创伤性神经瘤模型的构建及评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2431

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (5): 716-719.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2431

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创伤性神经瘤模型的构建及评价

汪靖^1，2，鲁长风²，彭江²，朱晨³，许文静²，程晓清²，方杰²，朱亚琼²，赵燕旭²，蒋雯²，徐宏光¹，王玉²

¹皖南医学院第一附属医院(弋矶山医院)脊柱外科，安徽省芜湖市 241001；²解放军总医院骨科研究所，北京市再生医学重点实验室，全军战创伤重点实验室，北京市 100853；³中国科学技术大学附属第一医院安徽省合肥市 230000

收稿日期:2019-06-11 修回日期:2019-06-12 接受日期:2019-07-20 出版日期:2020-02-18 发布日期:2020-01-09
通讯作者: 徐宏光，博士，教授，皖南医学院第一附属医院(弋矶山医院)脊柱外科，安徽省芜湖市 241001 王玉，博士，副研究员，解放军总医院骨科研究所，北京市再生医学重点实验室，全军战创伤重点实验室北京市 100853
作者简介:汪靖，男，1992年生，安徽省黄山市人，汉族，皖南医学院在读硕士，主要从事周围神经再生、神经修复、神经瘤研究。并列第一作者：鲁长风，男，1991年生，湖北省咸宁市人，汉族，北京大学在读博士，主要从事周围神经再生，神经修复研究。
基金资助:
北京市自然科学基金面上项目(7172202)；全军医学科技青年培育计划拔尖项目(16QNP144)

Establishment and evaluation of traumatic neuroma model

Wang Jing^{1, 2}, Lu Changfeng², Peng Jiang², Zhu Chen³, Xu Wenjing², Cheng Xiaoqing², Fang Jie², Zhu Yaqiong², Zhao Yanxu², Jiang Wen², Xu Hongguang¹, Wang Yu²

¹Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College (Yijishan Hospital); ²Institute of Orthopaedics of PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine, the Key Laboratory of National Military Warfare; ³the First Affiliated Hospital of University of Science and Technology of China

Received:2019-06-11 Revised:2019-06-12 Accepted:2019-07-20 Online:2020-02-18 Published:2020-01-09
Contact: Xu Hongguang, MD, Professor, Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College (Yijishan Hospital), Wuhu 241001, Anhui Province, China Wang Yu, MD, Associace researcher, Institute of Orthopaedics of PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine, the Key Laboratory of National Military Warfare, Beijing 100853, China
About author:Wang Jing, Master candidate, Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College (Yijishan Hospital), Wuhu 241001, Anhui Province, China; Institute of Orthopaedics of PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine, the Key Laboratory of National Military Warfare, Beijing 100853, China Lu Changfeng, MD candidate, Institute of Orthopaedics of PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine, the Key Laboratory of National Military Warfare, Beijing 100853, China Wang Jiang and Lu Changfeng contributed equally to this work.
Supported by:
the General Project of the Natural Science Foundation of Beijing, No. 7172202; the Youth Development Program of Military Medical Science and Technology, No. 16QNP144

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
神经瘤：1811年Odier首先提出神经瘤的概念，周围神经受到创伤后，神经纤维断裂，神经轴突在变性的基础上开始再生，在神经纤维的再生过程中，两断端组织增生过多，断端再生的轴突因瘢痕障碍，不能成功长入远端神经中，近端轴突和胞体在内源性神经生长因子及其靶器官分泌的神经生长因子的刺激和诱导下，持续在障碍物上向各个方向出芽生长、卷曲、甚至反折、相互缠绕，加之期间的纤维结缔组织生长、增生，并逐渐增长形成以纤维结缔组织为主的假性神经瘤。
神经纤维瘤病：为常染色体显性遗传病，是基因缺陷使神经嵴细胞发育异常导致多系统损害。创伤性神经瘤需与肥大性瘢痕及神经纤维瘤鉴别，后两者也可在外伤后发生，但组织学显示增生组织主要为胶原和成纤维细胞，无神经组织改变。

背景：创伤性神经瘤是周围神经损伤的常见并发症，国内外通过创伤性神经瘤模型进行周围神经修复、再生的基础研究较少见。

目的：建立创伤性神经瘤模型并进行鉴定。

方法：实验方案经中国人民解放军总医院动物实验伦理委员会批准。选择15只8周健康SD大鼠，显微镜下暴露坐骨神经，用显微剪剪断股后皮神经以远1 cm处的坐骨神经，11-0显微线将神经近端缝合于周围肌肉上，远端神经反折后旷置，3周后使用超声和组织学验证神经瘤是否形成。

结果与结论：①造模3周后，超声可见近端神经明显梭形膨大，为一低回声实质结节，不伴回声；②大体观察可观察到近端神经膨大，质稍硬，纤维结缔组织增生，与周围组织粘连；③苏木精-伊红染色可见瘤体内纤维组织增生，神经纤维杂乱生长，免疫荧光染色(S100、NF200)可见瘤体内许旺细胞和神经轴突不规则增生；④结果表明：实验成功构建了创伤性神经瘤模型。

ORCID: 0000-0002-3134-5488(汪靖)；0000-0002-4517-734X(鲁长风)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 周围神经, 周围神经损伤, 神经再生, 神经瘤, 大鼠, 动物模型

Abstract:

BACKGROUND: Traumatic neuroma is a common complication of peripheral nerve injury, and basic research on peripheral nerve repair and regeneration through a traumatic neuroma model is rarely reported.

OBJECTIVE: To establish and identify a traumatic neuroma model.

METHODS: The study was approved by the Laboratory Animal Ethical Committee of Chinese PLA General Hospital. Fifteen healthy Sprague-Dawley rats aged 8 weeks old were selected to expose the sciatic nerve under microscope, and the sciatic nerve was cut 1 cm away from the posterior gluteal muscle branch using microscissors. The proximal nerve was sutured to the surrounding muscle with 11-0 microlines, and the distal nerve was left open and reflexed. After 3 weeks, ultrasonic and histological examinations were used to verify the formation of neuroma.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Ultrasound: After 3 weeks of modeling, the proximal nerve showed obvious spindle enlargement, which was a hypoechoic parenchymal nodule without echo. (2) Gross observation: The proximal nerves were enlarged and slightly stiffened, with fibrous connective tissue hyperplasia and adhesion to the surrounding tissues. (3) Hematoxylin-eosin staining indicated hyperplasia of fibrous tissue and disorderly growth of nerve fibers in the tumor. Immunofluorescence staining (S100, NF200) revealed irregular hyperplasia of Schwann cells and nerve axons in the tumor. (4) These results suggest that the model of traumatic neuroma is successfully constructed.

Key words: peripheral nerves, peripheral nerve injury, nerve regeneration, neuroma, rats, animal models

中图分类号:

汪靖, 鲁长风, 彭江, 朱晨, 许文静, 程晓清, 方杰, 朱亚琼, 赵燕旭, 蒋雯, 徐宏光, 王玉. 创伤性神经瘤模型的构建及评价[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 716-719.

Wang Jing, Lu Changfeng, Peng Jiang, Zhu Chen, Xu Wenjing, Cheng Xiaoqing, Fang Jie, Zhu Yaqiong, Zhao Yanxu, Jiang Wen, Xu Hongguang, Wang Yu. Establishment and evaluation of traumatic neuroma model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(5): 716-719.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计体内外观察检测性实验。

1.2 时间及地点实验于2019年3至5月在中国人民解放军总医院骨科研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 8周健康SPF级SD大鼠15只，体质量(220±10) g，雌雄不拘，实验动物由解放军总医院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.3.2 试剂和仪器小鼠来源NF200单克隆抗体(Sigma公司，美国)，兔来源S100单克隆抗体(Sigma公司，美国)，山羊抗兔IgG H&L/Alexa Fluor®594(NOVUS公司，美国)，山羊抗小鼠IgG H&L/Alexa Fluor®488(NOVUS公司，美国)，BX51手术显微镜(Olympus公司，日本)，超声诊断仪(Toshiba公司，日本)，IX70型光学显微镜(Olympus公司，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 建立创伤性神经瘤模型 SD大鼠采用3%戊巴比妥钠(4 mL/kg)腹腔注射麻醉，备皮，取左侧卧位，碘伏消毒右后肢，铺巾。取大鼠右后肢外侧纵型手术切口，逐层切开皮肤、筋膜和肌肉，暴露出坐骨神经，显微剪剪断股后皮神经以远1 cm处的坐骨神经，在显微镜下用11-0显微缝合线将神经近端缝合于周围肌肉上，远端神经反折后旷置。生理盐水冲洗，4-0线逐层缝合，待麻醉苏醒后提供食水饲养，见图1。

1.4.2 超声检测成瘤情况术后3周，3%戊巴比妥钠 (4 mL/kg)腹腔注射麻醉，备皮，充分暴露大鼠术区坐骨神经体表投影区，行二维超声检查，观察神经瘤大小，形态，回声等情况。

1.4.3 苏木精-伊红染色术后3周，按同样的方法麻醉、消毒铺巾，原切口暴露和分离近端神经瘤样的坐骨神经，取材，用40 g/L多聚甲醛固定24 h，30%蔗糖脱水24 h后行冰冻切片，切片至水2 min，苏木精染色1 min，自来水洗1 min，1%盐酸乙醇分化10 s自来水洗1 min，1%氨水返蓝30-60 s，自来水洗1 min，伊红染色30 s-5 min，自来水洗10 s，通风橱内体积分数100%乙醇Ⅱ，二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，中性树胶封固，晾干后，显微镜下观察。

1.4.4 免疫荧光染色切片置于PBS清洗后，取PBS浸洗 5 min，用体积分数10%山羊血清封闭1.5 h，PBS浸洗5 min，取小鼠来源NF200单克隆抗体与PBS按1∶400稀释，兔来源S100单克隆抗体与PBS按1∶200稀释震荡摇匀，滴加于切片上，平置于湿盒中，4 ℃过夜。第2天取出湿盒恢复室温30 min，取山羊抗兔IgG H&L/Alexa Fluor®594和山羊抗小鼠IgG H&L/Alexa Fluor®488与PBS液按1∶200稀释滴加于切片上避光孵育2 h，PBS浸洗5 min，取DAPI用PBS液按1∶200稀释滴加于盖玻片上常温下孵育15 min，PBS清洗，水溶性封片剂封固，观察。

1.5 主要观察指标 ①神经瘤模型超声诊断及大体观；②造模3周后近端神经组织学染色结果。

讨论

1811年Odier首先提出神经瘤的概念，周围神经受到创伤后，神经纤维断裂，神经轴突在变性的基础上开始再生，在神经纤维的再生过程中，两断端组织增生过多，断端再生的轴突因瘢痕障碍，不能成功长入远端神经中，近端轴突和胞体在内源性神经生长因子及其靶器官分泌的神经生长因子的刺激和诱导下，持续在障碍物上向各个方向出芽生长、卷曲、甚至反折、相互缠绕，加之期间的纤维结缔组织生长、增生，并逐渐增长形成以纤维结缔组织为主的假性神经瘤^[6-8]。

近年来，SHAH等^[9]通过使用止血钳钳夹大鼠坐骨神经的方式来制造神经瘤的模型，但是此种方式造成的神经损伤只是Sunderland Ⅳ级，并不能真正形成创伤性神经瘤。KERN等^[10]通过切除8 mm的大鼠胫神经来制造神经瘤模型，但是大鼠的神经再生能力强，当神经两断端距离过短时，部分神经束可从近端长入远端，从而部分恢复神经功能，而在组织学检测时也未见明显神经的神经瘤形成。在此次实验中，以大鼠股后皮神经以远1 cm处为标志点切断坐骨神经，这样可以精确损伤坐骨神经，同时将神经近端部分外膜缝合于周围肌肉中，这样可以避免神经的移位，方便后期评价时寻找神经。而神经的远端则反折后旷置，这样可以使断裂的神经近端无法生长到神经远端，两端神经之间也有肌肉等组织嵌入，增长的结缔组织包裹近端神经，同时神经鞘细胞局限性生长，加速创伤性神经瘤的形成。

目前，超声已成为诊断周围神经损伤的重要辅助手段。在超声下，正常的神经纵切面为中等回声管状结构，内部有线性的平行回声，横切面为圆形或者椭圆形的回声结构，内有点状回声，而创伤性神经瘤内正常的神经结构被破坏，典型超声表现为神经束状结构连续性完全中断，近端神经表现为圆形或者椭圆形低回声区^[11-12]。通过此次实验方法建立的神经瘤符合创伤性神经瘤的典型超声表现，该方法简便、无创且可靠，适合检测创伤性神经瘤形成的大小、血供和形态等情况。同时，作者用组织学染色进一步证实了此方法构建的创伤性神经瘤内组织的紊乱，炎症细胞浸润，许旺细胞和轴突增生，形态不规则。

临床上，创伤性神经瘤需与肥大性瘢痕及神经纤维瘤鉴别，后两者也可在外伤后发生，但组织学显示增生组织主要为胶原和成纤维细胞，无神经组织改变。KEIHOFF等^[13]研究表明，神经瘤内含大量许旺细胞、内皮细胞、神经轴突以及胶原纤维等生物活性成分。ANAND等^[14]表明神经瘤组织内神经生长因子、细胞外基质等也较正常神经有所增加^[15]，这些物质可以构成神经再生的微环境。因此明确神经瘤内的成分，将神经瘤组织用于修复周围神经缺损将是进一步研究的方向。

实验通过切断坐骨神经造成神经缺损，神经近端缝合于肌肉，远端反折旷置，从而形成创伤性神经瘤模型，并使用超声和组织学证实了这种方法构建创伤性神经瘤的动物模型的可行性、有效性。该模型简单、实用，可为今后进一步研究创伤性神经瘤提供可靠的模型基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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