基于“损伤-修复-再损伤”方法制备兔膝骨关节炎滑膜炎模型

doi:10.12307/2022.676

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3738-3743.doi: 10.12307/2022.676

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

基于“损伤-修复-再损伤”方法制备兔膝骨关节炎滑膜炎模型

苏剑清1，孙波2，丁韵蓉3，刘光明2，季伟2，蒋恩宇2，杨佳裕2

1上海市第二康复医院，上海市 200441；2上海市黄浦区香山中医医院，上海市 200020；3上海中医药大学附属第七人民医院，上海市 200137

收稿日期:2021-08-25 接受日期:2021-10-30 出版日期:2022-08-18 发布日期:2022-02-15
通讯作者: 杨佳裕，硕士，副主任医师，上海市黄浦区香山中医医院，上海市 200020
作者简介:苏剑清，男，1993年生，广东省新兴县人，汉族，2019年上海体育学院毕业，硕士，初级治疗师，主要从事运动康复方面的研究。
基金资助:
上海市卫生和计划生育委员会中医药科研课题(2018JP003)，项目负责人：杨佳裕；2019-2021年度黄浦区卫生计生系统专业人才梯队培养计划(2019GG10)，项目负责人：杨佳裕；上海市中医药事业发展三年行动计划领军人才计划培养对象[ZY(2018-2020)-RCPY-1029]，项目负责人：孙波；上海市黄浦区医疗卫生重点研究发展专科——中医骨伤科(HWZFK201808-2) ，项目负责人：孙波；黄浦区卫生健康系统中医药专业人才队伍培养(中医药领军人才)(2020-2021)，项目负责人：孙波

Preparing a rabbit model of synovitis in knee osteoarthritis based on the “injury-repair-reinjury” method

Su Jianqing1, Sun Bo2, Ding Yunrong3, Liu Guangming2, Ji Wei2, Jiang Enyu2, Yang Jiayu2

1The Second Rehabilitation Hospital of Shanghai, Shanghai 200441, China; 2Xiangshan TCM Hospital of Huangpu District, Shanghai 200020, China; 3The Seventh People’s Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200137, China

Received:2021-08-25 Accepted:2021-10-30 Online:2022-08-18 Published:2022-02-15
Contact: Yang Jiayu, Master, Associate chief physician, Xiangshan TCM Hospital of Huangpu District, Shanghai 200020, China
About author:Su Jianqing, Master, Therapist, The Second Rehabilitation Hospital of Shanghai, Shanghai 200441, China
Supported by:
Chinese Medicine Research Project of Shanghai Municipal Health and Family Planning Commission, No. 2018JP003 (to YJY); 2019-2021 Huangpu District Health and Family Planning Project for Professional Talent Training, No. 2019GG10 (to YJY); Leading Talent Culture Program of the Three-Year Action Plan for the Development of Shanghai Traditional Chinese Medicine, No. ZY (2018-2020)-RCPY-1029 (to SB); Shanghai Huangpu District Medical and Health Key Research and Development Specialist - Traditional Chinese Medicine Orthopedics and Traumatology, No. HWZFK201808-2 (to SB); Huangpu District Professional Team Training Project for Traditional Chinese Medicine (Traditional Chinese Medicine Leading Talents), No. 2020-2021 (to SB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
膝关节滑膜炎：指没有特异性病因的膝关节滑膜炎症，主要由滑膜巨噬细胞等产生的炎症因子所介导。其发病主要与膝关节的退行性病变及关节损伤有关，临床上主要表现为膝关节肿胀、疼痛等。
苏木精-伊红染色：石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

背景：目前膝骨关节炎滑膜炎动物模型主要为手术创伤模型和关节注射诱导模型，造模方式与疾病发生方式仍有较大距离。
目的：基于“损伤-修复-再损伤”方法制备兔膝骨关节炎滑膜炎模型并对其进行评价，为研究膝骨关节炎滑膜炎提供模型支持。
方法：将16只雄性新西兰大白兔随机分为2组，模型组、对照组各8只，分别在第1，4，7，12天对模型组兔右膝关节注射4%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L的L-半胱氨酸混合溶液以制备膝骨关节炎滑膜炎模型，期间记录兔右膝肤温，于第15天麻醉处死取材。通过膝关节MRI观察关节积液及软骨情况，苏木精-伊红染色观察滑膜组织变化，ELISA测定膝关节滑液炎症因子和前列腺素E2表达水平改变。
结果与结论：①模型组兔膝关节首次注射配制剂即出现明显红肿热情况，肤温明显高于对照组；②模型组兔膝关节MR造影显示滑膜积液渗出明显及软骨出现轻度损伤；苏木精-伊红染色呈现滑膜组织明显增厚，且有大量炎症细胞浸润；③模型组兔滑膜滑液炎症水平明显高于对照组，同时疼痛指标前列腺素E2也明显增高；④提示通过对兔膝关节表面情况、膝关节肤温、滑膜积液渗出、滑膜组织学改变及膝关节滑液炎症水平变化综合评价发现，“损伤-修复-再损伤”方法能成功制备出兔膝骨关节炎滑膜炎模型，与临床膝骨关节炎滑膜炎现象相似。

https://orcid.org/0000-0001-7854-3636 (苏剑清)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 膝骨关节炎, 滑膜炎, 动物模型, 炎症, 关节积液, 软骨

Abstract: BACKGROUND: At present, surgical trauma and intraarticular injection-induced models are the animal models mainly used for synovitis in knee osteoarthritis. There is still a large distance between the modeling method and the mode of disease occurrence.
OBJECTIVE: To establish and evaluate a rabbit model of synovitis in knee osteoarthritis based on the method of “injury-repair-re-injury,” so as to provide model support for the study of synovitis in knee osteoarthritis.
METHODS: Sixteen New Zealand white rabbits were randomly divided into two groups: model group (n=8) and control group (n=8). The rabbit’s right knee was injected with 4% papain and 0.03 mol/L L-cysteine to establish the model of synovitis in knee osteoarthritis on days 1, 4, 7, and 12. The skin temperature of the right knee was recorded. Rabbits in each group were killed under anesthesia and the knee joint samples were collected on day 15. Knee joint effusion and cartilage were observed using magnetic resonance imaging. Synovial tissue changes were observed using hematoxylin-eosin staining. Expression levels of inflammatory factors and prostaglandin E2 in the knee synovial fluid were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.
RESULTS AND CONCLUSION: In the model group, the rat knees became red, swollen and hot obviously at the first injection of the preparation, and the skin temperature was significantly higher than that in the control group. Magnetic resonance imaging revealed obvious synovial effusion and slight damage to the knee cartilage in the model group. Hematoxylin-esoin staining showed synovial tissue thickening and a large number of inflammatory cells infiltrated in the model group. Levels of inflammatory factors and prostaglandin E2 in the synovial fluid were significantly higher in the model group than the control group. Rabbit model of synovitis in knee osteoarthritis can be successfully established by the “injury-repair-reinjury” method, which presents similar conditions with clinical synovitis in knee osteoarthritis, by comprehensive evaluation based on the performance of knee joint surface, skin temperature of the knee, synovial effusion and histological changes of the synovial tissue.

Key words: knee osteoarthritis, synovitis, animal model, inflammation, joint effusion, cartilage

中图分类号:

苏剑清, 孙波, 丁韵蓉, 刘光明, 季伟, 蒋恩宇, 杨佳裕. 基于“损伤-修复-再损伤”方法制备兔膝骨关节炎滑膜炎模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3738-3743.

Su Jianqing, Sun Bo, Ding Yunrong, Liu Guangming, Ji Wei, Jiang Enyu, Yang Jiayu. Preparing a rabbit model of synovitis in knee osteoarthritis based on the “injury-repair-reinjury” method[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(23): 3738-3743.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析此次实验动物初始共16只，随机分为模型组和对照组，其中造模第3天，模型组2号兔肺部出现啰音，于注射药物后第5天下午死亡，因此模型组动物仅剩7只，其余实验兔一直生存至取材当日。
2.2 动物一般行为和运动功能观察两组实验兔在适应性饲养时的毛色、体质量、尿便、饮水及日常活动均无明显差异。首次注射木瓜蛋白酶6 h内，兔右膝关节表面出现明显红肿热现象，动物性情较为暴躁；第2次注射后模型组兔进食量和活动量减少，部分出现缩腿的保护性姿势，呈跛行状态，见图1。第3次注射后，动物右膝关节与对侧相比出现明显肿大，大部分出现跛行现象。第4次注射后，所有造模动物均出现右膝关节红肿热，跛行明显。

2.3 肤温结果注射前1 d，两组兔右膝关节肤温基本相同，从注射配制剂后第2天开始，模型组膝关节肤温显著升高，且与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)，这种状态一直持续到实验取材前，见图2。

2.4 滑膜情况切开兔膝关节囊后可见兔膝关节髌上囊及脂肪垫上的滑膜附着。对照组滑膜覆于脂肪垫上，滑膜色泽清黄透亮，多呈果冻状，未见淤血、纤维的形成；模型组滑膜紧贴于脂肪垫上，滑膜多呈白色，质地较硬，可见大量淤血附着，见图3。

2.5 苏木精-伊红染色观察结果兔膝关节滑膜切片显示，对照组见一两层的A型、B型滑膜细胞和位于其下的滑膜下层(包括血管、脂肪组织、成纤维细胞和少量的组织细胞与肥大细胞)，滑膜结构总体良好，见图4A；模型组滑膜细胞明显增生，滑膜覆盖大于5个细胞层，可见大量炎性细胞浸润，见图4B。

2.6 膝关节MRI结果观察兔膝关节MRI结果为T2抑脂图，对照组兔髌下脂肪垫呈黑色带，信号连续，骨皮质透亮层信号连续，无灰色影，关节腔内未见明显高信号影，未见异常渗出，见图5A。与对照组相比，模型组兔膝关节MR造影有着明显变化，见图5B。

2.7 膝关节滑液炎症水平造模第15天，木瓜蛋白酶注射使模型组兔膝关节滑液炎症水平明显增高，与对照组相比，模型组兔右膝关节滑液的炎症因子表达水平增高，差异有显著性意义(P < 0.01)。同样地，模型组兔膝关节滑液中前列腺素E2的表达水平也显著提升，且与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)，见表1。

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引言

膝骨关节炎是以关节面软骨变性、关节骨赘形成和软骨下骨硬化等为特征的一种慢性退行性膝关节疾病，临床多表现为关节周围肿胀疼痛等炎症反应，重者可致残，严重影响患者的运动能力和生活质量[1]。目前国内骨关节炎患者已超过1亿，其中膝关节发病率较高，膝骨关节炎最终致残率达到53%，已成为广受重视的疾病之一[2]。
据报道，滑膜炎是进展期膝骨关节炎的常见并发症，存在于膝骨关节炎各个阶段，是导致膝骨关节炎患者出现关节红肿热痛和功能障碍的主要病因，对患者生活造成严重的不便[3]。值得注意的是，近年来有研究发现膝骨关节炎滑膜炎的发生早于影像学诊断，对膝骨关节炎的发生发展具有重要的预测作用[4]。ATUKORALA等[5]研究表明膝骨关节炎发病前1年，患者膝关节MRI显示明显的炎症渗出和髌下脂肪垫增厚现象，且与继发膝骨关节炎有着显著的相关性。LOEUILLE等[6]发现滑膜炎评分越高，发生膝骨关节炎的风险越高，并表示大面积滑膜炎是导致膝骨关节炎的独立影响因素。
目前关于膝骨关节炎滑膜炎的临床观察多处于膝骨关节炎中晚期，由于膝骨关节炎是慢性疾病，诊断时期较晚，在临床上难以观察到膝骨关节炎早期所产生的病理变化。理想的动物模型是对疾病进行深入研究的基础，然而目前用于滑膜炎症研究的动物模型主要为手术创伤模型和关节注射诱导模型[7-8]。手术创伤模型对无菌操作要求高，同时要避免手术应激所产生的对实验结果不良影响，大部分关节注射诱导模型多在1周内完成模型建立，但在2周后就出现炎症反应下降等情况，模型体征与临床有较大差别[9]。缺乏稳定的膝骨关节炎滑膜炎动物模型是阻碍其被进一步研究的主要原因之一，这对疾病的深入研究和后期治疗方法的探讨十分不利。因此，制备膝骨关节炎滑膜炎动物模型的合理方法应被尽快建立。膝骨关节炎滑膜炎的发生应是多次损伤导致的慢性进展性疾病，具有稳定的疾病特征，患者在日常生活中由于用力不慎或过度劳累等导致膝关节轻微疼痛等，膝关节滑膜轻度损伤后，会进行自我修复；在此过程中，由于病情较轻，患者重视不足，炎症在修复不足的情况下将再次受到二次甚至多次损伤，直至引起就医行为，因此认为膝骨关节炎滑膜炎的产生会经过损伤-修复-再损伤的过程。
DAI等[10]利用原子力显微镜观察前交叉韧带损伤建立的膝骨关节炎模型鼠，发现模型鼠滑膜硬化程度随着膝骨关节炎严重程度逐日加重。廖八根等[11]发现运动创伤性膝骨关节炎模型兔膝关节滑膜中碱性成纤维细胞生长因子的表达明显增加。由此可见，现有的大多数研究发现膝骨关节炎动物模型存在滑膜炎的症状，但由于缺乏统一的膝骨关节炎滑膜炎模型评价体系，膝骨关节炎滑膜炎动物模型是否制备成功目前无从得知。
研究发现，膝骨关节炎滑膜炎可表现为宏观水平和分子水平的改变，具体表现为关节肿胀、滑膜增厚且出现明显积液，滑膜组织炎症细胞浸润及炎症因子表达明显增多[12]。综上，对于膝骨关节炎滑膜炎是否制备成功，可对模型的整体影像学结构、滑膜结构形态学改变和炎症水平进行综合评价。
此次实验通过参考多项膝骨关节炎造模过程中产生滑膜炎的研究，对造模周期进行了一定的修改，以损伤-修复-再损伤的方法制备兔膝骨关节炎滑膜炎模型，并同时从多个方面对膝骨关节炎滑膜炎动物模型是否制备成功进行综合评价，为膝骨关节炎滑膜炎的机制研究和治疗提供模型基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照实验，统计方法为独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2018年8月在上海中医药大学动物实验室及曙光医院骨伤研究所开展。
1.3 材料
1.3.1 动物管理 6月龄健康雄性清洁级新西兰大白兔16只，平均体质量2.0-3.0 kg，购自上海市松江区车墩实验动物良种场，许可证号：SCXK(沪)2017-0003，上海中医药大学实验动物与伦理审查报告编号：PZSHUTCM190719004。所有实验动物均按照12 h昼夜节律饲养，自由饮食。
1.3.2 试剂及仪器木瓜蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)；L-半胱氨酸(北京索莱宝科技有限公司)；40 g/L多聚甲醛 (合肥兰杰柯科技有限公司)；苏木精染液/伊红染液(无锡江原失业技贸总公司)；肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、前列腺素E2 ELISA试剂盒(上海博谷生物科技有限公司)；离心机(TGL-168，上海安亭科学仪器厂)；数字皮温器(LG-507，蓝格科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 分组动物适应性饲养(温度20-25 ℃，湿度65%)1周后，采用随机数字表法，将16只兔分为对照组和模型组，每组8只。
1.4.2 模型制备造模方案基于以往相关研究并结合作者所在课题组预实验制定，采用4%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L的L-半胱氨酸混合溶液制备膝骨关节炎滑膜炎兔模型，而对照组不进行任何干预。该方案具体步骤如下：①用10 mL注射器抽取6 mL木瓜蛋白酶溶液和3 mL半胱氨酸溶液，配制成4%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L的L-半胱氨酸混合溶液(2∶1)，摇匀后注入10 mL离心管，水浴加热至常温。②将模型组兔抓取至兔固定器中，称质量记录后，剃去兔右膝关节长毛，并用碘伏进行消毒。用1 mL注射器抽取0.2 mL/kg混合试剂，将兔膝关节屈曲45°，沿髌间窝方向对髌骨下缘髌韧带外侧进针，进针后手下有落空感即可，撤回1 mm后回抽，如无血液倒流则可注入试剂。

以上操作从造模第1天开始执行，分别于造模第1，4，7，12天进行相同操作，给药时间共计14 d。在模型制备过程中，模型组有1只实验兔发生死亡，剩余动物进行模型评价，其中模型组7只，对照组8只。

1.4.3 肤温测试记录实验开始前、实验第2，5，8，13，15天早9：00对各组兔膝关节进行膝关节肤温测量。安抚实验兔使其保持安静，将数字皮温器测温头置于兔膝关节髌骨处，待温度不再变化后记录读数为兔膝关节肤温。
1.4.4 膝关节MRI 实验第14天从每组随机选取2只动物，用10%的水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射以达到深度麻醉效果，将兔双下肢伸直并用纱布绷带绑定，兔尾用医用胶布向背固定，充分暴露双膝关节后仰卧位行MR检查。扫描序列：T1WI(TR：11.70 ms，TE：5.17 ms，TA：4:37，voxel size 0.6 mm×0.6 mm×0.6 mm，Rel.SNR 1.00，Dist factor 20%，Fov read 100 mm，Slice thickness 0.58 mm， phase oversampling 80%，Slice oversampling 57.1%，Slices per slab 56，Averages 2，Concatenations 1，Coil elements 15K)、T2WI(TR：15.50 ms，TE：5.10 ms，TA：4:33，voxel size 0.6 mm×0.6 mm×0.6 mm，Rel.SNR 1.00，Dist factor 20%，Fov read 100 mm，Slice thickness 0.6 mm，phase oversampling 70%，Slice oversampling 6.7%，Slices per slab 60，Averages 2，Concatenations 1，Coil elements 15K)。观察关节积液及软骨情况，由专业影像学技术人员对MRI图像进行解析。
1.4.5 麻醉与取材实验第15天用10%水合氯醛按3.5 mL/kg对实验兔进行腹腔麻醉后(建议先给总量的2/3，观察兔的反应再给剩余量)。抽取兔右膝关节滑液，观察关节液的颜色、黏稠度等大体情况，然后将关节液放入冷冻管中，-80 ℃保存。剪断股四头肌腱，沿髌骨内外两侧纵行剪开关节囊，将髌骨及髌韧带向下翻，观察髌上囊及脂肪垫上的滑膜色泽。眼科剪紧贴脂肪层剪下滑膜，PBS洗净，放入40 g/L多聚甲醛中，在4 ℃环境下保存。
1.4.6 苏木精-伊红染色观察将兔膝关节滑膜组织放入包埋盒中，进行PBS冲洗、常规梯度乙醇脱水、透明，随后将组织放入熔化的石蜡中进行浸蜡和包埋，5 μm厚连续切片。将切片分别作苏木精-伊红染色后，用普通光学显微镜观察。
1.4.7 ELISA 取出试剂盒，严格按照说明书方法进行加样、加酶标溶液、温育、洗板、显色操作，在450 nm波长下读取酶标板各孔的吸光度值，同时用软件Ascent software for Multiskan对吸光度值进行分析，计算出滑液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、前列腺素E2的质量浓度。
1.5 主要观察指标 ①兔膝关节表面观察；②形态学观察：影像学、组织学；③分子水平：肿瘤坏死因子α、白细胞介素β、前列腺素E2。
1.6 统计学分析应用SPSS 23.0软件处理数据，所有计量资料以x±s表示，并对所有计量资料进行正态性检验及方差齐性检验。符合正态检验的组间比较采用独立样本t检验，非正态分布组间比较采用Mann-Whitney U检验。此次研究中，所有结果均采用独立样本t检验进行统计，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

膝骨关节炎属于慢性退行性疾病，其发病早期的症状和体征受到的关注较少。值得注意的是，膝骨关节炎早期多表现为肿胀疼痛的滑膜炎，在疾病早期进行对症治疗有助于防止疾病的进一步恶化[13]。目前针对膝骨关节炎滑膜炎的研究较少，没有合适的模型及统一的模型评价体系是其中的重要原因之一。
3.1 兔膝骨关节炎滑膜炎模型制备方法的探讨
3.1.1 制备方法早在1999年，GOLDRING等[14]通过综合多项研究进行综述，表示对于创伤性膝骨关节炎，滑膜炎和急性炎症可能发生在早期，炎症反应对于骨关节炎发生具有诱导作用，表明膝骨关节炎常常合并滑膜炎，提示滑膜炎模型可参考膝骨关节炎模型进行建立。GOWLER等[15]通过手术建立慢性膝骨关节炎疼痛模型大鼠，发现模型鼠滑膜炎的发生先于疼痛表现，软骨病变在滑膜炎发生后一段时间内变得明显，进一步说明滑膜炎在膝骨关节炎早期阶段已经出现。近年来，国内有研究通过低浓度木瓜蛋白酶注射以建立兔早期膝骨关节炎滑膜炎模型，实验结果为模型兔膝关节滑膜在1周内表现出急性炎症现象，但在第14天滑膜炎症会减少甚至消失[16]。作者所在课题组曾在该实验实施前做过一次预实验，发现1周的造模周期确实会使模型动物膝关节炎症表象明显，但在后期观察中发现，其关节积液会随着时间减少，炎症因子检测较之前降低，与上述研究结果一致。但在造模过程中，在第12天再次对模型兔进行药物注射后，可以表现出较为稳定的、贴合临床的膝骨关节炎滑膜炎模型。研究发现，滑膜受损后易于修复，且可过度增生，同时膝骨关节炎滑膜炎是一种慢性疾病，结合前人研究和实验，可以合理认为膝骨关节炎滑膜炎的总体病理过程应该是由于膝关节在长期损伤和修复过程中形成的退化性疾病。因此，作者认为稳定的膝骨关节炎滑膜炎模型相应会有一个损伤-修复-再损伤的发病过程。此次实验参考上述专家的造模方法，并结合预实验的方案，将造模时间延长至14 d，在第1，4，7天注射药物后，留出4 d空置期让模型兔膝关节有一个修复的过程，并在第12天再一次进行药物注射，这样充分模仿生活中膝骨关节炎的发生条件，以建立贴合临床的膝骨关节炎滑膜炎模型。
3.1.2 死亡原因研究发现，大剂量高浓度的木瓜蛋白酶如进入血液循环中，会导致肺部溶血从而使实验动物死亡[17]。此次研究在正式实验前曾做过预实验，因此在注射部位和深度的选取方面保证了较高的准确性，但不幸的是，模型组2号兔在实验开始第3天肺部出现啰音，并于第5日下午死亡；动物尸体解剖可见肺部有瘀血，切开肺部可见白色脓状物体流出，右膝关节肿胀明显，有明显的淤血形成，表现与前人所述相似。作者推测在实验操作中，对模型组2号兔的操作可能出现没有避开血管注射的失误，故在日后的实验操作中要注意注射手法和手感，减少动物死亡率和实验误差。
3.2 兔膝骨关节炎滑膜炎模型评价
3.2.1 兔膝关节滑膜表观及组织学改变膝关节滑膜的形态学改变是判断模型建立成功与否的重要指标之一。孙鲁宁等[18]进行诱发性膝骨关节炎造模时发现给实验兔注射木瓜蛋白酶2周后，模型兔患侧膝盖皮肤颜色略红、髌下脂肪垫肿胀明显、关节腔内积液显著增多，滑膜增生充血呈鲜红色。张康乐等[19]进行早期膝骨关节炎模型制备时发现，造模第2周时，兔子关节周围温度较高，滑膜增厚，且毛细血管充血明显。此次实验在造模结束后对模型兔患侧膝关节进行解剖，发现模型兔膝关节肤温明显高于对照组兔，其髌下脂肪垫增厚压迫滑膜，关节周围有淤血现象，与前人实验所观察到的现象基本一致，提示膝骨关节炎滑膜炎表观现象成功呈现出来。
组织学活检是诊断滑膜炎的金标准，滑膜炎公认的病理改变为滑膜细胞的增生、血管的生成和炎性细胞的浸润[20]。BARBOSA等[21]通过对大鼠进行30 d的膝骨关节炎造模发现，大鼠患膝滑膜组织学显示炎症细胞注入，且滑膜中出现成纤维细胞增殖现象。李宁等[22]建立的兔创伤性膝关节滑膜炎模型滑膜组织排列混乱，滑膜细胞增生肥大，大量炎细胞浸润。SIEKER等[23]利用小型猪进行膝骨关节炎模型制备，发现模型动物滑膜内衬增厚，间质细胞增生。此次实验模型滑膜增厚，同时伴有大量炎症细胞增生浸润现象；建立的模型在滑膜组织学上的表现符合滑膜炎的病理改变，并与前人实验结果较为一致，因此可以认为在组织学上已成功建立膝骨关节炎滑膜炎模型。
3.2.2 兔膝关节滑膜影像学改变影像学检查可以从宏观上观察整个膝关节的改变，从而判断兔膝关节滑膜炎的整体表现。而且与X射线技术相比，MRI能更早地观察到膝骨关节炎的发生，是评估膝关节滑膜炎的最优选方法[24]。多项研究共同发现，膝骨关节炎发生前期或早期，大部分患者膝关节MRI会呈现关节积液和髌下脂肪垫增生等体征[25]。YUSUF等[26]曾对相关文献进行系统评价，发现在MRI图像中，滑膜组织损伤和滑膜渗出与膝痛密切相关，为中度可信证据，提示膝骨关节炎的发生可能来源于滑膜的损伤。ATUKORALA等[5]也在48个月的回访试验中发现大部分膝骨关节炎患者在确诊前一年所拍摄的MRI矢状面图能观察到明显的滑膜增厚和关节渗出现象，进一步表明膝骨关节炎发生前期存在滑膜炎症现象，两者关系密切。ROEMER等[27]针对出现膝关节滑膜炎但尚未出现软骨等关节结构性损伤的受试对象进行MRI观察，经过30个月的观察随访，发现患有滑膜渗出类型滑膜炎患者有较高风险继发软骨损伤等膝骨关节炎体征，提示滑膜炎的发生对于膝骨关节炎具有重要的预测作用。此次实验通过对模型兔的膝关节进行MRI扫描，采用T2WI抑脂图观察膝关节周围软组织的改变，发现模型兔膝关节有明显的滑膜渗出现象，同时伴有髌下脂肪垫肥大，与前述研究所得结果较为一致。值得注意的是，模型兔膝关节MRI图像中软骨有不连续影存在，提示膝骨关节炎早期的发生，该现象进一步体现了膝关节滑膜炎与膝骨关节炎早期关系密切，并可合理推测：在病程上，膝骨关节炎滑膜炎的发生早于膝骨关节炎的确诊，两者存在着先后顺序，并极有可能存在着因果关系。然而，有专家提出，增强扫描是观察滑膜炎的金标准，但此次实验重点在于模型制备与评价，ATUKORALA等[5]认为对比剂对于人体可能会出现不良反应等事件，由于目前关于兔膝关节滑膜炎造模的文章较少，对于对比剂的剂量及可能造成影响实验结果等不稳定因素的控制方法尚不成熟，作者决定采用T2WI抑脂图进行观察。
3.2.3 兔膝关节滑膜炎症水平膝骨关节炎的发生曾被归因于软骨基质受压所致，而近年来有研究发现，膝骨关节炎的发生主要是由于软骨、骨骼和滑膜释放的炎症因子所致，这种现象被称为“炎症理论”[28]。膝关节滑膜炎产生的促炎因子打破软骨降解和修复的平衡，使软骨被水解，受损的软骨可诱导膝关节肿瘤坏死因子α和白细胞介素1大量产生，两者在促进软骨降解的同时，导致滑膜组织发生纤维样变，进一步加重滑膜炎的病症，形成恶性循环[20]。李慧英等[29]发现，兔膝关节创伤性滑膜炎模型的白细胞介素1和肿瘤坏死因子α明显增高。另有报道指出，膝骨关节炎发生时，单核细胞渗入滑膜，促炎因子在外周血和滑膜滑液均能被检测到，滑膜炎可发生在膝骨关节炎病程中多个阶段[30]。可见膝关节滑膜的炎症反应是导致膝骨关节炎的发病标志。此外，白细胞介素1β能促使软骨细胞分泌前列腺素E2，进而引起患者膝关节血管增生，产生疼痛等反应，进一步加重膝骨关节炎的病症[31]。ZHANG等[32]研究发现，膝关节疼痛的波动性与滑膜炎的严重程度有关；NEES等[33]认为是分子和细胞的交互作用导致骨关节炎相关的疼痛，提示滑膜炎炎症水平和疼痛因子的释放影响膝骨关节炎发病进程。此次实验通过对实验兔滑膜滑液进行炎症水平检测，发现模型组兔肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β及前列腺素E2表达水平明显高于对照组，与前述实验结果一致，从分子水平证明了模型组兔存在膝骨关节炎滑膜炎，联系前文论述，可综合评价膝骨关节炎滑膜炎模型制备成功。
3.3 小结通过“损伤-修复-再损伤”方法可以成功建立兔膝骨关节炎滑膜炎模型。同时，通过对模型动物膝关节表面、滑膜组织学变化、膝关节滑液渗出及滑膜增厚情况进行观察，联合测定滑液炎症水平的变化进行综合评价，可以合理判定模型建立成功与否[34-35]。值得注意的是，此次实验没有从功能上进行模型评价，后期实验可以研究并制定更完备的模型评价体系。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

基于“损伤-修复-再损伤”方法制备兔膝骨关节炎滑膜炎模型

Preparing a rabbit model of synovitis in knee osteoarthritis based on the “injury-repair-reinjury” method

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