兔耳郭软骨细胞的分离培养与鉴定

doi:10.12307/2022.660

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3633-3637.doi: 10.12307/2022.660

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兔耳郭软骨细胞的分离培养与鉴定

钟自玲1，2，瞿申红2，韩星2，吴迪2

1广西中医药大学研究生院，广西壮族自治区南宁市 530200；2广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈外科，广西壮族自治区南宁市 530016

收稿日期:2021-06-03 接受日期:2021-07-17 出版日期:2022-08-18 发布日期:2022-02-12
通讯作者: 瞿申红，博士，主任医师，广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈外科，广西壮族自治区南宁市 530016
作者简介:钟自玲，女，1996年生，四川省绵阳市人，汉族，广西中医药大学在读硕士，主要从事3D打印技术在耳鼻咽喉头颈外科的应用研究。
基金资助:
广西科技计划项目重点研发计划(桂科AB1850010)，项目负责人：瞿申红；广西医疗卫生适宜技术开发与推广应用项目(S2018039)，项目负责人：瞿申红

Isolation, culture and identification of rabbit auricular chondrocytes

Zhong Ziling1, 2, Qu Shenhong2, Han Xing2, Wu Di2

1Graduate School, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530016, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2021-06-03 Accepted:2021-07-17 Online:2022-08-18 Published:2022-02-12
Contact: Qu Shenhong, MD, Chief physician, Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530022, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhong Ziling, Master candidate, Graduate School, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530016, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Key Research and Development Plan of Science and Technology Plan Project of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. AB1850010 (to QSH); Medical and Health Appropriate Technology Development and Application Project of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. S2018039 (to QSH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
耳郭软骨：属于弹性软骨，由软骨组织及周围的软骨膜构成。软骨组织由软骨细胞和软骨基质构成，其中软骨细胞位于软骨陷窝内，染色浅淡，胞质弱嗜碱性，能合成和分泌软骨组织的基质和纤维；软骨基质是软骨组织的细胞外基质，呈固态，含有大量交织成网的弹性纤维，胶原原纤维较少，聚集蛋白聚糖，决定软骨的结构和功能特点。
MTT比色法：是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

背景：基于3D打印支架材料的耳郭畸形再造是近年来的研究热点，而软骨细胞在支架上能否正常生长是其关键问题。
目的：通过探讨兔耳郭软骨细胞的原代培养方法，为软骨细胞与组织工程学结合的应用奠定坚实基础。
方法：采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶序贯消化法获取兔耳郭软骨细胞，体外培养并传代。通过不同传代细胞的形态学观察、生长曲线绘制、番红O-固绿染色、甲苯胺蓝染色、维多利亚蓝染色及糖胺多糖表达水平测定，对软骨细胞进行鉴定。
结果与结论：①倒置相差显微镜观察耳郭软骨细胞正常形态为梭形及多角形，传代培养6代以后成明显长梭形，且增殖速度明显减缓甚至停滞；②生长曲线绘制显示软骨细胞第2-5代均能稳定成直线增殖趋势；③番红O-固绿染色显示兔耳郭软骨细胞的细胞核结构和细胞质结构清晰，具有良好的形态学特征；④甲苯胺蓝染色提示软骨基质在培养初期分泌较少，随着细胞融合的增多而逐渐增加；⑤维多利亚蓝染色显示软骨细胞有胶原纤维生成，提示其具有正常功能；⑥糖胺多糖表达水平测定显示软骨细胞有特异性糖胺多糖的分泌；⑦实验成功建立了兔耳郭软骨细胞原代培养的分离和鉴定体系，获得了具有生物活性、可以进一步运用于组织工程学研究的耳郭软骨细胞。

https://orcid.org/0000-0002-3721-4956 (钟自玲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 耳郭再造, 软骨细胞, 原代培养, 细胞鉴定, 序贯消化法

Abstract: BACKGROUND: Auricle deformity remodeling based on three-dimensional printing scaffold materials has become a focus in recent years, and whether chondrocytes can grow normally on a scaffold is the key issue.
OBJECTIVE: To investigate the primary culture methods of rabbit auricular chondrocytes, thereby laying a solid foundation for the application of chondrocytes combined with tissue engineering.
METHODS: Rabbit auricular chondrocytes were obtained by trypsin and type II collagenase sequential digestion method. The chondrocytes were cultured and subcultured in vitro. The chondrocytes were identified by morphological observation, growth curve drawing, safranin O-fast green staining, toluidine blue staining, Victoria blue staining, and glycosaminoglycan content determination.
RESULTS AND CONCLUSION: The normal morphology of auricular chondrocytes was fusiform and polygonal under inverted phase contrast microscope. After six generations of subculture, the cells became obviously long fusiform, and the proliferation rate slowed down or even stopped. The growth curve showed that the chondrocytes from the 2nd to 5th generations could proliferate in a straight line. Results of safranin O-fast green staining showed clear nucleus and cytoplasm structures of rabbit auricular chondrocytes, with good morphological characteristics. Results of toluidine blue staining indicated that the secretion of cartilage matrix was less at the initial stage of culture and increased gradually with the increase of cell fusion. Results of Victoria blue staining showed the formation of collagen fibers in chondrocytes, suggesting the normal function of chondrocytes. Results of glycosaminoglycans content determination showed the specific secretion of glycosaminoglycans in chondrocytes. Overall, the isolation and identification system of rabbit auricular chondrocytes in primary culture was successfully established, and the auricular chondrocytes with biological activity were obtained, which could be further used in tissue engineering research.

Key words: auricle reconstruction, chondrocyte, primary culture, cell identification, sequential digestion

中图分类号:

钟自玲, 瞿申红, 韩星, 吴迪. 兔耳郭软骨细胞的分离培养与鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3633-3637.

Zhong Ziling, Qu Shenhong, Han Xing, Wu Di. Isolation, culture and identification of rabbit auricular chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(23): 3633-3637.

图/表（结果） 4

2.1 倒置相差显微镜观察结果倒置相差显微镜下观察，原代兔耳郭软骨细胞在培养皿中12-16 h贴壁完成；一两天开始伸展，此时细胞体积较小，呈梭形或多角形；七八天铺满皿底，此时细胞排列紧密，呈“铺路石”样，见图1A。第6代兔耳郭软骨细胞刚接种时呈球形，12 h开始贴壁，24 h开始伸展，呈长梭形；72 h后细胞开始增殖，细胞生长增殖速度较前明显减缓甚至停滞，形成单层细胞，彼此不相接触，见图1B。兔第2代耳郭软骨细胞形态学特征见图1C，D，胰蛋白酶消化接种1 d后，细胞基质尚未完全伸展；B为第2代耳郭软骨细胞接种4 d后，细胞数目较前明显增加，细胞基质伸张程度明显增加，部分开始互相连接。

2.2 软骨细胞增殖功能测定结果各传代兔耳郭软骨细胞培养7 d内呈直线生长趋势，随着传代次数的增加，增殖速度减慢。随着培养时间的增加，细胞增殖速率达到平台期，见图2。

2.3 番红O-固绿染色结果番红O-固绿染色后正置荧光显微镜下观察，可见番红O是碱性染料可与核酸结合显示红色，固绿是酸性染料可与蛋白结合将显示蓝色或者绿色。染色后可以看到细胞核呈粉红色，但部分颜色被细胞质染色所覆盖，细胞质呈灰蓝色，见图3A。
2.4 甲苯胺蓝染色结果甲苯胺蓝染色后正置荧光显微镜下观察，可见兔耳郭软骨细胞呈紫蓝色，细胞基质呈蓝色，细胞内及细胞周围有紫色异染颗粒，证明兔耳郭软骨细胞合成和分泌蛋白聚糖，见图3B。
2.5 维多利亚蓝染色结果染色后于正置荧光显微镜下观察，可见细胞质呈红色，胶原基质特异性着色，证明原代培养的软骨细胞具有合成和分泌基质的能力，见图3C。

2.6 糖胺多糖表达水平测定结果各传代软骨细胞吸光度值结果见表1。各传代细胞组内比较，检测第1天和第2天的糖胺多糖表达水平相比差异无显著性意义(P > 0.05)，且传代细胞组间比较显示形成糖胺多糖的能力差异无显著性意义(P > 0.05)；但与空白对照相比，各传代细胞糖胺多糖表达水平吸光度相比差异均有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

耳郭畸形可分为先天性和后天损伤，先天性耳畸形作为新生儿常见疾病，其发生率约为出生人口比例的1∶6 000[1]。由于其无法预防，难以治疗，可直接影响患儿的身心健康[2]。其次由于耳郭软骨是弹性软骨，组织代谢活性较低，无血液供应，无神经组织和淋巴回流，因此耳郭软骨再生能力较弱，损伤后一般没有直接的软骨再生，而是形成致密的结缔组织瘢痕，难以彻底修复。正常外耳是一种具有柔韧性和弹性的精细三维结构，耳郭重建对耳鼻咽喉科医生来说是一种挑战[3-4]。
目前的主要治疗方式包括赝复体修复和肋软骨移植。赝复体修复即用具有生物相容性的耳假体植入耳部，支撑起耳部皮肤从而形成良好的耳部外观，该种方式具有良好的生物耐受性，但其术后假体外露导致感染需要二次手术取出，从而导致前功尽弃，使其不能成为最优的选择[5]。肋软骨移植是从患者获取肋软骨后进行雕刻和塑造使其具有耳郭形状，再植入耳郭，其需要医生具有强大的雕刻技术以及审美学，限制了该技术的广泛应用，另外自体吸收和胸廓并发症亦是需要尽可能避免的问题[3，6]。
耳郭软骨细胞接种于3D打印支架进行共培养后植入体内，从而成功地进行耳郭重建的案例逐渐增加[7]，为组织工程学在医疗行业的应用奠定了基础。正常组织中的软骨细胞位于软骨陷窝中，分离较普通上皮细胞等更加困难；与此同时，原代培养的细胞随着传代次数的增加，存在细胞老化以及功能降低的问题[8]，而细胞研究应用的前提是保证其与正常组织内的细胞无差别。因此如何利用有限的供体活组织收获尽可能多而且活性高的原代软骨细胞，对下一步的组织工程学研究显得非常重要。
此次研究希望采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶序贯消化法分离获取兔耳郭软骨细胞，体外培养并传代，通过形态学观察、生长曲线绘制、番红O-固绿染色、甲苯胺蓝染色、维多利亚蓝染色及糖胺多糖表达水平测定对软骨细胞进行鉴定，以获得足量具有生物学活性的耳郭软骨细胞用于组织工程学的进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验，组内比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年3-6月在广西壮族自治区人民医院科研实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取健康成年家兔2只，体质量2.5-3.0 kg，普通级，由广西医科大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK桂2020-0004，实验过程严格按照动物福利标准执行，经过广西医科大学动物实验伦理委员会批准。
1.3.2 仪器 CO2 细胞培养箱(Thermo，美国)，倒置相差显微镜(Olympus，日本)，正置荧光显微镜(Olympus，日本)；酶标仪(BioTek，美国)。
1.3.3 试剂 H-DMEM培养基(Gibco，美国)，Ⅱ型胶原酶(Sigma，美国)，0.25%胰蛋白酶 (Solarbio，北京)，体积分数10%胎牛血清(Gibco，澳洲)，青霉素-链霉素混合液(Solarbio，北京)，番红O-固绿染色液(Solarbio，北京)，甲苯胺蓝染色液(Solarbio，北京)，MTT(Meilunbio，大连)，二甲基亚砜(Meilunbio，大连)，PBS (Meilunbio，大连)，维多利亚蓝胶原纤维染色液(Bioss，北京)，木瓜蛋白酶(Solarbio，北京)，硫酸软骨素(Solarbio，北京)，阿利新蓝(Solarbio，北京)。
1.4 实验方法
1.4.1 兔耳郭软骨细胞的体外分离无菌条件下切取兔耳郭软骨，迅速将家兔耳郭软骨组织转移到超净工作台，剥离皮肤、血管及软骨膜，剪成 1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块。1×PBS(含青链霉素各 100 U/mL) 冲洗 3遍；加入 3 倍体积的 0.25%胰蛋白酶，置于 37 ℃恒温水浴振荡器消化 30 min，加入含体积分数10%胎牛血清的培养液中止消化，混匀后离心(1 000 r/min 5 min)，弃上清。加入 0.2%Ⅱ型胶原酶后置于37 ℃恒温水浴振荡器内消化6-8 h，直至大部分软骨块被消化后，离心1 000 r/min 5 min，弃上清。所得沉淀用PBS洗 3 次后进行体外培养。

1.4.2 兔耳郭软骨细胞的体外培养将体外分离的软骨细胞以1×108 L-1的细胞浓度接种在100 mm2培养皿中，用H-DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清，青链霉素各 100 U/mL)进行原代培养，每3 d换液1次，当细胞生长覆盖瓶底80%以上时，用0.25%胰蛋白酶进行消化，然后进行传代培养。

1.4.3 兔耳郭软骨细胞的鉴定
倒置相差显微镜观察：倒置相差显微镜观察体外培养家兔耳郭软骨细胞的形态，分析原代及传代软骨细胞的生长状况及其生命活动规律。
软骨细胞增殖功能测定：取生长状态良好的不同传代软骨细胞，0.25%胰蛋白酶消化，10%H-DMEM培养液制成单细胞悬液，计数后按每孔5×103个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL，分7组，每组设6个复孔共42孔，边缘孔用无菌PBS填充。将96孔板放入37 ℃、饱和湿度、体积分数5%的CO2培养箱中培养。分别在培养后的1-7 d，每天1组6个孔每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL/孔，于培养箱中继续孵育4 h终止培养，弃去上清液，加二甲基亚砜150 μL/孔，振荡10 min，在酶标仪上选择490 nm波长测各孔吸光度值，用平均吸光度值绘制各传代细胞的生长曲线。
番红O-固绿染色：取生长状态良好的兔耳郭软骨细胞进行细胞爬片，PBS清洗3次；40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，空气中干燥5 min，PBS清洗3次；Weigerts铁化苏木精染色5 min，自来水冲洗10 min，固绿室温下染色5 min，1%醋酸冲洗3次；番红O染色3 min，稍水洗，中性树脂封固。
甲苯胺蓝染色：取生长状态良好的兔耳郭软骨细胞进行细胞爬片，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，空气中干燥5 min，PBS清洗3次；甲苯胺蓝染色液染色10 min，稍水洗，风干爬片，中性树胶封固，正置荧光显微镜观察耳郭软骨细胞染色情况。酸性黏多糖与甲苯胺蓝结合，呈现异染现象，从而使软骨基质呈紫色。
维多利亚蓝染色：取生长状态良好的兔耳郭软骨细胞进行细胞爬片，PBS清洗3次；40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，空气中干燥5 min，PBS清洗3次；入维多利亚蓝染色液浸染15 min，PBS洗3次；丽春红染色液浸染15 min，无水乙醇分化数秒、脱水，中性树脂封固观察。维多利亚蓝染色液可使胶原纤维呈现红色。
糖胺多糖表达水平测定：取24孔板中生长状态良好的兔耳郭软骨细胞，每个孔中加入木瓜蛋白酶200 μL，三蒸水200 μL。三蒸水400 μL加入24孔板作为空白对照，37 ℃下放置24 h后，加入400 μL阿利新蓝溶液，混匀。10 min后，酶标仪测定490 nm处的吸光度值。糖胺多糖是软骨细胞外基质的组成成分，通过测定其表达水平，可以反映软骨细胞的活性及功能状态。
1.5 主要观察指标 ①兔耳郭软骨细胞形态；②细胞生长曲线；③番红O-固绿染色结果；④甲苯胺蓝染色结果；⑤维多利亚蓝染色结果；⑥糖胺多糖表达水平测定结果。
1.6 统计学分析应用SPSS 26.0统计软件(IBM公司，美国)进行统计学分析，计量资料用x±s表示，组内比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

耳郭重建的主要方法为赝复体修复和肋软骨移植，尽管现在有一些人支持使用同种异体移植，目前的临床实践仍然倾向于使用肋软骨移植。假体修复并不受大多数人的青睐，但对许多患者来说仍然是一个可行的选择，特别是那些遭受手术失败或创伤性耳郭畸形的患者[9]。肋软骨移植的缺点同优点一样显而易见，胸廓畸形和自体吸收的并发症亦是不容忽视的问题[3，10]。近年来，组织工程应用于耳郭重建的案例越来越多[11-17]，为耳郭重建修复提供了新方向，细胞结合组织工程学研究成为目前的热点。
耳郭软骨属于弹性软骨，损伤后修复很大可能形成与正常耳郭不同的纤维软骨。ISOGAI等[18]通过比较牛鼻中隔、关节、耳郭以及肋软骨等4个部位的软骨细胞，并与可降解聚合物支架复合培养，进行组织工程软骨建模；结果显示，虽然合成软骨细胞外基质能力有差异，但只有耳郭软骨细胞可合成弹性蛋白，并最终形成弹性软骨，这一结果为耳郭软骨的重建奠定了细胞学研究基础。从临床应用角度出发，患者畸形小耳的残存软骨是最佳的软骨细胞来源，因为是患者自身组织来源，所以显而易见地不会存在排异反应，具有极好的生物相容性。BERNSTEIN等[11]将这种方式运用在实际中，从手术获得的耳郭软骨残片中分离提取出人耳郭软骨细胞，体外传代培养。成功获得在组织学、生物化学和生物力学上与人耳郭软骨相似的弹性软骨，对人体的弹性软骨具有潜在的应用价值。在利用组织工程技术重建耳郭的过程中，要获得与正常耳大小相似的组织，对种子细胞软骨细胞的数量要求巨大，对生物学功能活性要求高[7，17，19-20]。由于通常情况下软骨细胞的来源有限，BERNSTEIN所在团队对人骨髓干细胞和耳郭软骨细胞进行混合培养，发现1∶1混合培养亦可获得满足要求的组织[12]。如何利用有限的供体活组织收获尽可能多而且活性高的原代软骨细胞，探索软骨细胞维持正常功能的极限，细胞培养的研究显得非常重要。
目前文献报道的可选择的酶消化法分离软骨细胞有单纯胶原酶消化或胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶分消化法[21-23]。邓林峡等[24]通过对取出的大鼠关节软骨分别采用Ⅱ型胶原蛋白酶单独消化法、胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶序贯消化法分离软骨细胞的对比研究发现：序贯消化法较单独消化法所得软骨细胞的纯度更高。故此次研究采用了胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶序贯消化法体外分离兔耳郭软骨细胞，结果该法能获得形态较好、生长活性高的软骨细胞。
KANG等[25]通过比较体外培养中传代数为1，2，5的软骨细胞的生长速率、活力、Ⅰ型和Ⅱ型胶原的合成及凋亡活性，拟解决体外和体内培养的软骨细胞是否能在三维支架中表达成软骨表型并形成软骨组织的问题；结果显示随着传代数的增加，细胞生长速率和活力下降，凋亡细胞增多；第2代软骨细胞Ⅱ型胶原高表达，Ⅰ型胶原低表达；第5代软骨细胞Ⅱ型胶原低表达，Ⅰ型胶原高表达，提示软骨细胞去分化。此次研究通过形态学观察和生长曲线观察提示第3，4，5代耳郭软骨细胞均能良好地增殖，且增殖速度无明显停滞；第6代以前的兔耳郭软骨细胞呈多角形或三角形，均没有向扁平及长梭形的成纤维样细胞转变，具有良好的生物学活性。
在软骨细胞爬片中，番红O-固绿染色可以分辨出细胞核与细胞质的结构，但分辨率不如苏木精-伊红染色清楚，这种分辨情况与软骨组织中2种染色的分辨情况正好相反，这可能是由于固绿与番红O相比更容易着色，而绿色可以覆盖部分红色使得结构相对不太清晰[26]。但番红O-固绿染色作为软骨细胞或软骨组织中的一种特异性染色，其使用率较高，作者在软骨细胞爬片上的实验也得到了预期效果，可以在软骨细胞的鉴定中加以应用。甲苯胺蓝染色有大块紫色异染部分，表明培养的兔耳郭软骨细胞可良好地表达特征性蛋白聚糖，证明软骨细胞具有良好的生物活性。进一步的维多利亚染色和糖胺多糖表达水平分析均定性、定量地证明了此次研究原代培养的耳郭软骨细胞具有正常的生理功能，可用于未来的研究中。
综上所述，此次研究采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶序贯消化法建立了兔耳郭软骨细胞体外分离及培养鉴定体系，可在短时间内获得高纯度、高存活率的软骨细胞，通过多方面的实验结果观察，证实第6代以前的兔耳郭软骨细胞具有稳定的细胞表型特征和良好的生长增殖活性。作者培养出了耳郭软骨细胞，目前的研究显示其能正常增殖和表达相关细胞外成分，可作为种子细胞应用于组织工程学研究。然而目前在耳郭软骨细胞的基因表达、蛋白质组成成分等方面尚未验证其是否与正常细胞存在差异，还需进一步的探索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

兔耳郭软骨细胞的分离培养与鉴定

Isolation, culture and identification of rabbit auricular chondrocytes

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[1]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[2]	许磊, 韩晓强, 张锦涛, 孙海飚. 关节软骨细胞周围透明质酸产生、转化和功能特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 768-773.
[3]	林旭晨, 祝海年, 王增顺, 祁腾民, 刘立民, 索南昂秀. 黄腐酚对骨关节炎模型小鼠炎性因子及关节软骨的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 676-681.
[4]	李石旦, 邢伟, 谢晓瑜, 李又彬, 王绍川, 费军. 提取人骨髓间充质干细胞的新方法与传统方法比较[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3814-3820.
[5]	谢艳, 李无阴, 邢伟鹏, 裴圆圆, 王娜. 抑制生长板软骨细胞凋亡药物筛选及白藜芦醇延迟大鼠骨骺闭合的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3644-3649.
[6]	周凡琦, 李宝莹, 王凯涛, 谭荃荃, 运晨霞, 冷静. 树鼩成纤维样滑膜细胞分离鉴定及TLR8通路相关分子检测方法的建立[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3721-3727.
[7]	韩志, 王志苗, 嘎西斯甲, 卢庆玲, 郭涛. 聚氨酯材料复合软骨细胞构建组织工程化软骨[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3455-3459.
[8]	王为, 汤翔宇, 易智谦, 刘朝旭. 骨关节炎诱导软骨细胞凋亡和细胞外基质降解的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(20): 3133-3140.
[9]	顾晓东, 李飞, 车先达, 李鹏翠. 骨关节炎软骨细胞凋亡与组蛋白去乙酰化酶4含量的降低[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(20): 3147-3151.
[10]	关鸿, 张宏博, 邵焱, 郭栋, 张海严, 蔡道章. PDZ结构域蛋白1缺失促进骨关节炎软骨细胞衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 182-189.
[11]	马笃军, 彭力平, 周紫琼, 赵静, 朱厚均, 蒋顺琬, 钟静, 佘锐豪. 基于CRISPR/Cas9技术编辑RAB39B基因对骨髓间充质干细胞软骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(19): 2978-2984.
[12]	刘海琴, 马华根, 唐元瑜. 原代大鼠脂肪间充质干细胞的体外培养扩增及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(19): 2953-2957.
[13]	师航, 李佳, 刘霞, 蒋海越. 基于单细胞转录组测序分析人肋来源软骨细胞的异质性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(19): 3011-3017.
[14]	曹舒兴, 宋永周, 李明, 张洪亮, 赵立辉, 马维. 姜黄素对H2O2诱导软骨细胞自噬的调控 [J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2161-2166.
[15]	杨爽, 闫景龙. 软骨细胞分化过程中SOX9的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2279-2284.