2.1   间充质干细胞源性外泌体的生物学特征   间充质干细胞在脑血管疾病中的作用被认可，间充质干细胞与神经生成、突触形成、轴突连接、髓鞘形成和免疫调节有关[15-17]。间充质干细胞广泛存在于人体组织中，同时也是产生外泌体能力最强的细胞。细胞移植不仅可以重组神经元网络，而且能够减少炎症反应，促进轴突再生和突触形成。







2.2   间充质干细胞源性外泌体治疗缺血性卒中的作用  



间充质干细胞源性外泌体因其独特的生物特点，可应用于肿瘤、宫腔粘连、肺损伤、骨关节炎及缺血性脑卒中等临床各种疾病。XING等[26]研究结果显示间充质干细胞源性外泌体通过作用于GARP抑制细胞增殖、迁移、侵袭，发挥靶向GARP在小鼠结肠癌细胞MC38中的治疗作用。TAN等[27]研究表明骨髓间充质干细胞源性外泌体在体外能促进细胞增殖和迁移，并能修复宫腔粘连模型小鼠的子宫内膜，骨髓间充质干细胞源性外泌体可能通过过表达miR-29a在子宫内膜修复过程中起到抵抗纤维化的作用。MIZUTA等[28]应用间充质干细胞源性外泌体治疗急性肺损伤小鼠模型，结果显示间充质干细胞源性外泌体中miR-126表达增加，明显提高了小鼠的存活率，抑制了肺出血和水肿，并减小血管通透性，进一步发现间充质干细胞源性外泌体可能通过激活PI3K/Akt通路对内皮细胞发挥保护作用。在缺血性卒中实验研究中发现间充质干细胞源性外泌体具有改善血流恢复、减少梗死体积及药物传递的作用[24-25]，有很好的临床应用价值。
2.2.1   间充质干细胞源性外泌体与血脑屏障   缺血性脑卒中后发生的病理改变主要在神经血管单元。神经血管单元主要有周细胞、脑血管内皮细胞、脑实质细胞及血脑屏障相关紧密连接蛋白构成[29]。缺血性脑卒中后血脑屏障被破坏，周细胞和大脑内皮细胞相互作用，促进血管新生，修复血脑屏障[10]。研究表明，过表达miR-21-3p通过调节MAT2B功能，促进细胞凋亡和炎症，加重血脑屏障损伤[30]。LI等[31]研究显示间充质干细胞能够增加大脑中动脉闭塞大鼠模型中的紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5的分布，改善血脑屏障状态，减轻脑水肿，进一步表明间充质干细胞通过抑制miR-21-3p水平和上调MAT2B水平，抑制细胞凋亡、炎症反应起到缺血性脑损伤的保护作用。大脑中动脉闭塞模型侧脑室注射miR-132，结果显示外源性miR-132可以降低血脑屏障紧密连接的降解，减少梗死体积，减轻脑水肿，改善神经功能[32]。通过调节血脑屏障通透性对于卒中后康复具有重要的意义。
2.2.2   间充质干细胞源性外泌体与血管新生   脑缺血后血管阻塞会破坏血管本身的结构，改变血管通透性，能够正常供血供氧的血管减少。间充质干细胞源性外泌体通过调节神经血管单元细胞间的信息交流，促进血管生成，改善大脑微环境，从而恢复脑组织氧和能量供应，改善血管功能，促进卒中后患者的康复[33-34]。XIN等[11]构建大脑中动脉闭塞大鼠模型24 h后尾静脉注射间充质干细胞源性外泌体，结果显示血管内皮细胞数量显著增加，表明间充质干细胞源性外泌体可以改善卒中后血管新生。间充质干细胞源性外泌体实验组大鼠Ki67+DCN+细胞增加，外泌体分泌miR-210、miR-184、miR-137表达上调，可能与血管新生、神经发生有关[35]。由于外泌体的功能一部分与来源干细胞有关，神经元及血管内皮细胞来源外泌体对卒中后血管修复有着重要的作用[36]。
2.2.3   间充质干细胞源性外泌体与神经分化   神经系统中的神经干细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而产生具有自我更新能力的脑组织细胞。实验研究表明，脑卒中后静脉注射间充质干细胞源性外泌体可以改善卒中后神经新生与血管重建[36]。大脑中动脉闭塞模型大鼠尾静脉注射骨髓间充质干细胞源性外泌体，可促进脑卒中后的功能恢复，增强神经突起重塑、神经发生和血管生成，是治疗脑卒中的一种新方法[11]。静脉输注富含外泌体的骨髓间充质干细胞可显著改善大脑中动脉闭塞模型大鼠缺血皮质的轴突重塑[37]，间充质干细胞源性外泌体已经被证实可促进神经分化，进而改善神经功能。
2.2.4   间充质干细胞源性外泌体与神经修复   由于卒中后缺血缺氧会损伤神经功能，加速神经细胞的凋亡。缺血性卒中模型大鼠静脉给予含miR-17-92的外泌体，可以增加脑卒中后神经可塑性和功能恢复，其机制可能是通过靶向PTEN激活下游PI3K/Akt/mTOR/GSK-3β信号通路[38]。给予大鼠注射沉默miR-133b的间充质干细胞源性外泌体可以增加缺血性脑组织中CTGF和RhoA水平，导致神经功能衰减，而miR-133b水平升高具有相反的作用，因此间充质干细胞源性外泌体可以抑制靶点RhoA，促进神经突触的增加[39-40]。大脑中动脉闭塞模型大鼠静脉注射脂肪间充质干细胞源性外泌体，可以降低大鼠脑梗死面积，促进神经功能修复[41-42]。
2.2.5   间充质干细胞源性外泌体与免疫炎症及氧化应激   脑卒中后发生的免疫炎症和氧化应激反应可以促进脑卒中的进展，多种炎症因子、淋巴细胞、氧化分子作用可导致梗死面积扩大，加重病情，因此调节免疫反应、抗炎、抗氧化对于缺血性卒中具有重要临床意义[43-44]。CECI等[45]通过研究比较斑马鱼和哺乳动物神经元再生情况以及哺乳动物神经元再生失败的机制，认为炎症作用是神经元再生的主要抑制剂。间充质干细胞源性外泌体在器官炎症损伤中起着重要的作用，有研究表明间充质干细胞源性外泌体通过逆转CysLT2R-ERK1/2介导的小胶质细胞M1极化减弱了脑损伤并抑制了小胶质细胞炎症反应[41]。脑卒中后神经元和小胶质细胞相互作用调节免疫炎症反应，骨髓间充质干细胞源性外泌体miR-138-5p通过靶向作用抑铁素2，促进缺血性卒中后星形胶质细胞增殖，抑制炎症反应，从而减轻神经功能损伤，可能为缺血性卒中治疗提供新的靶点。研究表明，局灶缺血性脑卒中大鼠谷氨酰胺酶1表达水平上调，通过谷氨酰胺酶抑制剂CB839抑制谷氨酰胺酶1活性降低梗死体积，减轻炎症反应[21]。外泌体治疗可以降低炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的表达，升高抗炎因子白细胞介素4、白细胞介素10的表达，减轻脑损伤[46]。间充质干细胞源性外泌体可以增强CD4和CD8淋巴细胞的激活以及树突状细胞的减少，调节脑卒中引起的外周免疫抑制[47]，外泌体可以通过血脑屏障，将抗原传递到免疫系统[48]。
综上所述，间充质干细胞源性外泌体可以调节脑卒中后血脑屏障通透性、促进血管新生、改善神经功能、促进神经修复，有望成为缺血性脑卒中一种新的治疗方法。
2.3   间充质干细胞源性外泌体作为中药载体治疗缺血性脑卒中的作用   



现代研究表明，外泌体作为一种可靠载体靶向传递信息物质，传统中药可通过多靶点对机体进行调控，外泌体作为内源性药物传递纳米系统具有很大的治疗潜力，因此研究将中药有效成分通过外泌体精准运输至靶细胞，发挥药效，成为近年来研究的热点[49]。外泌体可作为药物载体的机制特点如下：①外泌体表面存在特殊的蛋白及磷脂双分子层结构，不仅对外泌体所负载药物有保护作用，而且可以避免被体内系统捕获，长时间发挥作用；②外泌体的天然结构特点，使其更容易与受体细胞融合，其所负载药物更容易被细胞接受[50]；③外泌体由于其体积微小(< 100 nm)，可有效避免单核巨噬细胞的吞噬，能够较自由地穿过血管壁及细胞外基质发挥作用[51]；④外泌体具有独特的特性，包括低免疫原性、固有稳定性、高传递效率和能穿过血脑屏障，作为治疗脑缺血的内源性药物递送纳米系统前景广阔。外泌体负载药物可以用多种方式，目前可通过以下方式进行：①直接转染法，将药物与分离出的外泌体混合培养，通过顺浓度梯度直接进入外泌体内；②间接转染法，将药物与分泌外泌体的细胞一起培养，然后分离出含有药物的外泌体；③穿孔，通过电穿孔法使药物通过小孔进入外泌体内[52]。外泌体目前所负载的药物主要包括基因类、抗癌症药物、抗炎症药物、调节免疫的抗原、蛋白类和中药类药物[50]。将中药有效成分通过外泌体运输到体内可更好地发挥中药作用，进行靶向治疗疾病。目前用于治疗肿瘤性疾病较为广泛，近年来也相继应用于骨性疾病、肝脏疾病及脑血管疾病等。缺血性卒中目前需要探索更有效的治疗方法，研究显示间充质干细胞源性外泌体可以通过负载中药姜黄素、梓醇、灯盏花素等药物起到神经保护、血管新生的作用。
2.3.1   间充质干细胞源性外泌体作为中药载体与神经保护作用   间充质干细胞源性外泌体作为姜黄素的载体，治疗缺血性脑卒中可以起到神经保护作用。姜黄素是一种发现于姜黄根块茎的黄色化合物。姜黄具有行气活血、通经止痛的作用，用于治疗气滞血瘀、经络不畅证。姜黄素在结构上是一种二酮类化合物，在水中以酮形式存在，在有机溶剂中以酚形式存在[14]。姜黄素含有有效成分多酚，具有抗血脂、抗炎、抗氧化、抗癌及神经保护作用[53]。姜黄素作用广泛，但是在临床运用中存在一定缺陷，虽然其神经保护作用使该化合物进入了Ⅰ期临床试验，但其溶解度不高、稳定性差、吸收率低、代谢快、半衰期短等缺点，导致其利用度低，限制了在治疗疾病中的应用[54]。研究发现，通过不同大小载体运输会影响其溶解度和治疗效果，用姜黄素调控外泌体可以提高其溶解度、利用率和稳定性[21]。一些外泌体能够避开免疫系统，在血液中表现出低免疫反应和高稳定性，延长药物在体内的循环从而更好发挥药效[55]。KALANI等[14，56]证明负载姜黄素的外泌体不仅具有抗血脂、抗氧化和抗炎的作用，还可以改善内皮细胞通透性，减少氧化应激，减轻连接蛋白的结构损伤，从而起到保护神经的作用。研究显示负载姜黄素的外泌体通过AKT/GSK-3β通路抑制Tau蛋白磷酸化，保护神经[57]。综上所述，姜黄素是一种具有临床研究价值的神经保护性药物。
2.3.2   间充质干细胞源性外泌体作为中药载体与血管新生   间充质干细胞源性外泌体作为梓醇中药的载体，治疗缺血性脑卒中可以有助于血管新生。梓醇是地黄的主要有效成分，地黄为玄参科地黄属植物，具有养阴补血、填精益髓的功效，用于治疗血虚证、肝肾阴虚证。梓醇通过上调血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体2表达而促进细胞增殖、迁移，进而发挥促进血管新生的作用。梓醇在神经方面的治疗机制包括促进缺血后神经功能恢复、保护神经血管单元、促进局灶脑缺血大鼠神经元新生、轴突形成新的突触连接、上调神经营养因子表达，但其本身入脑效果较差，与冰片配伍后可促进梓醇透过血脑屏障[58-59]。此外，研究还发现通过构建转铁蛋白、脑啡肽和间充质干细胞源性外泌体组成特异性小泡，特异性靶向跨越血脑屏障后的神经元，在体内外发挥抑制神经细胞凋亡和促进神经细胞再生的作用[60]。
2.3.3   间充质干细胞源性外泌体作为中药载体与血脑屏障   间充质干细胞源性外泌体作为灯盏花素的载体，治疗缺血性脑卒中可以有助于调节血脑屏障通透性。灯盏花素是来源于植物高黄芩的叶，高黄芩为有唇科植物。黄芩具有清热燥湿、止血的作用，可泄实火、除湿热、止血。灯盏花素具有扩张血管、改善微循环、抗血小板聚集的作用，广泛用于缺血性脑血管疾病。灯盏花素干预的外泌体可以保护同型半胱氨酸诱导的大鼠微血管内皮细胞损伤，主要通过上调CD63及血脑屏障紧密连接蛋白claudin 5、occludin和ZO-1的表达发挥作用[61]。刘梦琳等[62]临床验证得出灯盏花素注射液联合常规治疗可以改善神经功能，改善血流变指标。由此说明灯盏花素通过外泌体作用治疗缺血性卒中具有一定前景。
课题组前期研究表明间充质干细胞源性外泌体经补阳还五汤诱导后miRNA-126表达升高，miR-221和miR-222表达降低，与卒中后脑血管新生有关[63]。复方补阳还五汤是治疗缺血性卒中的经典方剂，主要有黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁组成。该方重用黄芪，补益元气，使气旺血行，为君药；当归尾活血通络不伤血，为臣药；地龙活血通络，周行全身，为佐药；赤芍、川芎、桃仁、红花协同当归尾以活血祛瘀。该方补气药与活血药配伍，补气不壅滞，活血不伤正，用于治疗中风病之气虚血瘀证。通过中药调控外泌体既可以更好地发挥中药的作用，又体现精准医疗的理念，提高临床治疗效果。
汇总调控外泌体治疗缺血性脑卒中的中药，见表1。 

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脑卒中是仅次于心肌梗死的第二大常见死亡原因，占全世界死亡率的9%，卒中后会导致患者神经功能缺陷，具有高致残率和复发率的特点，其中缺血性卒中占所有卒中的87%，由于血管阻塞导致脑组织血流量和供氧减少是神经细胞死亡的重要原因[1-3]。脑卒中后发生一系列级联反应，病理过程包括神经损伤、炎症反应、氧化应激、免疫反应等，有多种通路参与，主要包括TLT通路、MAPK通路、NF-κB通路等。脑卒中可引起神经元、神经胶质细胞和血管损伤，以及血脑屏障通透性增加会导致血管炎性水肿[4]。缺血性脑卒中治疗的主要目标是尽快恢复血流，减轻脑损伤。目前主要的再通方法是静脉溶栓和血管取栓，但是这两种治疗方法受治疗窗和颅内出血风险及血管条件限制，能及时接受治疗的患者有一定局限性，因此需要探索更有效、更安全的治疗途径[5-6]。
研究表明，多能间充质干细胞在脑卒中后神经血管重建和功能恢复方面具有很大前景，然而其治疗机制可能是通过外泌体的分泌，而不是直接替代脑细胞[7]。动物实验表明，间充质干细胞分泌的外泌体能够改善卒中预后[8]。基于细胞不能透过血脑屏障到达缺血区，而且有微血管阻塞、恶性转化、引起肿瘤的潜在风险，因此细胞治疗神经系统疾病的潜力是有限的[9]。外泌体能够透过血脑屏障，而且在外周循环相对稳定，更重要的是外泌体可以直接将各种生物活性分子包括非编码调节RNA(miRNAs)、信使RNA(mRNAs)和蛋白质从供体细胞转移到受体细胞。外泌体可以增加脑卒中后的长期神经保护作用，调节外周免疫反应，增加血管新生和轴突树突重构，因此利用外泌体治疗神经系统疾病极具吸引力[10]。XIN等[11]通过静脉注射间充质干细胞源性外泌体于大脑中动脉闭塞大鼠模型，可以改善神经缺损，促进卒中后神经发生。有作者系统回顾得出中药在改善缺血性卒中后神经缺损方面有潜在疗效[12]。LIU等[13]进行随机对照试验，治疗2周后基础治疗加中医综合治疗组NIHHSS评分、Barthel 指数和影像评估比西医基础治疗组改善更好，为中药治疗脑梗死提供了循证依据。动物实验研究表明姜黄素可诱导外泌体对大脑内皮细胞发挥保护作用，或负载于外泌体内可以改善卒中后损伤的神经元和脑血管系统[14]。中药调控外泌体治疗缺血性脑卒中可以提高中药利用率、进行靶向治疗、提高疗效、体现精准医学的理念，是未来中医药与现代科技结合的一个重要研究领域。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   资料来源   由第一作者检索万方、CNKI、PubMed、Web of Science等数据库中与主题相关的文献。以“间充质干细胞，外泌体，中药，缺血性脑卒中”和“mesenchymal stem cells(MSCs)，
exosomes，Traditional Chinese medicine(TCM)，ischemic stroke”为中、英文检索词。检索式：(主题：(间充质干细胞)*主题：(外泌体)*主题：(中药)*主题：(缺血性脑卒中))和“(mesenchymal stem cells AND exosomes AND stroke) OR (exosomes AND Traditional 
Chinese medicine AND ischemic stroke)”。检索的时间范围是2009-2020年，检索到中文文献70篇，英文文献356篇。
1.2   文献筛选标准   将文献进行筛选，去除重复文献及与研究内容不相符的文献，选择与研究目的和研究内容紧密联系的文献。

1.3   质量评估及数据提取   通过信息检索，选取66篇相关文献进行归纳整理，见图1。

综上所述，间充质干细胞源性外泌体可通过调节血脑屏障通透性，促进血管新生、神经分化、神经修复，调节免疫反应与氧化应激，改善脑卒中患者的相关功能。鉴于外泌体其自身的生物特点优势，可以作为可靠载体将药物传递至靶器官，具有广阔的临床治疗前景。将中药活性成分通过间充质干细胞源性外泌体治疗缺血性卒中具有以下特点：①间充质干细胞具有增殖、分化和分泌外泌体等活性分子的特点，是细胞治疗疾病的研究热点；②间充质干细胞源性外泌体既具有干细胞的特点，又能穿过血脑屏障，且易于存储和改造，-80 ℃下可保存6个月，这对保护生物有效成分非常重要；③临床有多种治疗缺血性卒中的经典中药，通过现代科技手段可以更好发挥中药的治疗效果。总之，间充质干细胞源性外泌体作为中药载体使其在临床治疗缺血性卒中具有良好的前景。
外泌体既是理想的生物标记物，也是潜在的药物传递载体，在克服干细胞治疗的局限性方面具有巨大潜力。基于外泌体可运载活性物质的特性，最新研究发现外泌体可以作为药物载体，将药物包裹并且靶向传递至靶细胞，用来替代某些易水解的药物，提高疗效[64]。虽然目前用于动物模型取得良好的治疗效果，但是缺乏长期、大样本的临床试验。对于应用于临床尚存在一些问题：①治疗缺血性卒中的经典方剂如补阳还五汤、天麻钩藤饮、镇肝熄风汤及川芎、黄芪、当归等单药是否可以通过外泌体更好地发挥治疗脑卒中的作用，目前缺乏高质量的基础研究与临床研究；②外泌体的分布和不同细胞间分泌机制也有待探索[65]；③体内注射间充质干细胞源性外泌体的生物分布、毒性、清除和安全性的验证，研究时间较短，尚缺乏长期的研究[66]；④外泌体的给药时间、最有效的给药途径、最佳给药剂量目前尚不清晰；⑤长期使用的安全性评价和可能的不良反应需要临床研究[25]；⑥不同细胞分泌外泌体具有不同功效，如何根据需要选择合适的外泌体种类，有助于外泌体与受体细胞更好地结合。
对于上述问题需要进一步研究解决方案。在获取所需外泌体后，应进行关于外泌体给药途径、给药剂量、给药时间方面的研究，对于间充质干细胞源性外泌体的生物分布可以通过活体示踪技术进行检测，还可以通过交叉学科合作方式进行药物动力学方面检测，中药种类及成分复杂，可以通过网络药理学等方式对作用靶点进行初步筛选，提高基础研究的针对性。对于临床设计，细胞传递途径和细胞移植剂量是关键，目前小样本研究显示动静脉注射是安全的，有待于扩大样本或进行系统评价。重要的是，最终的研究成果是应用于临床，服务于广大患者，因此安全性评价和可能的不良反应需要进行临床试验，并进行长期的随访。
总之，研究显示间充质干细胞源性外泌体作为中药载体具有广阔的临床应用前景，尽管目前仍存在一些问题，但是随着基础研究的深入与临床实践的结合，经过一定时间的积累，有望成为治疗缺血性卒中的有效治疗手段。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
外泌体：是由多种细胞分泌的脂质双层膜小泡，直径30-100 nm，含有DNA、RNA、miRNA、蛋白质和脂类，在细胞间信号传递中起着重要的作用。外泌体具有多种功能，其所具备的功能与来源的细胞类型有关，如来源间充质干细胞的外泌体，具有干细胞的增殖、分化能力等。
间充质干细胞：是一种多能干细胞，可以从骨髓、脐带、脐血和脂肪组织等分离得到，具有特殊的自我更新、增殖和多能分化能力，可以产生多种细胞因子和生长因子，影响其他细胞生成，减轻炎症，促进组织修复。近年研究认为间充质干细胞通过旁分泌因子发挥治疗疾病的作用，具有很好的应用前景。

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间充质干细胞源性外泌体治疗疾病是近年来研究的热点，也给脑血管疾病的治疗带来新的方向。间充质干细胞源性外泌体治疗脑卒中的作用与血脑屏障通透性、血管新生、神经分化、神经修复、免疫炎症等有关。中药治疗脑血管疾病具有多靶点作用，能否与外泌体共同发挥协同作用值得进一步研究。此外，目前有许多问题尚不清晰，如干细胞源性外泌体的分泌机制、获取及鉴定，干细胞源性外泌体在体内的分布和安全性验证等。随着研究的深入，间充质干细胞源性外泌体对于缺血性脑卒中甚至其他类疾病都将具有广阔的应用前景。  

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