抑制生长板软骨细胞凋亡药物筛选及白藜芦醇延迟大鼠骨骺闭合的作用

doi:10.12307/2022.662

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3644-3649.doi: 10.12307/2022.662

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抑制生长板软骨细胞凋亡药物筛选及白藜芦醇延迟大鼠骨骺闭合的作用

谢艳，李无阴，邢伟鹏，裴圆圆，王娜

河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南省洛阳市 471002

收稿日期:2021-04-26 接受日期:2021-06-03 出版日期:2022-08-18 发布日期:2022-02-12
通讯作者: 李无阴，双学士，主任医师，河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南省洛阳市 471002
作者简介:谢艳，女，1972年生，河南省洛阳市人，汉族，1995年河南大学毕业，副研究员，主要从事骨伤科基础研究及药物研究。
基金资助:
河南省中医药科学研究专项课题(2018ZY1023)，项目负责人：谢艳

Screening of drugs for inhibiting growth plate chondrocyte apoptosis and the effect of resveratrol on delaying epiphyseal closure in rats

Xie Yan, Li Wuyin, Xing Weipeng, Pei Yuanyuan, Wang Na

Luoyang Orthopedic-Traumatological Hospital of Henan Province (Henan Provincial Orthopedic Hospital), Luoyang 471002, Henan Province, China

Received:2021-04-26 Accepted:2021-06-03 Online:2022-08-18 Published:2022-02-12
Contact: Li Wuyin, Chief physician, Luoyang Orthopedic-Traumatological Hospital of Henan Province (Henan Provincial Orthopedic Hospital), Luoyang 471002, Henan Province, China
About author:Xie Yan, Associate researcher, Luoyang Orthopedic-Traumatological Hospital of Henan Province (Henan Provincial Orthopedic Hospital), Luoyang 471002, Henan Province, China
Supported by:
Henan Provincial Special Project of Traditional Chinese Medicine Scientific Research, No. 2018ZY1023 (to XY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
生长板软骨：位于长骨两端骨骺和骨干之间的软骨组织，可分为储备带、增生带、肥大带。生长板长度生长取决于生长板原代细胞分裂的总数和由原代细胞衍生的子代细胞重复分裂的数目。细胞分裂速度受激素和机械因子的影响，但是每个生长板中原代细胞的总数可能是遗传决定的。
骨骺：是儿童出生后在不同时间内出现的二次骨化中心，也是儿童骨骼最薄弱和最易骨折的部位。骨骺闭合是指长骨两头骨骺线消失的现象，实际意义是指机体已经失去了自然长高的潜力。

背景：骨骺闭合长骨停止生长，骨骺闭合的直接诱因是生长板软骨细胞的凋亡。有报道芳香化酶抑制剂可以抑制雌激素的生成，而骨骼生长的停止是由于骨骺闭合引起的，因此推断芳香化酶抑制剂可以抑制生长板软骨细胞凋亡，延迟骨骺闭合。
目的：比较几种芳香化酶抑制剂(白藜芦醇、鹰嘴豆素A、亚麻木酚素)抑制大鼠生长板软骨细胞凋亡的效果，并对白藜芦醇延迟大鼠骨骺闭合促进长骨生长的作用进行验证。
方法：解剖大鼠胫骨及股骨生长板软骨，二步酶消化法体外分离获得生长板软骨细胞并进行培养，分别利用倒置相差显微镜及Ⅱ型胶原免疫荧光实验对软骨细胞进行形态学观察和鉴定。然后用白细胞介素1β诱发生长板软骨细胞凋亡，分别加入含有10，20，40，60 μmol/L的白藜芦醇培养液，5，10，20，30 μmol/L的鹰嘴豆素A培养液，1，10，20，40 μmol/L的亚麻木酚素培养液进行培养，比较各个浓度的药物对生长板软骨细胞凋亡的影响。将筛选出效果最好的药物白藜芦醇给予大鼠灌胃，观察其对大鼠胫骨平台骨骺闭合及对长骨生长的影响。
结果与结论：①适宜浓度的白藜芦醇、鹰嘴豆素A、亚麻木酚素均可以不同程度地抑制生长板软骨细胞凋亡，最佳抑制细胞凋亡的药物浓度分别为40，10，20 μmol/L，其中40 μmol/L白藜芦醇抑制生长板软骨细胞凋亡的效果最好；②而用40 mg/kg白藜芦醇给予大鼠灌胃处理，发现可以延迟大鼠胫骨平台的骨骺闭合促进长骨生长，为骨骼生长争取更长时间从而促进发育期骨骼增长。

https://orcid.org/0000-0001-7498-432X (谢艳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 芳香化酶抑制剂, 生长板软骨细胞, 凋亡, 药物浓度, 骨骺闭合

Abstract: BACKGROUND: Epiphyseal closure indicates the long bones stop growing, which is caused by the apoptosis of growth plate chondrocytes. It has been reported that aromatase inhibitors can inhibit the production of estrogen, and the cessation of bone growth is caused by epiphyseal closure. Therefore, it has been inferred that aromatase inhibitors can inhibit growth plate chondrocyte apoptosis and delay epiphyseal closure.
OBJECTIVE: To compare the effects of several aromatase inhibitors (resveratrol, biochanin A, and flax lignans) on inhibiting the apoptosis of rat growth plate chondrocyte and to verify the effect of resveratrol on delaying epiphyseal closure and promoting the growth of long bones in rats.
METHODS: Rat tibial and femoral growth plate cartilage samples were dissected, and growth plate chondrocytes were isolated and cultured in vitro by two-step enzyme digestion. Chondrocytes were morphologically observed and identified by inverted phase contrast microscope and type II collagen immunofluorescence experiments. Then interleukin 1β was used to induce apoptosis of growth plate chondrocytes. Cells were cultured with culture medium containing 10, 20, 40, and 60 μmol/L resveratrol, with culture medium containing 5, 10, 20, 30 μmol/L biochanin, or with culture medium containing 1, 10, 20, 40 μmol/L flax lignans to compare the effects of different concentrations of drugs on the apoptosis of growth plate chondrocytes. Resveratrol which had the best effect was administered to rats by gavage to investigate its effect on the epiphyseal closure of rat tibial plateau and the growth of long bones.
RESULTS AND CONCLUSION: Appropriate concentrations of resveratrol, biochanin A, and flax lignans could inhibit the apoptosis of growth plate chondrocytes to varying degrees. The best drug concentrations for inhibiting cell apoptosis were 40, 10, and 20 μmol/L in sequence, and 40 μmol/L resveratrol had the best effect on inhibiting the apoptosis of growth plate chondrocytes. Administration of 40 mg/kg resveratrol by gavage could delay epiphyseal closure of tibial plateau and promote the growth of long bones in rats. Therefore, resveratrol can promote bone growth during developmental period by prolonging the time of bone growth.

Key words: aromatase inhibitors, growth plate chondrocytes, apoptosis, drug concentration, epiphyseal closure

中图分类号:

谢艳, 李无阴, 邢伟鹏, 裴圆圆, 王娜. 抑制生长板软骨细胞凋亡药物筛选及白藜芦醇延迟大鼠骨骺闭合的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3644-3649.

Xie Yan, Li Wuyin, Xing Weipeng, Pei Yuanyuan, Wang Na. Screening of drugs for inhibiting growth plate chondrocyte apoptosis and the effect of resveratrol on delaying epiphyseal closure in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(23): 3644-3649.

图/表（结果） 11

2.1 软骨细胞形态可于倒置相差显微镜下观察到刚接种的软骨细胞呈小圆球形，悬浮在培养液中，细胞体积大小相似，折光性较强，随着培养时间延长，软骨细胞逐渐增大，胞核与核仁也逐渐清晰。培养2 d后细胞开始逐渐贴壁，多呈圆形或椭圆形增大，伸长形成伪足，见图1A。培养4 d后软骨细胞呈扁平状，不规则卵圆形或三角形，有成簇及重叠生长现象出现，见图1B。培养6 d后软骨细胞90%融合形成单层，细胞形态不规则，呈多边形，星形等，胞体丰富，胞浆均匀，相互密集连接呈“铺路石”状外观，见图1C。3代后细胞大多为长梭形，遮光性差。部分细胞由贴壁状态脱落，悬浮于培养液中，见图1D。

2.2 软骨细胞免疫荧光鉴定结果 Ⅱ型胶原是软骨细胞分泌的特异性胶原，可利用其免疫荧光对软骨细胞进行鉴定。大鼠生长板软骨细胞经培养72 h后进行免疫荧光实验，结果显示，在荧光倒置相差显微镜下，细胞质被激发出清晰红色荧光，细胞核经DAPI染色后在不同波段荧光激发出蓝色荧光，见图2，表明分离培养的细胞表达特征性Ⅱ型胶原，符合软骨细胞的生物学特征，证明此次实验方法能够分离培养出纯度较高的软骨细胞，可供进一步实验研究使用。

2.3 软骨细胞生长曲线细胞第1-3天为生长潜伏期，第4-6天为对数生长期，第6-7天达到平台期，从第7天开始出现生长抑制现象，见图3。

2.4 白藜芦醇、鹰嘴豆素A、亚麻木酚素抑制生长板软骨细胞凋亡的初步药物浓度筛选白藜芦醇、鹰嘴豆素A、亚麻木酚素适宜浓度对生长板软骨细胞有增殖作用。白藜芦醇40 μmol/L、鹰嘴豆素A 10 μmol/L、亚麻木酚素20 μmol/L对生长板软骨细胞增殖作用效果更好，与正常对照组相比增殖效果差异有显著性意义(P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01)；各溶剂对照组与正常对照组相比差异无显著性意义；各非造模+用药组与正常对照组相比差异无显著性意义，见表1-3。

2.5 流式细胞仪检测药物抑制白细胞介素1β引起的细胞凋亡正常对照组几乎全部为正常活细胞；模型对照组早期凋亡和中晚期凋亡细胞较多；而5 μmol/L的来曲唑均可以抑制生长板软骨细胞凋亡；白藜芦醇40 μmol/L、鹰嘴豆素A 10 μmol/L、亚麻木酚素20 μmol/L也可以抑制生长板软骨细胞的凋亡，作用优于来曲唑，见图4。

2.6 白藜芦醇、鹰嘴豆素A、亚麻木酚素抑制生长板软骨细胞凋亡的作用比较白细胞介素1β可以很明显地引起细胞凋亡，大鼠生长板软骨细胞在40 μmol/L白藜芦醇、10 μmol/L鹰嘴豆素A、20 μmol/L亚麻木酚素刺激48 h情况下，抑制细胞凋亡作用明显，且效果优于阳性对照来曲唑；其中白藜芦醇抑制生长板软骨细胞凋亡的效果最好，见图5。

2.7 白藜芦醇对大鼠骨骺闭合及对长骨生长的影响当正常对照组大鼠胫骨平台骨骺闭合例数超过2/3时，用药组和阳性对照组的骨骺闭合例数均少于正常对照组(P < 0.05)，结果见表4。可以清晰看到正常对照组大部分胫骨平台骨骺闭合，用药组及阳性对照组大部分骨骺未闭合，见图6。而用药组和阳性对照组的大鼠胫骨长度大于正常对照组(P < 0.01，P < 0.05)，见表5。

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引言

人体骨骼增长的结束是骨骺闭合产生的结果，而骨骺闭合是以生长板软骨细胞的凋亡为直接诱因，由生长后期过高的雌激素导致的，雌激素是主要的女性性激素，主要由卵巢分泌或者雄性激素经芳香化酶转化而来[1]。女性身体中的部分和男性身体中的大部分雌激素都是以雄激素为来源，从皮肤、脂肪、神经等周边组织由芳香化酶转化而来。芳香化酶是一种以辅酶Ⅱ(NADPH)为辅酶、细胞色素P450为介质的混合功能氧化酶，其催化雄激素向雌激素的转变[2]；导致睾丸酮和雄烯二酮去甲基和A环芳香化而分别转变为17β-雌二醇和雌酮，而芳香化酶抑制剂可以抑制这一反应。由于芳香化反应是类固醇激素生物合成过程中独特的反应，而且雌激素是这种反应的最终产物，所以芳香化酶抑制所致的雌激素减少不会影响其他类固醇激素的产生[3-4]，这正是芳香化酶抑制剂可能应用于临床之所在[5-7]。
白藜芦醇是一种二苯乙烯类多酚物质，存在于虎杖、葡萄等多种植物中，具有广泛的药理学活性，其结构与雌激素相似，对雌激素受体具有对抗性。白藜芦醇能抑制MCF-7aro细胞芳香化酶活性( IC50为25 μmol/L)，其作用属于混合型抑制，同时还可减少芳香化酶的表达和生成[8]。鹰嘴豆素A是从红色三叶草中提取的异黄酮，结构与雌二醇相似[9]。WANG 等[10]报道鹰嘴豆素A通过抑制芳香化酶活性而抑制转染MCF-7aro细胞的增殖，其IC50达到 8 μmol/L。木酚素是一种植物多酚，结构与人雌激素十分相似，许多谷物中都含有木酚素，亚麻籽中含量最高(亚麻木酚素)[11]。食用木酚素后经肠道微生物酵解转化为肠内酯及肠二醇，肠内酯及肠二醇都具有较弱的雌激素和抗雌激素活性[12]。作者的前期预实验发现天然产物来源的白藜芦醇、鹰嘴豆素A和亚麻木酚素均可以抑制细胞凋亡，但是发挥药效的最适浓度未可知，目前国内外也无相关报道。因此，对这3种芳香化酶抑制剂抑制生长板软骨细胞凋亡的最适浓度进行筛选并比较药效，同时在大鼠活体验证了效果最好的白藜芦醇确实可以延迟骨骺的闭合，促进长骨生长，可为发现效果良好的芳香化酶抑制剂抑制体内过多的雌激素生成、从而延迟骨骺的闭合、促进骨骼增长提供理论支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞水平及动物体内药效实验，计量资料采用方差分析，计数资料采用卡方检验进行数据统计。
1.2 时间及地点实验于2019年8月至2020年4月在河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)医学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 2只4周龄SD大鼠，雄性，SPF级，体质量80-100 g，购于河南省实验动物中心，动物合格证号：2017-0001，购买来即处死进行细胞培养。18只3月龄SD大鼠，雄性，体质量280-300 g，体质量差异无显著性意义(P > 0.05)，SPF级，购于河南省实验动物中心，动物合格证号：2017-0001。
动物饲养环境温度20-24 ℃，湿度50%-70%，12 h明暗交替，光照7：00-19：00，噪声< 50 dB。实验中对实验动物的处置符合科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中的有关规定。
1.3.2 主要试剂戊巴比妥钠(分析纯，德国Merck公司，批号：20150408)，0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA，Gibco，货号：25200-072)，胎牛血清(iCell，货号：iCell 0500)，DMEM/F12(iCell，货号：iCell-0005)，白细胞介素1β(CTESTINGBIO，货号：CS38907H)，来曲唑(CTESTINGBIO，货号：112809-51-5)，白藜芦醇(Zzstandard，货号：ZC-49948)，鹰嘴豆素A(Zzstandard，货号：ZTO-B4098)，亚麻木酚素(Zzstandard，货号：158932-33-3)，MTT(碧云天，货号：ST316)，胶原蛋白酶Ⅱ(Gibco，货号：17101015)，锥虫蓝染色液(0.4%，Solarbio，货号：C0040)，40 g/L多聚甲醛(Solarbio，货号：P1110)，封闭山羊血清(Solarbio，货号：SL038)Fluoromount-G (Thermo Fisher Scientific，货号：00-4958-02)，Collagen Type II Antibody (Proteintech，货号：15943-1-AP)，ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡检测试剂盒(Solarbio，货号：CA1020)。
1.3.3 主要仪器细胞培养孔板(上海卧宏生物科技有限公司，型号WHB-24)；恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司，型号：DK-600S)；37 ℃恒温细胞培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂，规格型号：BC-J160S)；高速离心机(Thermo Fisher，货号：75004250)；高级分析倒置显微镜(Nikon，型号：DS-Ri2)；多功能酶标仪(LabsystemsMultiskan MS，芬兰，352型)；电热恒温震荡水槽(上海精宏实验设备有限公司，型号：DK-2B)；血球计数板(Marienfeld，型号：Neubauer improved)；德国MiltenyiMACSQuant Analyzer流式细胞仪(Miltenyi，型号：130-092-197)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠生长板软骨细胞分离培养及鉴定取2只4周龄SD大鼠，2%的戊巴比妥钠以3 mL/kg腹腔注射麻醉脱颈椎处死后浸入体积分数75%乙醇中消毒10 min。然后取出股骨及胫骨，剪碎成约1 mm3大小的碎块，使用无菌PBS清洗数次后加入1%Ⅱ型胶原酶2 mL，37 ℃水浴锅振荡消化5 h后，用200目不锈钢滤网过滤，滤液1 000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，PBS清洗2次。用DMEM/F12完全培养基(含体积分数10%的胎牛血清，pH 7.2)反复吹打混匀，制成细胞悬液。血球计数板计数，用锥虫蓝染色测定细胞的活力。将细胞悬液以1×108 L-1接种到装有含体积分数10%胎牛血清DMED/F12培养液的T25培养瓶中，置于37 ℃、含体积分数5%的CO2培养箱中培养。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，每2 d换液1次，3-5 d长满。取对数期生长的生长板软骨细胞，于24孔板中放置无菌盖玻片，每孔加入培养基1 mL，按2×104个/每孔的密度接种。培养过夜后将培养基吸出，PBS清洗1遍，加入40 g/L多聚甲醛于4 ℃固定30 min，再用PBS清洗3次，每次5 min。将盖玻片除去水分，取50 μL破膜封闭液(0.5% Trition X-100与PBS 1∶1混合，再加体积分数10%的山羊血清)滴于防水膜上，盖于玻片细胞面上透化2 h；然后滴加50 μL兔Ⅱ型胶原一抗工作液(PBS配置，一抗∶PBS=1∶100)，4 ℃孵育过夜，PBS清洗3次，每次5 min；再滴加Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG(H+L)荧光二抗工作液(PBS配置，二抗∶PBS=1∶500)，室温下避光孵育2 h，PBS清洗3次，每次5 min；最后滴加DAPI(DAPI∶PBS=1∶1 000)染色5 min，PBS清洗3次，每次5 min后，滴加Fluoromount-G包埋，荧光显微镜下鉴定培养的细胞为生长板软骨细胞。
1.4.2 MTT法筛选白藜芦醇、鹰嘴豆素A、亚麻木酚素对生长板软骨细胞凋亡抑制的最适药物浓度取对数期生长的大鼠生长板软骨细胞消化处理后，按1×104/孔接种于2个96孔板，留下6个孔继续加入普通培养液继续培养为正常对照组；以20 μg/L 白细胞介素1β诱导每孔细胞凋亡，为模型对照组；加入20 μg/L 白细胞介素1β同时加入含有10，20，40，60 μmol/L的白藜芦醇培养液，5，10，20，30 μmol/L的鹰嘴豆素A培养液，1，10，20，40 μmol/L的亚麻木酚素培养液进行培养，为各实验组；每孔加入20 μg/L 白细胞介素1β同时加入5 μmol/L来曲唑为阳性对照组；溶剂对照组加入配制3种药物的溶剂DMSO 20 μL；每一个药物的非造模+
药物组不诱导细胞凋亡，只加入白藜芦醇40 μmol/L或鹰嘴豆素A 10 μmol/L或亚麻木酚素20 μmol/L；每组设6个复孔。置于37 ℃，体积分数5% CO2培养箱培养48 h后，取出96孔板，将20 µL MTT (5 g/L)溶液加入到每个培养孔中，继续培养4 h后，取出96孔板，吸除培养基，每孔加入150 µL Formazan溶液，置摇床上低速振荡30 min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在A570 nm处测量各孔的吸光度值。
1.4.3 各药物对白细胞介素1β引起细胞凋亡的抑制作用培养的生长板软骨细胞以白细胞介素1β诱导细胞凋亡为模型对照组，同时加入40 μmol/L白藜芦醇、10 μmol/L鹰嘴豆素A、20 μmol/L亚麻木酚素和5 μmol/L来曲唑分别为3个实验组和阳性对照组，普通培养基培养的生长板软骨细胞为正常对照组。用1 mL Binding Buffer悬浮细胞，300×g离心10 min，弃上清；然后用1 mL Binding Buffer重悬细胞，使细胞浓度达到1×109 L-1。每管加入100 μL细胞(1×105个)，再向管中加入5 μL Annexin V-FITC，室温，避光，轻轻混匀10 min；加入5 μL PI，室温，避光，孵育 5 min；加入PBS至500 μL，轻轻混匀；在1 h内用流式细胞仪检测。观察各组细胞凋亡情况，并对凋亡率进行比较。
1.4.4 白藜芦醇延迟骨骺闭合及促进长骨增长的作用 3月龄SD大鼠18只，分为正常对照组(灌胃去离子水)，阳性对照组(来曲唑0.325 mg/kg灌胃)，用药组(白藜芦醇40 mg/kg灌胃)，每组6只。每15 d照射一次X射线片，观察胫骨平台骨骺闭合情况。直至正常对照组骨骺闭合2/3以上，统计所有骨骺闭合情况，比较组间差异。2%的戊巴比妥钠以3 mL/kg腹腔注射麻醉处死大鼠，取双侧胫骨，用游标卡尺测量胫骨长度，进行组间比较。
1.5 主要观察指标生长板软骨细胞凋亡、胫骨平台骨骺闭合情况及胫骨长度。
1.6 统计学分析以EXCEL软件录入数据，用SPSS 22.0进行统计分析。采用单因素方差分析对不同浓度药物对生长板软骨细胞凋亡的影响及大鼠给药后胫骨长度进行数据分析，组间两两差异采用LSD法，对不同组别大鼠胫骨平台骨骺闭合例数进行卡方检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

生长板(又称骺板)是存在于长骨骺与干骺端之间具有纵向生长能力的透明软骨，与骨的生长有关，其生理活动和生物学行为受全身内分泌(包括激素、生长因子)和局部旁分泌及自分泌(多种生长因子)的调控[13-15]。生长板软骨细胞作为软骨细胞的一种，Ⅱ型胶原是其特异型胶原，染色后在荧光倒置相差显微镜下，细胞质被激发出红色荧光，细胞核被激发出蓝色荧光，表明分离培养的细胞符合软骨细胞的生物学特征。给予白藜芦醇、鹰嘴豆素A和亚麻木酚素后可以看到活细胞数量的增多，MTT法显示其吸光度值也增高，实验表明，每一药物实验的非造模组(即不加入白细胞介素1β诱导细胞凋亡直接加入白藜芦醇、鹰嘴豆素A或亚麻木酚素)均与正常对照组无差异，说明药物本身没有促进细胞增殖的作用，而应用白细胞介素1β诱导细胞凋亡后加入药物均显示对细胞有增殖效果，说明此效果是由于药物抑制了细胞凋亡引起的。
来曲唑为第3代芳香化酶抑制剂，可以选择性地与细胞色素P450酶亚单位的血红素结合，抑制芳香化酶，有效降低雌激素水平[16-17]，近年来逐渐被应用于改善青春期矮小儿童身高及骨营养不良等[18-19]。林娟等[20]研究发现来曲唑可减小雌二醇对骨骼的作用，延缓骨骺闭合，改善青少年身高，且治疗时间越长，效果越明显，浙江大学医学院附属第一医院儿科团队发现来曲唑一方面可抑制雄性激素向雌激素转化，降低体内雌激素水平，延缓骨龄融合，另一方面可形成高雄性素血症，直接作用于生长板，具有促线性生长效应，从而改善青春期身材矮小症患儿的成年身高，但其副反应较多，安全性评估仍需大样本量、长期的观察[21]。天然产物是重要的先导化合物来源，从天然产物中筛选芳香化酶抑制剂是寻找芳香化酶抑制剂的主要途径之一[22]，白藜芦醇、鹰嘴豆素A、亚麻木酚素均是天然产物来源的芳香化酶抑制剂，其副反应小，10，20，40，60 μmol/L的白藜芦醇均有抑制生长板软骨细胞凋亡的作用，且随着浓度增加作用增强，但当浓度达到60 μmol/L时效果降低；当鹰嘴豆素A浓度为5，10，20 μmol/L时，也是随着药物浓度的提高抑制生长板软骨细胞凋亡的效果增强，但是当浓度达到30 μmol/L时其抑制效果降低；当亚麻木酚素浓度为1，10，20 μmol/L时，随着药物浓度的增加抑制生长板软骨细胞凋亡的作用逐渐增强，当浓度达到40 μmol/L时作用反而降低。通过与来曲唑阳性对照组比较，效果均优于来曲唑。而且流式实验结果也表明药物具有抑制生长板软骨细胞凋亡的作用。
而且研究发现，雌激素是促进骨龄成熟、触发骨骺闭合的关键因素[23-24]，雌激素在骨代谢中具有重要的作用，它一方面可以通过激活生长激素-胰岛素样生长因子1轴作用于生长板[25-27]，同时还可与雌激素受体结合后，经联级激活过程使软骨细胞增殖、分化、凋亡并促发钙化，限制软骨继续生长，加速骨骺闭合[28-29]。但是芳香化酶抑制剂在延缓骨龄的同时，也可能损害胰岛素样生长因子1在软骨板中的促进作用[30-31]，说明芳香化酶抑制剂对软骨板具有双重调节作用，筛选其最佳药物浓度显得尤为重要。此次实验发现，药物对大鼠生长板软骨细胞增殖的影响是双向的，适当的药物浓度和刺激时间可以促进细胞增殖；药物浓度过大和刺激时间过长都会抑制细胞增殖。此次实验证实，40 μmol/L白藜芦醇、10 μmol/L鹰嘴豆素A、20 μmol/L亚麻木酚素为抑制生长板软骨细胞凋亡的最佳药物浓度，且白藜芦醇的效果更好；而用40 mg/kg白藜芦醇给予大鼠灌胃后，可以明显延迟大鼠胫骨平台的骨骺闭合，延长大鼠骨骼的生长时间，且用药组和阳性对照组大鼠的胫骨长度较空白对照组增长。白藜芦醇做为天然产物来源的芳香化酶抑制剂，由于其毒副反应小，且效果显著，在延迟骨骺闭合、促进长骨增长方面的作用今后应用于临床的可行性很大，具有很好的临床使用前景。此次研究精确阐明了药物抑制生长板软骨细胞凋亡的最适药物浓度，且证明了可以延迟大鼠骨骺的闭合，促进长骨生长。作者在雌性和雄性大鼠均重复了上述实验，因为雌性与雄性大鼠的体内雌激素水平差异很大，所以分为不同批次做了重复实验，为了论文的简洁不进行雌性大鼠实验的重复报道。此次实验为明确芳香化酶抑制剂抑制骨骺闭合促进骨骼增长的作用及用量提供了实验数据，并为其今后适用于临床提供了有力的理论支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

抑制生长板软骨细胞凋亡药物筛选及白藜芦醇延迟大鼠骨骺闭合的作用

Screening of drugs for inhibiting growth plate chondrocyte apoptosis and the effect of resveratrol on delaying epiphyseal closure in rats

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