2.1   生物信息学工具预测结果   结合GSE120356芯片分析结果，取表达差异前6位的miRNA绘制热图。结果发现miR-376b-3p在骨关节炎患者关节软骨组织中的表达水平显著低于腰间椎盘突出患者，见图2A。通过LncRNASNP2数据库发现miR-376b-3p和LncRNA IFNG-AS1具有特异性结合位点，见图2B，IFNG-AS1在骨关节炎中的作用尚不清楚，有待进一步探究。在miRWalk和StarBase靶向关系预测网站找到miR-376b-3p的下游靶基因并绘制Venn图，见图2C，共有437个交集靶基因，将这些靶基因经DAVID网站进行基因本体和京都基因与基因组百科全书富集分析，根据显著富集程度分别从Biological process、Cellular component和Molecular function按照显著性选取前5个term绘制富集柱状图，见图2D，结果显示上述基因在基因本体分析中没有找到和此次研究相关的通路。
随后观察京都基因与基因组百科全书分析结果，发现上述基因在癌症相关通路(Pathways in cancer)、Ras信号通路和MAPK信号通路显著富集，见图2E，MAPK信号通路被证实是骨关节炎发病过程中的重要通路，因此将MAPK信号通路的term作为目标基因选取范围。借助STRING和DisGeNET在线工具发现AKT3在MAPK信号通路中与其他基因的关联性较强，见图2F，且和骨关节炎疾病风险基因连接紧密，见图2G。此外，鉴于AKT3在体外的骨关节炎中发挥恶性作用，将AKT3纳入此次研究。



2.2    IFNG-AS1在骨关节炎软骨组织和脂多糖诱导的软骨细胞中表达升高   形态学观察显示，分离的软骨细胞呈球形，大小均匀，易于悬浮，几乎不贴壁；培养48 h后，软骨细胞分化为椭圆形和梭形，细胞核细长，胞浆丰富；培养96 h后，软骨细胞生长迅速，分裂成更多的梭形细胞和多边形细胞，相互连接形成更多的细胞集落，见图3A。
免疫组化染色显示，在软骨细胞传代培养过程中，第2代软骨细胞色素沉着良好，第3代软骨细胞色素沉着较少，Ⅱ型胶原阳性软骨细胞和第4代软骨细胞色素沉着最少，见图3B。
用实时荧光定量PCR方法分析了33例骨关节炎软骨组织和正常软骨组织中IFNG-AS1的表达水平，发现IFNG-AS1在骨关节炎软骨组织中表达增加(均P < 0.05)，见图3C。随后，在脂多糖诱导的软骨细胞中检测IFNG-AS1水平，结果显示，经脂多糖处理后，IFNG-AS1水平以剂量依赖性方式显著上调(均P < 0.05)，见图3D。提示IFNG-AS1可能参与了骨关节炎的进展。



2.3    IFNG-AS1基因敲减抑制脂多糖诱导的软骨细胞损伤    为了进一步探讨IFNG-AS1在脂多糖诱导的软骨细胞生长中的作用，将si-IFNG-AS1转染到脂多糖(5 mg/L)刺激的软骨细胞中，进行IFNG-AS1敲减。实时荧光定量PCR检测表明，脂多糖处理(空白对照组)上调了IFNG-AS1的表达，通过转染si-IFNG-AS1显著下调了IFNG-AS1的表达(均P < 0.05)。之后进行CCK-8检测以评估细胞活性，结果显示，脂多糖处理显著抑制细胞活力，si-IFNG-AS1组在48 h(0.63±0.05)和72 h(0.83±0.07)时的细胞增殖活力均显著高于同时间点的si-NC组(0.41±0.03)和(0.46±0.04)(均P < 0.05)。通过流式细胞仪分析，发现IFNG-AS1基因敲减后的细胞凋亡率(3.52±0.31)%明显低于si-NC组(6.51±0.62)%(P < 0.05)。检测细胞外基质相关因子基质金属蛋白酶3，9，13的水平，结果表明，IFNG-AS1下调逆转了脂多糖处理对软骨细胞中基质金属蛋白酶水平的影响，基质金属蛋白酶3，9，13的表达水平均较si-NC组明显降低(均P < 0.05)。这些数据表明IFNG-AS1的缺失抑制了脂多糖诱导的骨关节炎软骨细胞凋亡和细胞外基质降解，见图4及表2，3。











2.4    IFNG-AS1直接下调miR-376b-3p的表达   首先用荧光原位杂交法检测了IFNG-AS1的亚细胞定位，发现其主要定位于细胞质，见图5A。之后采用双荧光素酶报告实验验证了IFNG-AS1和miR-376b-3p之间的互作用关系，见图5B，与miR-NC和IFNG-AS1-wt共转染组相比，共转染miR-mimic和IFNG-AS1-wt组的荧光素酶活性被抑制(P < 0.05)，提示miR-376b-3p与IFNG-AS1存在靶向关系。同时，这种相互作用通过RNA pull-down实验得到证实，见图5C。然后，将IFNG-AS1或si-IFNG-AS1转染到软骨细胞，探讨IFNG-AS1对miR-376b-3p表达的影响，证实IFNG-AS1敲减显著上调miR-376b-3p水平，见图5D。此外，发现相对于正常软骨组织，骨关节炎软骨组织中miR-376b-3p的表达下调，见图5E，与IFNG-AS1的相应表达呈负相关性，见图5F。总之，IFNG-AS1作为miR-376b-3p海绵，对miR-376b-3p的表达有负性调节作用。



2.5   IFNG-AS1调节miR-376b-3p的表达促进脂多糖诱导的骨关节炎软骨细胞损伤   为探讨miR-376b-3p和IFNG-AS1对脂多糖作用后软骨细胞生长的作用。用脂多糖处理软骨细胞后分别转染si-NC、si-IFNG-AS1、si-IFNG-AS1+miR-NC或si-IFNG-AS1+miR-inhibitor。实时荧光定量PCR分析证实，较si-NC组(0.99±0.09)相比，si-IFNG-AS1组(3.97±0.33)的miR-376b-3p表达水平显著上调，在加入miR-inhibitor(2.54±0.21)后下调(均P < 0.05)。之后评估细胞活力，si-IFNG-AS1+miR-inhibitor的转染使细胞在48 h和72 h时的细胞增殖活力显著低于同时间点si-IFNG-AS1+miR-NC组(均P < 0.05)。此外，相对于si-IFNG-AS1+miR-NC组的细胞凋亡率(6.13±0.58)%，si-IFNG-AS1+miR-inhibitor细胞凋亡率(9.82±0.92)%上调(P < 0.05)。此外，此次研究发现miR-376b-3p的下调减弱了IFNG-AS1基因敲减对细胞外基质相关因子水平的影响，IFNG-AS1基因敲减降低了基质金属蛋白酶3，9，13的表达水平，然后这种作用被miR-376b-3p inhibitor部分逆转(均P < 0.05)。以上结果表明，IFNG-AS1通过调节miR-376b-3p的表达来介导脂多糖诱导的软骨细胞凋亡和细胞外基质降解，见图6及表4，5。











2.6    miR-376b-3p靶向结合并下调AKT3的水平    双荧光素酶报告分析被用于证实miR-376b-3p和AKT3的相互作用关系，结果表明，miR-376b-3p能显著降低AKT3-wt的荧光素酶活性，但对AKT3-mut无明显影响，见图7A。RNA pull-down实验进一步验证了二者间的靶向结合关系，见图7B。之后研究miR-376b-3p对软骨细胞AKT3表达的影响，见图7C，AKT3的mRNA水平被miR-376b-3p过度表达下调，被miR-376b-3p敲减上调(均P < 0.05)，提示miR-376b-3p能够靶向抑制AKT3的表达。此外，此次研究证实了IFNG-AS1敲减能够下调AKT3水平，而miR-inhibitor的同步上调削弱了这种变化，见图7D，提示IFNG-AS1能够通过调控miR-376b-3p的表达进而影响软骨细胞中AKT3的水平。此外，在骨关节炎软骨组织中观察到AKT3表达增加，见图7E。如预期，AKT3水平与miR-376b-3p水平呈负相关(P=0.005 2，r=-0.474 9)，与IFNG-AS1水平呈正相关(P=0.025 7，r=0.383 9)，见图7F，G。因此，IFNG-AS1通过调节miR-376b-3p的表达来调节AKT3的表达水平。



2.7    IFNG-AS1调节AKT3的水平促进脂多糖诱导的软骨细胞损伤    首先观察干预IFNG-AS1对AKT3表达的影响，结果显示，敲减IFNG-AS1能够显著抑制AKT3的表达。此外，相对于si-IFNG-AS1+vector组在48 h和72 h时的细胞活力，
si-IFNG-AS1+AKT3组细胞活力显著降低(均P < 0.05)。流式细胞术检测结果显示，si-IFNG-AS1+AKT3组的细胞凋亡(5.18±0.51)%较si-IFNG-AS1+vector组(3.35±0.32)%显著增加(均P < 0.05)。基质金属蛋白酶的检测数据显示，si-IFNG-AS1+AKT3组的基质金属蛋白酶3，9，13表达水平较si-IFNG-AS1+vector组显著升高(均P < 0.05)。以上结果表明，IFNG-AS1通过调节AKT3的表达来介导脂多糖诱导的软骨细胞损伤，见图8及表6，7。

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骨关节炎是一种常见的关节疾病，其特征是关节软骨破坏，年龄、关节创伤、遗传倾向以及细胞外基质紊乱等均是引起该疾病的重要原因[1-3]。目前药物治疗和物理治疗等手段均被应用于骨关节炎的治疗，但治疗效果仍不尽人意[4]。因此，探讨骨关节炎发生的分子机制对于骨关节炎的治疗具有重要意义。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类非编码RNA分子，lncRNAs的表达及其调控作用在多种疾病中均扮演重要角色[5]。在人类骨关节炎软骨中发现了大量不同表达的lncRNAs，这些lncRNAs可能参与骨关节炎的细胞外基质降解、炎症反应、软骨细胞和滑膜细胞凋亡和血管生成[6-9]。因此，对LncRNA功能的进一步研究对于证实其与骨关节炎的关系以及探索新的潜在治疗靶点至关重要。
LncRNA IFNG-AS1是位于IFNG基因区域下游的lncRNA，参与了多种疾病的发生，如IFNG-AS1在类风湿性关节炎患者中表达升高，可能是类风湿性关节炎的潜在生物标志物[10]。然而，关于IFNG-AS1在骨关节炎中的作用尚未有研究，推测IFNG-AS1同样参与了骨关节炎的发生发展，因此有必要对IFNG-AS1在骨关节炎中的功能进行分析。miR-376b-3p以往被证实能抑制骨关节炎的进展[11]，AKT丝氨酸/苏氨酸激酶3(AKT serine/threonine kinase 3，AKT3)被发现与miR-376b-3p存在特异性结合位点，并且在体内外骨关节炎中表达上调，能够促进骨关节炎炎症和软骨细胞损伤[12]。
此次研究目的是探讨IFNG-AS1/miR-376b-3p/AKT3轴在骨关节炎发生发展中的作用，希望为进一步认识骨关节炎的发病机制提供新的理论和实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   体外细胞实验，在计量数据符合正态分布的前提下，两组间采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。在不符合正态分布条件下，对于两组间则应用曼-惠特尼U检验，Bonferroni法用于事后比较。实验流程见图1。

1.2   时间及地点   于2018年6月至2020年12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   软骨组织   在华中科技大学同济医学院附属同济医院2018年6月至2020年12月收治的33例膝关节骨关节炎患者中采集骨关节炎软骨组织，男19例，女14例，年龄(56.52±12.15)岁；正常软骨组织由同期于华中科技大学同济医学院附属同济医院就诊的33例股骨颈骨折患者提供，男21例，女12例，年龄(57.32±9.85)岁。所有组织在液氮中冷冻，然后在-80 ℃下储存以供进一步研究。此次研究经华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会批准，且所有参与者签署知情同意书。
1.3.2   试剂与仪器   RNA提取试剂盒 (MZ1335)和Lipofectamine 3000(L3000-015)购自Thermo Fisher Scientific；DMEM培养基(PM150312)购自武汉诺普赛生命科技有限公司；PrimeScriptRT试剂盒 (RR037A)购自北京智杰科技有限公司；RNA pull-down试剂盒来自广州伯信生物科技有限公司；PCR试剂盒 (D7301S)购自上海碧云天生物技术有限公司；荧光原位杂交试剂盒来自广州瑞博生物科技有限公司；ELISA试剂盒(HR107)购自上海歌凡生物科技有限公司；双荧光素酶报告试剂盒(D0010)、RIPA裂解液(R0010)、CCK-8试剂盒(CA1210)和Matrigel基质胶(M8370-1 mL)均购自北京索莱宝科技有限公司；细胞转染序列由汉恒生物合成；多功能酶标仪(MB-530)来自济南欧莱博科学仪器有限公司；倒置光学显微镜(SZ51)购自厦门和谱仪器有限公司；流式细胞仪(0702)购自上海实维实验仪器技术有限公司。
1.4   实验方法   
1.4.1   生物信息学分析   从NCBI数据库(http://ncbi.nlm.nih.gov)获取GEO芯片表达数据GSE120356，使用limma包分析腰间椎盘突出患者和骨关节炎患者关节软骨中的差异表达miRNAs，并使用R studio绘制差异表达热图，差异筛选条件为adj.P.Value < 0.05和|Log2FC|>1。在LncRNASNP数据库(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP#!/)获取IFNG-AS1和miR-376b-3p的特异性结合位点，StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)和miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)用于获取miR-376b-3p的下游靶基因，韦恩图通过Venn (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制，DAVID在线数据库(http://david.ncifcrf.gov)对目标基因进行基因本体和京都基因与基因组百科全书功能富集分析，DisGeNET数据库(http://disgenet.org/search)用于获取骨关节炎的疾病风险基因，STRING(https://string-db.org/)用于预测基因间的互作用关系。
1.4.2   组织采集和细胞的培养   从正常的关节软骨组织中分离软骨细胞，将软骨组织切成小块，用0.1%的胰蛋白酶处理30 min，然后在DMEM培养基中用0.2%的Ⅱ型胶原酶处理10 h。用40 mm过滤器去除未消化标本，最后离心获得软骨细胞。在光学显微镜下观察0，48，96 h软骨细胞的形态学变化，第2代和第3代细胞用于进一步诱导骨关节炎软骨细胞。所有细胞均在含有体积分数10%胎牛血清的DMEM中培养，培养箱为37 ℃，CO2体积分数为5%。
对于脂多糖处理，在培养基中加入不同质量浓度的脂多糖(1，5或10 mg/L)处理软骨细胞24 h，最后选择5 mg/L进行下一步实验。
1.4.3   免疫组织化学染色   将正常软骨细胞重新悬浮在PBS中，加入0.25%的胰蛋白酶作用10 min，将细胞浓度调节至1×108 L-1。待软骨细胞完全贴附在培养皿壁上，重新填充培养基并在37 ℃，体积分数5%CO2条件下放置3 h。用PBS洗涤软骨细胞并用40 g/L的多聚甲醛固定，使用0.2%Triton X-100增加细胞通透性；再用PBS洗涤软骨细胞2次，加入体积分数3%的过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性。PBS洗涤2次后，软骨细胞与Ⅱ型胶原抗体(1∶500)在4 ℃孵育过夜；PBS洗涤后，软骨细胞与山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶500)在37 ℃孵育30 min；切片用3，3′-二氨基联苯胺显色并用苏木精复染。在光学显微镜下观察的正常软骨细胞若呈棕色或棕黄色，则被认为是Ⅱ型胶原阳性。
1.4.4   细胞转染和分组   脂多糖的使用质量浓度为5 mg/L。对IFNG-AS1、miR-376b-3p和AKT3进行调控干预后，分组如下：Blank(脂多糖刺激的软骨细胞)、si-NC(脂多糖刺激的软骨细胞+IFNG-AS1阴性对照序列)、si-IFNG-AS1(脂多糖刺激的软骨细胞+si-IFNG-AS1)、miR-NC(脂多糖刺激的软骨细胞+miR-376b-3p阴性对照序列)、miR-mimic(脂多糖刺激的软骨细胞+miR-376b-3p模拟物)、miR-inhibitor(脂多糖刺激的软骨细胞+miR-376b-3p抑制剂)、si-IFNG-AS1+miR-inhibitor(脂多糖刺激的软骨细胞+si-IFNG-AS1+miR-inhibitor)、si-IFNG-AS1+miR-NC(脂多糖刺激的软骨细胞+si-IFNG-AS1+miR-NC)、si-IFNG-AS1+vector(脂多糖刺激的软骨细胞+si-IFNG-AS1+空白载体)、si-IFNG-AS1+AKT3(脂多糖刺激的软骨细胞+si-IFNG-AS1+AKT3过表达载体)。细胞转染方法按照Lipofectamine 3000试剂盒说明书进行，连续转染48 h后进行鉴定并实施后续实验。
1.4.5   荧光原位杂交   根据试剂盒使用说明书，将骨关节炎软骨细胞与200 μL预杂交溶液在37 ℃下孵育30 min，然后与20 μL DNA探针/杂交缓冲液在37 ℃下孵育过夜。在避光条件下用洗涤液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和PBS依次洗涤每个孔，对细胞进行DAPI染色，随后用荧光显微镜观察IFNG-AS1的细胞定位。
1.4.6   CCK-8实验   使用CCK-8试剂盒评估细胞活力。简而言之，将各组骨关节炎软骨细胞以3×105/孔的密度接种于96孔板，在24，48，72 h各向每孔加入10 μL CCK-8溶液。然后在450 nm处检测吸光度值。
1.4.7   流式细胞术   采用细胞凋亡试剂盒检测骨关节炎软骨细胞凋亡率。细胞转染后孵育48 h，收集细胞并用binding buffer稀释，依据试剂盒说明书在100 μL细胞中分别加入Annexin-V-FITC和PI染液各5 μL，室温孵育20 min后上流式细胞仪对细胞凋亡情况进行分析。
1.4.8   ELISA实验   收集各组细胞在37 ℃条件下转染48 h后的培养上清液，使用ELISA法检测培养液中基质金属蛋白酶3，9，13的水平，实验操作按照试剂盒说明书进行。
1.4.9   双荧光素酶报告实验   首先构建IFNG-AS1-Wt/Mut和AKT3(3′UTR)-wt/mut的双荧光素酶报告载体，再将miR-376b-3p模拟物(miR-mimic)或对照物(miR-NC)共转染至骨关节炎软骨细胞。培养48 h后，用双荧光素酶报告系统测定荧光素酶活性，荧光素酶活性以萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性的比值计算。
1.4.10   RNA pull-down   用RNA pull-down试剂盒得到大量生物素标记的RNA及其相应的对照品。细胞转染48 h后，收集细胞并在缓冲液中培养10 min，剩余裂解液用BSA和链霉亲和素磁珠培养。在4 ℃孵育3 h后，用预冷裂解缓冲液漂洗2次，用低盐缓冲液漂洗3次，用高盐缓冲液漂洗1次。用Trizol纯化结合RNA，实时荧光定量PCR检测IFNG-AS1和AKT3的富集。
1.4.11   实时荧光定量PCR   根据制造商的说明，用TRIzol提取骨关节炎组织或软骨细胞的总RNA，合成cDNA。应用SYBR-Green-qPCR母料进行实时荧光定量PCR检测。选择U6或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为基因表达的标准化。用2-ΔΔCt基因表达方法进行分析。IFNG-AS1、miR-376b-3p、AKT3、U6和GAPDH的引物序列见表1。

1.5   主要观察指标   ①骨关节炎中差异表达的miRNA以及IFNG-AS1/miR-376b-3p/AKT3的调控关系；②IFNG-AS1在骨关节炎和脂多糖诱导的软骨细胞中的表达水平；③敲减IFNG-AS1表达对脂多糖诱导的软骨细胞损伤的影响；④IFNG-AS1/miR-376b-3p/AKT3网络对骨关节炎软骨细胞增殖凋亡的影响。
1.6   统计学分析   实验数据均采用SPSS 20.0统计软件进行分析，表示为x±s，对计量资料采用卡方检验或Fisher确切概率检验以确定否符合正态分布和方差齐性。在计量数据符合正态分布的前提下，两组间采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。在不符合正态分布条件下，对于两组间则应用曼-惠特尼U检验，Bonferroni法用于事后比较。P < 0.05表示差异有显著性意义。

此次研究揭示了IFNG-AS1、miR-376b-3p和AKT3在骨关节炎发生发展中的作用机制。在这项研究中，作者发现IFNG-AS1和AKT3在骨关节炎软骨组织中的表达显著上调，而miR-376b-3p表达下调；用脂多糖处理软骨细胞，构建骨关节炎细胞模型，如预期，IFNG-AS1表达随脂多糖剂量升高而升高。此外，作者还证实了IFNG-AS1基因敲减抑制了脂多糖诱导的软骨细胞损伤，而这一结果被下调miR-376b-3p或上调AKT3部分逆转。
IFNG-AS1通过增加γ-干扰素的分泌从而对多种病原体进行应答[13]。先前的研究表明IFNG-AS1在脂多糖诱导的结肠炎中表达上调，能够诱导结肠上皮细胞凋亡[14-15]；IFNG-AS1在冠心病患者中的表达显著升高，且其相对表达与肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等炎性因子水平呈正相关[16]。此外，IFNG-AS1在类风湿关节炎患者的外周血中呈显著高表达，IFNG作为IFNG-AS1的靶基因同样在类风湿关节患者中高表达，能够有效诊断类风湿关节炎[10]。此次实验采用实时荧光定量PCR检测发现，IFNG-AS1在骨关节炎患者的关节软骨中显著高表达，在脂多糖诱导的骨关节炎细胞模型中，IFNG-AS1的表达随脂多糖剂量升高而升高；细胞增殖和凋亡实验结果显示，沉默IFNG-AS1能够有效促进软骨细胞增殖并减少凋亡；ELISA法检测细胞外基质相关因子结果显示，下调IFNG-AS1的表达能够显著降低基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶13的表达进而抑制细胞外基质降解。
在人类疾病中，lncRNAs被认为是一种miRNA海绵，通过相互作用来调节miRNA的水平[17]。此次研究借助GEO表达数据，筛选得到miR-376b-3p在骨关节炎患者的关节软骨中的表达显著低于腰椎间盘突出患者的软骨组织，且研究证实miR-376b-3p能够抑制骨关节炎的发生发展[11]。
miR-376b-3p和IFNG-AS1之间的靶向结合关系通过双荧光素酶报告实验和RNA pull-down实验得到了进一步验证，IFNG-AS1对miR-376b-3p具有负向调节作用。实时荧光定量PCR检测miR-376b-3p在骨关节炎患者关节软骨组织中的相对表达，结果显示相对于正常的关节软骨组织，miR-376b-3p在骨关节炎中显著下调，与IFNG-AS1呈显著负相关。挽救实验结果显示，miR-376b-3p抑制剂部分逆转了IFNG-AS1缺失对脂多糖诱导的软骨细胞损伤的影响。此次实验结果表明，IFNG-AS1通过调节miR-376b-3p的表达以调控脂多糖诱导的软骨细胞损伤。
越来越多的证据支持miRNAs作为mRNA海绵调节基因表达[18]。例如，miR-33a-5p通过靶向ZEB1下调其表达[19]。作者将miR-376b-3p在miRWalk和StarBase数据库中预测得到的下游靶基因取交集，并通过功能富集分析和蛋白互作用分析，筛选得到AKT3。作者认为miR-376b-3p直接下调软骨细胞AKT3的表达以发挥作用。据报道，在退行性骨关节炎中，软骨细胞分泌软骨细胞糖蛋白以激活AKT，PI3K/AKT信号与软骨细胞增殖、凋亡和分化相关[20]，且AKT3与软骨细胞基质金属蛋白酶13的产生相关[21]。此外，已有研究发现AKT3在骨关节炎软骨中表达升高，能够加重疾病进展[12]。基于先前的研究，作者采用双荧光素酶报告实验和RNA pull-down证实了AKT3是miR-376b-3p的靶基因，实时荧光定量PCR分析得到AKT3的表达能够被上调miR-376b-3p或下调IFNG-AS1所抑制；AKT3在骨关节炎患者关节软骨中的相对表达升高，与IFNG-AS1正相关，而与miR-376b-3p负相关；功能性实验结果显示，过表达AKT3对沉默IFNG-AS1减轻的骨关节炎软骨细胞损伤具有抑制作用，这表示IFNG-AS1可能通过上调AKT3的表达抑制骨关节炎软骨细胞增殖，促进细胞凋亡和细胞外基质降解。
综上所述，发现IFNG-AS1通过miR-376b-3p/AKT3轴促进脂多糖诱导的软骨细胞凋亡和细胞外基质降解，并且揭示了LncRNAIFNG-AS1的功能及其与骨关节炎的关系。提示IFNG-AS1参与骨关节炎的调节，为IFNG-AS1/miR-376b-3p/AKT3作为骨关节炎治疗的新靶点提供了支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
长链非编码RNA (long non coding RNA，LncRNA)： 是一类转录本长度在200 nt以上的RNA分子，LncRNA不编码蛋白质，而是以RNA的形式在转录调控、转录后调控以及表观遗传调控等多种层面影响基因的表达，进而参与到多种生物学过程中。
AKT丝氨酸/苏氨酸激酶3(AKT serine/threonine kinase 3，AKT3)：AKT3基因编码的蛋白质是AKT家族的一个成员，AKT激酶是重要的细胞信号调节器，对细胞的增殖、凋亡、分化等多种生物学过程均具有调控作用。

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（1）长链非编码RNA IFNG-AS1被证实参与了类风湿关节炎的进展，但是其在骨关节炎中的作用仍有待探究；（2）IFNG-AS1能够作为ceRNA吸附miR-376b-3p调控AKT3的表达，进而影响骨关节炎软骨细胞的增殖、凋亡和细胞外基质降解；（3）IFNG-AS1有望成为骨关节炎治疗的潜在靶点。

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