1.4.5  RT-PCR检测肿瘤坏死因子α、JAK3、STAT3 mRNA表达水平变化  治疗12周后取各组大鼠踝关节软骨组织，根据试剂盒说明使用Trizol从关节软骨组织中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA，并使用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法进行定量扩增，以β-actin为内参，循环参数：60 ℃，10 min，95 ℃、72 ℃各30 s，95 ℃，5 min，循环40次，实验重复3次，用2^-ΔΔCT法计算目的基因表达。引物序列见表1。

2.2  各组大鼠关节炎指数  与模型组比较，治疗1，6，12周甲氨蝶呤组、电针组、甲氨蝶呤+电针组关节炎指数明显降低，且甲氨蝶呤+电针组关节炎指数低于甲氨蝶呤组、电针组，见表2。

2.3  苏木精-伊红染色结果  正常对照组大鼠未见滑膜组织病变、关节囊增生；模型组大鼠滑膜组织中有大量炎性细胞浸润，滑膜内血管扩张及增生形成血管翳，囊内韧带神经损伤，滑膜和纤维组织增生；甲氨蝶呤组、电针组滑膜组织改变较模型组减轻；甲氨蝶呤+电针组滑膜组织炎性细胞浸润、滑膜纤维增生明显减少，见图1。

2.4  RT-PCR检测关节软骨组织中肿瘤坏死因子α、JAK3、STAT3 mRNA表达水平  与模型组比较，甲氨蝶呤组、电针组、甲氨蝶呤+电针组肿瘤坏死因子α、JAK3、STAT3 mRNA表达水平明显降低(P < 0.05)，且甲氨蝶呤+电针组肿瘤坏死因子α、JAK3、STAT3 mRNA表达水平低于甲氨蝶呤组、电针组(P < 0.05)，见图2。

2.5  Western blot法检测肿瘤坏死因子α、JAK3、STAT3蛋白表达  甲氨蝶呤+电针组肿瘤坏死因子α、JAK3、STAT3蛋白表达最低，甲氨蝶呤组、电针组其次，模型组最高，甲氨蝶呤组、电针组高于甲氨蝶呤+电针组，模型组高于甲氨蝶呤组、电针组，5组肿瘤坏死因子α、JAK3、STAT3蛋白表达比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.6  各组大鼠关节软骨细胞凋亡情况  流式细胞术检测发现：模型组软骨细胞凋亡率最高，甲氨蝶呤组、电针组其次，甲氨蝶呤+电针组软骨细胞凋亡率低于甲氨蝶呤组、电针组，但高于正常对照组，5组细胞凋亡率差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

类风湿关节炎是一种慢性疾病，常侵犯受累关节的滑膜并引起滑膜炎及大量血管翳的形成，最终造成软骨及骨的破坏^[1-2]，其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失^[3]。肿瘤坏死因子等炎性因子主要由T细胞等免疫细胞产生，这些炎性因子参与类风湿关节炎的发展及软骨细胞的代谢，由此得知炎性反应与类风湿关节炎有关^[4]。在类风湿关节炎起病和关节破坏过程中，JAK/STAT信号通路发挥重要的调控作用，抑制这一通路将成为治疗类风湿关节炎的新靶点。JAK/STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其他信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由3个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT^[5]。研究发现，JAK2受抑制后其下游核转录因子STAT1，3，5无法活化，尤其是STAT3不能移至核内结合于肿瘤坏死因子α基因启动子上，而丝氨酸727的磷酸化能促进STAT3的活化功能，特别是与低亲和力位点的结合。现在已经明确，肿瘤坏死因子α mRNA启动子上含有STAT3结合位点，抑制STAT3的活化可降低肿瘤坏死因子α mRNA的转录水平，因此JAK/STAT信号与肿瘤坏死因子α有密切联系^[6]。近年来，针灸治疗类风湿关节炎的疗效被医学界所认可，得到越来越多的临床医生重视^[7]。针灸通过改善患肢的炎症反应，抑制炎症递质的生成，对血管内皮细胞及滑膜组织起到保护作用，从根本上达到治疗类风湿关节炎的效果^[8]。目前，甲氨蝶呤在治疗类风湿疾病中效果显著，是治疗类风湿关节炎应用药物中的首选^[9]。该研究探讨甲氨蝶呤联合电针对类风湿关节炎大鼠的治疗效果及对肿瘤坏死因子、JAK-STAT信号通路的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年5月至2019年5月在河南大学第一附属医院实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  雌性Wistar大鼠100只，6周龄，体质量为(200±17) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，所有实验动物均接受标准饮食，对动物处置符合动物伦理要求并通过河南大学伦理委员会评审，许可证号：SYXK 2017-0005。

1.3.2  实验试剂  Ⅱ胶原酶(美国NV有限公司)；羊抗鼠IgG抗体(山东长健生物药品有限公司)；肿瘤坏死因子α双克隆抗体(美国NV公司)；反转录聚合酶链反应试剂盒(宝长生生物制药有限公司)。

1.4  方法

1.4.1  类风湿关节炎模型建立  取80只大鼠用于建立类风湿关节炎模型。将含0.12 mol/L醋酸的Ⅱ型胶原酶溶液与完全弗氏佐剂混匀制备0.6 g/L的乳剂，尾静脉注射水合氯醛(8 mL/kg)将大鼠麻醉，在每只大鼠背部皮下多点注射配好的乳剂1.5 mL，5 d后加强免疫相等剂量乳剂1次^[9]，建立类风湿关节炎模型，关节炎指数>3分。另取20只大鼠不造模不进行干预为正常对照组。

1.4.2  分组给药  选取80只建模成功的大鼠，随机分为模型组、甲氨蝶呤组、电针组、甲氨蝶呤+电针组，每组20只。模型组不做处理；甲氨蝶呤组造模成功后1 d予以甲氨蝶呤片制成粉末并按照0.75 mg/kg称取粉末溶于大鼠饮用水1.5 mL灌胃^[9]，1次/d，连续灌胃6 d；电针组造模成功后1 d取0.25 mm×13 mm针灸针刺入四关穴(双侧“合谷”及“太冲”)，深度1.0-2.0 cm，并连接电针仪，电流强度1 mA，频率为2 Hz/15 Hz，其中“合谷”穴接正极，“太冲”穴接负极^[10]，1次/d，20 min/次，连续6 d；甲氨蝶呤+电针组大鼠在造模成功后1 d于甲氨蝶呤组基础上进行电针治疗，方法同甲氨蝶呤组和电针组。

1.4.3  类风湿关节炎指数(疗效)  治疗1，6，12周测定大鼠关节炎指数，0分：关节没有明显炎症；1分：小趾关节有轻微炎症；2分：趾、足趾关节可见明显炎症；3分：踝关节以下的足爪关节出现炎症；4分：踝关节在内的全部足爪都呈炎症状态^[11]。

1.4.4  苏木精-伊红染色  治疗12周后麻醉处死大鼠取踝关节，甲醛溶液固定，脱钙剂脱钙，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，常规切片4 μm，进行苏木精-伊红染色，于显微镜下观察踝关节组织学变化。

1.4.5  RT-PCR检测肿瘤坏死因子α、JAK3、STAT3 mRNA表达水平变化  治疗12周后取各组大鼠踝关节软骨组织，根据试剂盒说明使用Trizol从关节软骨组织中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA，并使用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法进行定量扩增，以β-actin为内参，循环参数：60 ℃，10 min，95 ℃、72 ℃各30 s，95 ℃，5 min，循环40次，实验重复3次，用2^-ΔΔCT法计算目的基因表达。引物序列见表1。

1.4.6  Western blot法检测肿瘤坏死因子α、JAK3、STAT3蛋白表达  治疗12周后取各组大鼠踝关节软骨组织，PBS洗涤，将1 mL裂解液与切碎的关节软骨混匀，提取总蛋白并测定浓度，采用12%SDS-PAGE凝胶，蛋白上样量为50 μg/孔，电泳后转移蛋白至PVDF膜上，TBST洗2次×10 min，加入5%脱脂奶粉于水平摇床封闭2 h，滴加肿瘤坏死因子α、STAT3、JAK3和β-actin一抗(1∶1 000)4 ℃过夜，TBST漂洗3次×10 min，加入二抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次×  10 min，加入化学发光试剂ECL显色，用凝胶成像系统拍照，所有免疫印迹条带进行吸光度分析，目标条带与内参条带吸光度值之比作为目的蛋白的相对表达水平。

1.4.7  流式细胞仪检测软骨细胞凋亡程度  治疗12周后取各组大鼠踝关节软骨组织，加入RIPA裂解液裂解20 min，1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入100 μL 1 ×结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶混匀，避光孵育15 min，加入400 μL 1×结合缓冲液混匀，洗涤3次，流式细胞仪检测软骨细胞凋亡情况。

1.5  主要观察指标  ①关节炎指数；②踝关节组织学变化；③踝关节软骨组织中肿瘤坏死因子α、JAK3、STAT3表达水平；④软骨细胞凋亡率。

1.6  统计学分析  用SPSS 19.0软件进行统计分析，结果以x(_)±s表示，不同时间点比较采用重复测量方差分析，5组之间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

类风湿关节炎是以关节组织慢性炎症为主要表现的系统性自身免疫性疾病，该类患者临床表现常以小关节起病，多为对称性，先影响关节滑膜，随后侵蚀关节软骨和骨组织，导致关节结构破坏、关节畸形、功能丧失^[12]。类风湿关节炎患者经常伴有关节外器官受累，或血清类风湿因子呈阳性状态，病初多数患者不易察觉，病程缓慢，因此明确类风湿关节炎的发病机制并探索高效的治疗方法是目前迫切需要解决的问题^[13]。

该研究发现，与模型组比较，甲氨蝶呤组、电针组关节炎指数明显降低，且甲氨蝶呤+电针组关节炎指数进一步降低。模型组滑膜组织内被广泛炎症细胞浸润，关节囊可见囊性炎症增生，滑膜内血管扩张形成血管翳，囊内韧带神经损伤，滑膜和纤维组织增生；甲氨蝶呤组、电针组滑膜组织改变较模型组减轻；甲氨蝶呤+电针组滑膜组织炎性细胞浸润、滑膜纤维增生明显减少。中医学上认为风、寒气、湿气的侵袭是导致类风湿关节炎的外因，肝亏、气血不足等是内因，驱冷除湿、活血、补肝益气是主要的治疗方式，电针是一种传统非药物治疗方式，合谷穴有解表散热、活血调肠、镇痛通络的功效，太冲穴有疏肝气、调气血，可疏肝解郁、平肝潜阳，电针刺激合谷穴及太冲穴在多种疾病治疗中发挥重要作用，在抗炎、免疫调节、止痛等方面均取得了较好的治疗效果^[14-15]。甲氨蝶呤最早是众多癌症化疗药中的一种，近年来研究发现甲氨蝶呤可对T淋巴细胞产生调控作用，提高机体免疫功能，以此来改善类风湿关节炎的疾病进展^[16]。研究表明，甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎的疗效更好，其作用机制可能与抑制炎症反应和软骨细胞凋亡有关^[17]。

该研究发现，与模型组比较，甲氨蝶呤组、电针组、甲氨蝶呤+电针组肿瘤坏死因子α、JAK3、STAT3 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)，且甲氨蝶呤+电针组肿瘤坏死因子α、JAK3、STAT3 mRNA和蛋白表达水平低于甲氨蝶呤组、电针组(P < 0.05)。流式细胞术检测模型组软骨细胞凋亡率最高，甲氨蝶呤组、电针组其次，甲氨蝶呤+电针组软骨细胞凋亡率最低。JAK-STAT信号通路参与调控多种组织、细胞、器官的生长发育，在类风湿关节炎进展过程中影响关节的破坏和血管的生成^[18-19]，抑制JAK-STAT信号通路能改善关节骨质的破坏，抑制滑膜细胞凋亡、降低炎症因子水平，肿瘤坏死因子α是一种刺激滑膜细胞分泌胶原酶的炎性因子，胶原促使关节滑膜大量增生形成血管翳^[20]。研究发现使用甲氨蝶呤可抑制肿瘤坏死因子α及JAK-STAT信号的表达，减轻患者机体炎性水平^[21]。

综上所述，甲氨蝶呤联合电针治疗类风湿关节炎效果较好，可抑制肿瘤坏死因子α、JAK-STAT通路活性，减轻软骨细胞凋亡，对关节软骨起到保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

类风湿关节炎：是一种慢性疾病，经常伴有关节外器官受累或血清类风湿因子呈阳性状态，病初多数患者不易察觉，病程缓慢，给患者身体健康带来严重影响。

肿瘤坏死因子：主要由T细胞等免疫细胞产生，参与类风湿关节炎的发展及软骨细胞的代谢，与类风湿关节炎的发生密切相关。

类风湿关节炎是以关节组织慢性炎症为主要表现的系统性自身免疫性疾病，该类患者临床表现常以小关节起病，多为对称性，先影响关节滑膜，随后侵蚀关节软骨和骨组织，导致关节结构破坏、关节畸表、功能丧失。类风湿关节炎患者经常伴有关节外器官受累或血清类风湿因子呈阳性状态，病初多数患者不易察觉，病程缓慢，因此明确类风湿关节炎的发病机制并探索高效的治疗方法是目前迫切需要解决的问题。近年来，针灸治疗类风湿关节炎的疗效被医学界所认可，得到越来越多的临床医生重视。针灸通过改善患肢的炎症反应，抑制炎症递质的生成，对血管内皮细胞及滑膜组织起到保护作用，从根本上达到治疗类风湿关节炎的效果。目前，甲氨蝶呤在治疗类风湿疾病中效果显著，是治疗类风湿关节炎应用药物中的首选。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程