路也不容忽视，而且NFATc2的缺失导致软骨细胞代谢失衡，引起炎症途径(包括白细胞介素1b和白细胞介素6)过度表达、分解代谢途径(包括Mmp13、Adamts5和TIMP1)过度表达、合成代谢信号(包括Sox9、蛋白多糖和Ⅱ型胶原a1)的减少[32]。NFATc1、NFATc2敲除小鼠引起自发性膝骨关节炎，该表型包括了人类膝骨关节炎的所有主要特征，即基质分解代谢、骨赘形成和普遍性软骨下骨改变[33]。此外，BROWN等[34]认为，昼夜节律的失调可合理解释高龄与膝骨关节炎易感性之间的关系。究其机制，可能与膝骨关节炎患者软骨细胞衰老相关，Bmal1蛋白在老年关节软骨中表达量的减少和昼夜节律幅度的降低可导致细胞衰老，衰老的细胞可通过氧化应激反应产生白细胞介素6、白细胞介素1等炎症因子和基质金属蛋白酶13、基质金属蛋白酶14等基质金属蛋白酶而导致膝骨关节炎的发生[35]。作者通过进一步检测发现，从肝论治取穴对膝骨关节炎大鼠Bmal1、Clock基因与蛋白具有较好的调节作用，并且较常规取穴有明显优势。
膝骨关节炎患者的疼痛常表现为夜间疼痛加剧而白昼疼痛缓解[36-37]，这种疼痛规律性变化是昼夜节律紊乱的表现形式，与中医肝的功能异常密切相关。中医肝的含义与解剖上的肝脏器官不同，而是作为主疏泄、调畅人体气机的脏器，涉及内分泌、神经、循环、消化、生殖等系统[38]，在五脏中占有举足轻重的地位。研究认为，肝主疏泄是其核心生理功能，通过疏泄畅达全身气机，使人体生命活动呈节律性变化[9]。此次研究认为膝关节功能活动受昼夜节律的影响，运动时软骨呈磨损状态，静止时软骨呈修复状态，而生物钟能平衡软骨的磨损与修复，防止软骨过于磨损形成膝骨关节炎，这种规律受肝脏的调控作用。
综上所述，从肝论治取穴针灸治疗膝骨关节炎可以有效减轻关节疼痛，改善关节活动功能，减轻关节退变程度，提升关节软骨组织中Bmal1、Clock基因与蛋白的表达。但不足的是，在实验过程中所采用的模型与临床膝骨关节炎有一定区别，其病理过程不完全一致；其次，在指标选择过程中，没有检测目前所涉及的所有昼夜节律蛋白或基因，后续实验中会进一步完善和改进。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

从肝论治取穴针灸治疗膝骨关节炎模型大鼠关节功能与昼夜节律的关系

Relationship between joint function and circadian rhythm in a rat model of knee osteoarthritis undergoing acupuncture and moxibustion at acupoints selected based on liver theory

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