骨关节炎患者外周血淋巴细胞基因表达谱的生物信息学分析

doi:10.12307/2022.671

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3706-3713.doi: 10.12307/2022.671

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骨关节炎患者外周血淋巴细胞基因表达谱的生物信息学分析

杨威1，袁普卫2，杜龙龙2，李雪枫2，高启萌2，韩清民3

1广州中医药大学第三临床医学院，广东省广州市 510405；2陕西中医药大学，陕西省咸阳市 712046；3广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510405

收稿日期:2021-08-07 接受日期:2021-09-08 出版日期:2022-08-18 发布日期:2022-02-23
通讯作者: 韩清民，博士，主任医师，教授，博士生导师，广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510405
作者简介:杨威，男，1988年生，湖北省公安县人，汉族，广州中医药大学第三临床医学院在读博士，主治医师，主要从事中医药治疗骨伤疾病研究。
基金资助:
重大疑难疾病中西医临床协作试点项目-退行性骨关节病(广东)(国中医药办医政发[2018]3号)，协作单位项目负责人：韩清民

Bioinformatics analysis of gene expression profile of peripheral blood lymphocytes in patients with osteoarthritis

Yang Wei1, Yuan Puwei2, Du Longlong2, Li Xuefeng2, Gao Qimeng2, Han Qingmin3

1The Third Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, Shaanxi Province, China; 3the Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Received:2021-08-07 Accepted:2021-09-08 Online:2022-08-18 Published:2022-02-23
Contact: Han Qingmin, MD, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Yang Wei, MD candidate, Attending physician, the Third Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the Pilot Project of Clinical Collaboration between Traditional Chinese Medicine and Western Medicine for the Major and Difficult Diseases-Degenerative Osteoarthritis in Guangdong Province approved by State Council Medical Affairs Office, No. [2018]3 (to HQM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes，PBLCs)：是指血液循环中的淋巴细胞，由70%-80%的T细胞和20%-30%的B细胞组成，都是抗原特异性淋巴细胞，来源于造血组织，是机体免疫应答的重要细胞成分。
MAP2K7：全称为mitogen-activated protein kinase kinase 7，又名MKK7，丝裂原活化蛋白激酶激酶7，一种双特异性蛋白激酶，属于MAP激酶激酶家族。该激酶特异性激活 MAPK8/JNK1和MAPK9/JNK2，并且该激酶本身被包括MAP3K1/MEKK1、MAP3K2/MEKK2、MAP3K3/MEKK5和MAP4K2/GCK在内的MAP激酶激酶激酶磷酸化和激活，介导细胞对促炎细胞因子和环境压力的反应的信号转导。

背景：目前没有监测骨关节炎发生或进展的敏感标志物，检测骨关节炎活动期外周血基因表达谱变化，有助于探寻血液中精确的诊疗靶点及阐释发病机制。
目的：通过生物信息学方法分析骨关节炎患者与正常人外周血淋巴细胞基因表达谱差异，从分子层面探索血液中骨关节炎的诊疗靶点，为研究骨关节炎提供新思路。
方法：从GEO和ArrayExpress数据库中查找骨关节炎血液相关的芯片数据，并下载GSE63359数据集。筛选样本包括46例骨关节炎患者血液和26例健康人血液，其中女性患者32例(健康女性19例)。用R语言limma包分别筛选出男/女性骨关节炎和男/女性健康人之间的差异表达基因，用ggplot2包绘制火山图，ComplexHeatmap包绘制热图。设定阈值为 P < 0.05&|log2FC|> 0.5获取差异表达基因，然后制作韦恩图，得到8个差异表达基因：MAP2K7、CREBZF、CLK4、TRIM37、IL18RAP、LRRN3、BLNK和MS4A1；通过DAVID对差异表达基因进行GO和KEGG通路分析，并用R语言ggplot2包绘制气泡图。用STRING和Cytoscape软件构件PPI网络，Mcode和centiscape插件进行模块分析，Cytohubba筛选出关键基因。
结果与结论：共筛选出差异表达基因 115个，其中上调基因16个，下调基因99个，对所有差异表达基因进行GO富集分析主要集中在“淋巴细胞介导的免疫”“体液免疫反应”“抗原受体介导的信号通路”“B细胞受体信号通路”“免疫球蛋白介导的免疫反应”和“吞噬作用的正调控”等生物功能上；KEGG主要富集在5条与骨关节炎相关的通路上：造血细胞谱系、Th1和Th2细胞分化、Th17细胞分化、破骨细胞分化和TNF信号通路。利用PPI网络及相关插件筛选出10个与骨关节炎高度相关的关键基因，其中瘤坏死因子、CD19、转铁蛋白受体、配对框5、丝裂原活化蛋白激酶7、CD24、CD20和B细胞连接器8个核心基因与骨关节炎炎症和细胞凋亡高度相关。提示：通过生物信息学分析发现骨关节炎和健康人的外周血淋巴细胞基因表达差异集中在炎症反应和细胞凋亡，从而使血液表达谱成为监测骨关节炎靶点标记物和研究其潜在分子机制的有效突破口。

https://orcid.org/0000-0003-1264-8122 (杨威)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 外周血淋巴细胞, 基因表达谱, B细胞连接器, 跨膜4域A1, 炎症, 丝裂原活化蛋白激酶激酶7, 凋亡, 生物信息学

Abstract: BACKGROUND: At present, there are no sensitive markers for monitoring the occurrence or progression of osteoarthritis. The detection of changes in peripheral blood gene expression profiles during the active period of osteoarthritis is helpful to investigate the accurate diagnosis and treatment targets in the blood and explain the pathogenesis.
OBJECTIVE: To analyze the differences in the gene expression profiles of peripheral blood lymphocytes between osteoarthritis patients and healthy people by bioinformatics methods, and to explore the diagnosis and treatment targets of osteoarthritis from the molecular level in the blood, so as to provide new ideas for the study of osteoarthritis.
METHODS: We searched osteoarthritis blood-related chip data from Gene Expression Omnibus and ArrayExpress databases, and downloaded the GSE63359 data set. The screening samples included 46 osteoarthritis patients’ blood and 26 healthy people’s blood, including 32 female patients and 19 healthy women. The R language limma package was used to screen the differentially expressed genes between male/female osteoarthritis patients and male/female healthy people. The ggplot2 package was used to draw volcano plots, and the ComplexHeatmap package was used to draw heat maps. The threshold was set to
P < 0.05 & |log2FC|>0.5 to obtain differentially expressed genes, and then a Venn diagram was made to obtain eight differentially expressed genes: MAP2K7, CREBZF, CLK4, TRIM37, IL18RAP, LRRN3, BLNK, and MS4A1. DAVID was used to analyze the gene ontology and Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathways of differentially expressed genes, and the R language ggplot2 package was used to draw bubble plots. STRING and Cytoscape software were used to constructed protein-protein interaction network. Mcode and centiscape plug-in were used for module analysis, and the Cytohubba was used to screen out key genes.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 115 differentially expressed genes were screened out, including 16 up-regulated genes and 99 down-regulated genes. The gene ontology enrichment analysis of all differentially expressed genes mainly focused on “lymphocyte-mediated immunity,” “humoral immune response,” “antigen receptor-mediated signaling pathway,” “B cell receptor signaling pathway,” “immunoglobulin-mediated immune response,” “positive regulation of phagocytosis,” and other biological functions. Kyoto encyclopedia of genes and genomes was mainly enriched in five pathways related to osteoarthritis: hematopoietic cell lineage, Th1 and Th2 cell differentiation, Th17 cell differentiation, osteoclast differentiation and TNF signaling pathway. Protein-protein interaction network and related plug-ins were used to screen out 10 key genes, including 8 core genes, that were highly related to osteoarthritis: tumor necrosis factor, CD19, transferrin receptor, pairing box 5, mitogen-activated protein kinase 7, CD24, CD20 and B cell connection, which were highly related to osteoarthritis inflammation and cell apoptosis. The bioinformatics analysis indicates that the differences in peripheral blood lymphocytes cells gene expression between osteoarthritis patients and healthy people are concentrated in cell apoptosis and inflammation, and thus blood expression profile becomes an effective breakthrough for monitoring osteoarthritis target markers and studying its potential molecular mechanisms.

Key words: osteoarthritis, peripheral blood lymphocytes, gene expression profile, B cell linker, transmembrane 4 domain A1, inflammation, mitogen-activated protein kinase kinase 7, apoptosis, bioinformatics

中图分类号:

杨威, 袁普卫, 杜龙龙, 李雪枫, 高启萌, 韩清民. 骨关节炎患者外周血淋巴细胞基因表达谱的生物信息学分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3706-3713.

Yang Wei, Yuan Puwei, Du Longlong, Li Xuefeng, Gao Qimeng, Han Qingmin. Bioinformatics analysis of gene expression profile of peripheral blood lymphocytes in patients with osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(23): 3706-3713.

图/表（结果） 8

2.1 数据质量与差异分析于GEO2R在线平台上将GSE63359数据集分为男性骨关节炎组(OA-M)和男性健康人组(NC-M)，以及女性骨关节炎组(OA-F)和女性健康人组(NC-F)，分别有14，7，32和19例，利用R语言对男性组和女性组数据进行标准化，各样本中位数基本在一条水平线上，说明样本间归一化程度好，见图1。然后分别进行二维主成分分析，发现PC1及PC1/PC2不够大，说明分组间差异不够明显，主成分分析对组间差异解释有限，见图2。采用ComplexHeatmap包制作男性组和女性组热图，显示表达谱中高、低表达各Top20基因，具体见图3。

2.2 差异表达基因筛选结果利用ggplot2包分别对男性组和女性组制作全基因组火山图，设定阈值|log2FC|> 0.5，P < 0.05有统计学意义，男性组显著上调有6个基因，显著下调有89个基因；女性组显著上调有11个基因，显著下调有17个基因，然后绘制男性组和女性组韦恩图，两组共有的差异基因有8个：MAP2K7、CREBZF、CLK4、TRIM37、IL18RAP、LRRN3、BLNK和MS4A1，见图4。

2.3 差异表达基因的GO功能和KEGG通路富集分析对筛选得到的所有差异表达基因进行GO和KEGG富集分析，共富集到88条，其中在满足P.adj < 0.05 & q value < 0.05条件下，生物学过程共有24条，CC共有3条，MF共有4条，KEGG共有24条。BP主要富集在“淋巴细胞介导的免疫”“体液免疫反应”“抗原受体介导的信号通路”“B细胞受体信号通路”“免疫球蛋白介导的免疫反应”和“吞噬作用的正调控”等24条生物学过程上；CC富集在“质膜外侧”“MHC Ⅱ类蛋白质复合物”“MHC蛋白复合物”等细胞成分中；MF富集在“信号适配器活动”“SH3/SH2 适配器活动”“MHC 蛋白复合物结合”“核孔结构成分”等分子功能中；KEGG富集在造血细胞谱系、哮喘、炎症性肠病、同种异体排斥、利什曼病、移植物抗宿主病、1型糖尿病、Th1和Th2细胞分化、Th17细胞分化、破骨细胞分化和TNF信号通路等通路上。具体见表2和图5。

2.4 PPI网络分析及模块分析结果将筛选到的差异表达基因导入STRING在线平台，其结果导入Cytoscape-v 3.8.2中，得到PPI网络图，共有66个节点，105条互作关系，见图6；经MCODE筛选出4个集簇，展示得分均较低。然后使用cytohubba插件采用MCC、Degree和MNC算法筛选出连结度最高的前10个基因，再联合centiscape插件中度(Degree)、中介中心性(Betweenness)、特征向量(Eigenvector)和紧密度(Closeness)等参数以及对应的P值和log2FC值筛选核心基因，之后将Degree法和MCC法以及Degree法和MNC法筛选的前10基因分别取交集，最后两个交集中共同有8个差异基因为：TNF(肿瘤坏死因子)、CD19、TFRC(转铁蛋白受体)、PAX5(配对框5)、MAP2K7(丝裂原活化蛋白激酶激酶7)、CD24、MS4A1(跨膜4域A1)和BLNK(B细胞连接器)，见图7和表3。

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引言

骨关节炎是最常见的慢性关节病，以局部炎症反应和关节周围组织退行性改变为病理特点，临床表现以疼痛和关节功能明显丧失为主，严重影响患者生活质量，甚至导致死亡[1-4]。随着人类老龄化及肥胖的加剧，骨关节炎的患病率持续增长，影响全球约7%的人口，超过5亿人受累，给患者生活、医疗系统和社会经济发展带来巨大的负担[5-7]。骨关节炎的临床诊断主要基于X射线片和患者症状体征，绝大多数学者认为骨关节炎关节软骨的破坏主要由于软骨Ⅱ型胶原和蛋白多糖降解，滑膜或骨增生等，已有少数人发现骨关节炎患者滑膜中T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞聚集，且认识到其在骨关节炎炎症反应中的重要作用[8-9]，但是外周血淋巴细胞的相关作用未引起重视，并且尚无检测与骨关节炎诊断相关的外周血淋巴细胞中的敏感指标。
随着分子生物学的发展，与骨关节炎相关的血液生物学指标也逐渐增多。有研究报道在骨关节炎患者外周血中单核细胞/淋巴细胞比值明显高于健康对照组，且骨关节炎组单核细胞/淋巴细胞比值与血沉和目测类比VAS评分呈正相关[10]；赵广雷等[11]进一步发现，单核细胞/淋巴细胞比值和中性粒细胞/淋巴细胞比值在非骨关节炎及轻、重度骨关节炎患者中逐渐增高，并可以作为判别骨关节炎严重程度的血液学指标；最近研究也得出类似结论[12-13]，且单核细胞/淋巴细胞比值、中性粒细胞/淋巴细胞比值对全膝关节置换术后关节功能评估有参考意义。此次研究分析数据集中男性组和女性组外周血淋巴细胞样本，寻找与骨关节炎相关的差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)，去重后行基因本论(gene ontology，GO)富集、京都基因与基因组百科全书(Kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集和蛋白互作可视化网络(protein-protein interaction network，PPI network)分析，运用MCODE、cytohubba和centiscape插件筛选核心基因，为探索骨关节炎病机和寻找诊治的适宜分子靶点提供理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 数据来源从公共基因芯片数据平台GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)和Array-Express(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)数据库查找骨关节炎患者血液样本相关基因表达芯片，研究外周血淋巴细胞的数据集为GSE63359，该数据集纳入46例骨关节炎患者血液样本和26例健康人血液样本，其中女性患者32例，健康女性19例，男性患者14例，健康男性7例，纳入样本一般情况，见表1，所处平台为GPL96 [HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array，类型为表达谱芯片Expression profiling by array。

1.2 数据质量与差异分析利用GEO2R (http://ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)将数据集分为4组：男性骨关节炎、男性健康人和女性骨关节炎、女性健康人组，而后按照男女性别分别分析，通过GEOquery包[2.54.1版本]下载原始数据，使用R语言(3.6.3版本)的limma包[3.42.2版本]对样本进行一致性检验和主成分分析(principal component analysis，PCA)，用以检测样本的均一性、可重复性和组间差异性。ggplot2包[3.3.3版本]制作火山图，ComplexHeatmap包[2.2.0版本]和pheatmap包制作热图。
1.3 差异表达基因筛选使用R语言limma包分别对男性骨关节炎组和男性健康人组，以及女性骨关节炎组和女性健康人组分析，直接获取差异表达基因，并对结果去重，个别结果校正。设置筛选条件为P < 0.05&|log2FC|> 0.5[14]，用ggplot2包[3.3.3版本]绘制韦恩图。
1.4 差异表达基因的GO和KEGG富集分析使用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)对筛选出的差异表达基因进行经典的GO和KEGG通路富集。用R的clusterProfiler包[3.14.3版本]和org.Hs.eg.db包[3.10.0版本]处理数据。GO分析包括生物学过程(biological process，BP)、细胞成分(cellular components，CC)和分子功能(molecular funcition，MF)，用于预测蛋白质的功能。KEGG通路分析被用于将差异基因分配给特定的途径，从而分析出分子相互作用、反应和构建关系网络。P < 0.05为具有统计学意义。使用R语言ggplot2包绘制气泡图。
1.5 PPI网络构建及模块分析将所有差异表达基因输入STRING(https://string-db.org/)在线平台，设置combined score > 0.4，然后将计算结果导入Cytoscape-v 3.8.2中，构建PPI网络。这些相互作用包括物理和功能关联，数据主要来自计算预测、高通量实验、自动文本挖掘和共表达网络。PPI网络图中两点之间的连线代表两个基因具有直接作用的关系，一个蛋白相连接的蛋白点越多，代表这个蛋白在整个网络中的作用越重要。通过MCODE插件分析出PPI网络中连接最为紧密的基因集簇，使用cytohubba插件采用MCC[15]、Degree和MNC算法筛选出连结度最高的前10个基因[16-17]，再联合centiscape插件中Degree，Betweenness，Eigenvector，Closeness四个参数以及客观的P值和log2FC值综合分析筛选核心基因。

讨论

多数学者认为骨关节炎是一种慢性炎症性关节炎，其特点是持续性低级别炎症反应和先天免疫通路激活，与类风湿性关节炎等自身免疫性疾病不同[18-20]。巨噬细胞作为先天免疫的关键成分，被认为是骨关节炎发生发展的重要始发者，同时也能通过各种分泌介质参与适应性免疫，而在T细胞的作用下，巨噬细胞能演变为促炎和抗炎两种表型[21-22]，说明先天免疫和适应性免疫都参与骨关节炎的炎性反应。HARRELL等[23]认为先天免疫细胞(NK细胞、巨噬细胞和肥大细胞)在骨关节炎炎症早期发挥重要作用，而适应性免疫细胞(CD4+Th1细胞和B细胞)对骨关节炎炎症的慢性过程和复发影响大。
骨关节炎不仅是受累关节局部炎症变化，可能还是全身性炎症诱发的病变。在骨关节炎患者外周血中CD14+单核细胞最多，其次是CD4+T细胞、CD8+毒性T细胞和CD19+B细胞等[24]。ZHU等[25]发现，与健康人外周血淋巴细胞相比，骨关节炎患者CD4+T细胞、CD4/CD8、Treg、Th17、记忆T细胞和CD3-CD19+IgD+CD27-CD38lowCD21lowB细胞明显增加，Tc17和CD3-CD19+IgD-IgM-CD27+CD38+B细胞明显减少，而且CD3−CD19+CD27−IgD+ B细胞与血沉呈负相关，CD3+CD4+CXCR5−PD-1+ T细胞和Th17细胞与WOMAC疼痛评分正相关。国内外相关研究均发现骨关节炎患者外周血淋巴细胞明显变化，且血液相对滑液或滑膜更易于获取[26-27]，而将血液检测作为临床早期筛查骨关节炎的手段或评价其治疗效果的指标将备受关注。
此文主要研究外周血淋巴细胞，是指血液循环中的淋巴细胞，由70%-80%的T细胞和20%-30%的B细胞组成，都是抗原特异性淋巴细胞，来源于造血组织，是机体免疫应答的重要细胞成分。此次研究基于GSE63359数据集中所有血液样本，包括51例女性(骨关节炎32例，健康人19例)和21例男性(骨关节炎14例，健康人7例)，男性骨关节炎与男性健康人以及女性骨关节炎与女性健康人组年龄和体质量指数基线指标无差异。经过差异分析设定阈值P.adjust < 0.05 & |log2FC|> 0.5筛选得到男性组95个差异表达基因，女性组28个差异表达基因，两组共有的差异表达基因有8个：MAP2K7、CREBZF、CLK4、TRIM37、IL18RAP、LRRN3、BLNK和MS4A1，即共有115个差异表达基因，其中上调16个，下调99个，进行GO、KEGG和PPI分析，运用MCODE、cytohubba和centiscape插件筛选核心基因，采用MCC、Degree和M健康人法分别计算前10基因，取交集得到8个核心基因：TNF、CD19、TFRC、PAX5、MAP2K7、CD24、MS4A1和BLNK，其中MAP2K7、BLNK和MS4A1是男性和女性所共有的被认为是骨关节炎患者外周血淋巴细胞区别于健康对照有意义的生物学标志物。
GO分析显示，差异表达基因主要富集在“淋巴细胞介导的免疫”“体液免疫反应”“抗原受体介导的信号通路”“B细胞受体信号通路”“免疫球蛋白介导的免疫反应”和“吞噬作用的正调控”等生物功能上。差异表达基因的所有生物学功能主要与体液免疫、细胞免疫等淋巴细胞介导的适应性免疫相关，吞噬作用可能与巨噬细胞的吞噬作用相关。HUANG等[28]发现富血小板血浆可使骨关节炎患者体液和细胞免疫反应减轻，进而减轻患者炎性症状。在评估淋巴细胞对骨关节炎免疫反应作用突出[9]，而较少关注体液免疫的作用。KUROKI等[29]发现调节引起体液免疫反应的因素可能减轻骨关节炎犬持续或进展的症状。 XIE等[30]通过对来自健康对照、骨关节炎和类风湿性关节炎的895例血清中，检测抗瓜氨酸肽(ACPA)、抗氨基甲酰蛋白(抗Carp)和抗氧化胶原蛋白(抗ROS-CI/CII)抗体发现，尽管与类风湿性关节相比，骨关节炎所有翻译后修饰的自身抗体明显减少，但骨关节炎患者ACPA 5.9%，抗Carp 18.0%，Ⅱ型胶原17.3%和抗氧化Ⅱ型胶原29.8%，可见自身抗体均低表达，尤其是Ⅱ型胶原和抗氧化Ⅱ型胶原蛋白。巨噬细胞通过吞噬功能清除体内损伤或衰老细胞同时被崩解的损伤相关分子模式激活参与骨关节炎的发生发展[31]。
KEGG分析发现，差异表达基因主要富集在造血细胞谱系、Th1和Th2细胞分化、Th17细胞分化、破骨细胞分化、TNF信号通路、哮喘、炎症性肠病、同种异体排斥、利什曼病、移植物抗宿主病和1型糖尿病等24条通路上。造血细胞谱系是指造血干细胞分化为共同淋巴主细胞或共同骨髓主细胞，前者发育为T细胞、B细胞和NK细胞，后者发育为其余白细胞、红细胞、粒细胞和巨噬细胞等发展历程。前期研究发现，骨关节炎女性患者骨髓中破骨细胞的RANKL和脂肪细胞的PPAR-γ明显增多，且与年龄呈明显正相关，说明在衰老过程中，骨髓细胞谱系发生了明显变化，成骨细胞生成减少，脂肪生成和破骨细胞生成增加[32]。之后，KRIEGOVA
等[33]发现骨关节炎患者滑液含有90%的造血细胞、淋巴细胞和单核/巨噬细胞谱系为主，且女性患者CD4+T细胞、CD4+/CD8+比率和巨噬细胞明显高于男性患者。最近，GUILLEN FAJARDO等[34]发现外周血淋巴细胞中端粒丢失率增加可能反映一种系统性加速衰老表型，增加了骨关节炎的易感性。Th1、Th2和Th17细胞分化异常，导致比例失衡，陈龑等[35]认为Th1/Th2细胞比例失衡，可释放不同的细胞因子，激活细胞凋亡通路，造成软骨降解或滑膜炎症等，进而发展为骨关节炎。PENATTI等[36]通过对比骨关节炎和类风湿性关节炎患者外周血和滑膜，发现骨关节炎患者外周血Th17和Th1/Th17细胞明显高于类风湿性关节炎患者，而骨关节炎患者滑膜间室Th1/Th17细胞比类风湿性关节炎患者富集频率更高。骨关节炎患者外周血中T细胞具有更多细胞毒性或促炎因子特性，SAE-JUNG等[37]发现与健康人外周血比较，骨关节炎患者白细胞介素1β和肿瘤坏死因子等促炎因子明显增多。TNF信号通路在骨关节炎发生发展中意义重大，已经有相应的生物抑制剂用于治疗骨关节炎[38]。而哮喘、炎症性肠病、同种异体排斥等19条通路与骨关节炎没有直接关系，但都与免疫反应明显相关，可能形成局部免疫微环境，增加骨关节炎的易感性[16]。
通过PPI网络研究差异表达基因的相互关系，使用cytohubba插件采用MCC、Degree和M健康人法分别计算前10基因，取交集得到8个核心基因：TNF、CD19、TFRC、PAX5、MAP2K7、CD24、MS4A1和BLNK，其中TNF和MAP2K7上调，其余下调。MAP2K7又名MKK7，丝裂原活化蛋白激酶激酶 7，一种直接上游激酶，ZHANG等[39]发现GADD45β-I(一种靶向MKK7的细胞渗透性抑制剂)，通过Sirt3介导的内质网应激抑制保护软骨细胞对抗白细胞介素1β，靶向抑制MKK7可能是减少骨关节炎软骨细胞凋亡的理想策略。下调因子中CD19仅限于B细胞，激活导致磷脂酰肌醇3-激酶激活和细胞内Ca2+储存动员的信号通路，但CD19+B细胞在骨关节炎患者血中未见明显增多，而在类风湿性关节炎中显著增加，并与其肿胀、炎性反应明显相关[40-41]。
TFRC转铁蛋白，铁过载损害软骨细胞代谢[42]，局部炎症递质增加[43]，诱发骨关节炎，LUO等[44]发现脂多糖诱导的滑膜细胞转铁蛋白受体蛋白1上调，而淫羊藿苷不仅可缓解脂多糖的影响，还可以抵消铁死亡激活剂对滑膜细胞中铁死亡的细胞活力、脂质过氧化和铁含量的影响。PAX5促进前B细胞受体信号转导并促进发育为成熟B细胞，JI等[45]发现PAX5/miR-106a-5p/GLIS3轴在隐丹参酮介导的骨关节炎软骨保护中充当多效性调节剂，PAX5和miR-106a-5p激活以及GLIS3抑制可能成为治疗骨关节炎有用的靶点。CD24在成熟粒细胞和B细胞上表达，LEE等[46]通过评估幼年和成年软骨细胞以及人诱导多能干细胞衍生的新生儿软骨细胞的表达，将CD24确定为软骨炎症反应的新型调节剂，在发育和衰老过程中改变，可能对骨关节炎有治疗作用；类似研究，GRANDI等[47]应用健康和骨关节炎软骨样本建立的单细胞谱系揭示了不同软骨细胞祖细胞和炎症调节亚群，以CD24为标志的细胞，对炎症有抵抗力。MS4A1又名CD20，编码B细胞表面分子，在B细胞发育和分化为浆细胞中发挥作用，GEURTS等[48]评估了骨关节炎中骨髓炎性细胞的存在及其在硬化与非硬化区的相对丰度，免疫组化表明软骨下骨髓组织中存在CD20B细胞和CD68巨噬细胞，而没有CD3T细胞，并且硬化区较非硬化区明显增多，可能对骨髓免疫反应及软骨下骨重塑有作用。BLNK是B细胞发育中关键作用的衔接蛋白，在 ERK/EPHB2、MAP 激酶 p38 和 JNK 的激活中起作用，对激活 NF-κB很重要，但目前暂无与骨关节炎的相关报道。
差异表达基因的GO富集分析体液免疫占比很大，但是KEGG富集分析与T细胞相关免疫富集明显，而核心基因两者都有涉及。总体而言，此次研究发现利用生物信息学，对男性及女性外周血淋巴细胞基因谱分别分析，找到男女性共有的8个基因：MAP2K7、CREBZF、CLK4、TRIM37、IL18RAP、LRRN3、BLNK和MS4A1，进一步通过PPI网络研究差异表达基因的相互关系，使用cytohubba插件采用MCC、Degree和M健康人法分别计算前10基因，取交集得到8个核心基因：TNF、CD19、TFRC、PAX5、MAP2K7、CD24、MS4A1和BLNK，其中TNF和MAP2K7上调，其余下调。两者之间还有3个基因重叠：MAP2K7、BLNK和MS4A1。8个核心基因主要与骨关节炎炎症相关，其次是凋亡，可能是外周血淋巴细胞中区别于健康人的敏感标志物，有望通过血液检测及时识别骨关节炎并监测其疗效。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨关节炎患者外周血淋巴细胞基因表达谱的生物信息学分析

Bioinformatics analysis of gene expression profile of peripheral blood lymphocytes in patients with osteoarthritis

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