血清蛋白质组学技术发现鹿角胶治疗维甲酸致股骨头坏死模型大鼠的机制

doi:10.12307/2022.490

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (14): 2243-2251.doi: 10.12307/2022.490

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血清蛋白质组学技术发现鹿角胶治疗维甲酸致股骨头坏死模型大鼠的机制

胡亚楠1，王平2，3，杜海涛2，景田园1，王程程1

1山东中医药大学药学院，山东省济南市 250355；2山东省中医药研究院，山东省济南市 250014；3天津大学精密测试技术及仪器国家重点实验室，天津市 300072

收稿日期:2021-06-02 修回日期:2021-06-04 接受日期:2021-07-14 出版日期:2022-05-18 发布日期:2021-12-22
通讯作者: 王平，硕士，研究员，山东省中医药研究院，山东省济南市 250014；天津大学精密测试技术及仪器国家重点实验室，天津市 300072
作者简介:胡亚楠，女，1995年生，山东省诸城市人，汉族，山东中医药大学在读硕士，主要从事中药药理学研究。
基金资助:
山东省自然科学基金项目(ZR2020MH386)，项目负责人：王平；山东省重大科技创新工程项目(2018CXGC1310，2020CXGC010505-04)，项目负责人：王平；国家重点研发计划项目(2019YFE0117800)；山东省高校中药质量控制与全产业链建设协同创新中心项目(CYLXTCX2021-01；CYLXTCX2020-04)，项目负责人：王平；中央引导地方项目(YDZX20203700002055)，项目负责人：王平

Mechanism by which antler glue treats avascular necrosis of the femoral head induced by retinoic acid in rats: a serum proteomics study

Hu Yanan1, Wang Ping2, 3, Du Haitao2, Jing Tianyuan1, Wang Chengcheng1

1School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; 2Shandong Academy of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; 3State Key Laboratory of Precision Testing Technology and Instruments, Tianjin University, Tianjin 300072, China

Received:2021-06-02 Revised:2021-06-04 Accepted:2021-07-14 Online:2022-05-18 Published:2021-12-22
Contact: Wang Ping, Master, Researcher, Shandong Academy of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; State Key Laboratory of Precision Testing Technology and Instruments, Tianjin University, Tianjin 300072, China
About author:Hu Yanan, Master candidate, School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2020MH386 (to WP); Shandong Provincial Major Science and Technology Innovation Project, No. 2018CXGC1310 and 2020CXGC010505-04 (to WP); the National Key Research and Development Program of China, No. 2019YFE0117800; grants from the Collaborative Innovation Center for the Quality Control of Traditional Chinese Medicine and the Construction of the Whole Industry Chain in Shandong Provincial Universities, Nos. CYLXTCX2021-01 and CYLXTCX2020-04 (to WP); the Central Government-Guided Local Project, No. YDZX20203700002055 (to WP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
非标(Label-free)蛋白质组定量技术：是一种不依赖于同位素标记的新型蛋白质定量技术，该技术通过液质联用对蛋白质酶解肽段进行分析，无需昂贵的稳定同位素标签做内部标准，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样本中相应肽段的信号强度，就能对相应的蛋白质进行相对定量。
蛋白质二硫键异构酶(P4HB)：是编码脯氨酰4-羟化酶膜蛋白β亚基的蛋白编码基因，可改变细胞内外的蛋白质结构，在细胞黏附和细胞迁移中发挥重要作用。

背景：课题组前期研究发现鹿角胶小分子肽富含促进骨生长的肽链，对骨髓间充质干细胞具有良好的促增殖、促成骨化作用。目前对鹿角胶防治股骨头坏死的研究仅停留在物质基础及药效学研究方面，其作用机制及作用靶点尚未明确。
目的：基于蛋白质组学初步探讨鹿角胶治疗股骨头坏死的作用机制。
方法：SPF级雌性Wistar大鼠36只，随机分为空白组、模型组、鹿角胶组，后2组大鼠灌胃维甲酸 70 mg/kg，每日 1 次，连续灌胃8周，建立股骨头坏死大鼠模型；空白组大鼠不做处理。造模8周后鹿角胶组大鼠给予鹿角胶0.35 g/kg，模型组、空白组予同体积0.9%氯化钠溶液，每天灌胃1次，连续给药8周。通过骨组织病理切片检验造模是否成功及鹿角胶对股骨头的修复效果。通过非标(Label-free)蛋白质组定量技术研究各组之间的差异蛋白情况，根据GO和KEGG 数据库分析对差异蛋白的生物功能及参与的信号通路进行富集；采用蛋白质互作STRING Database构建靶点蛋白相互作用图。实验方案经山东省中医药研究院动物实验伦理委员会批准。
结果与结论：①骨组织病理切片结果显示，鹿角胶可有效修复股骨头坏死；②蛋白质组学共鉴定蛋白1 457种，空白组与模型组、模型组与鹿角胶组共同差异蛋白共有353种，其中，在模型组升高或降低的差异蛋白，经过鹿角胶干预后明显回调的蛋白有97种；③鹿角胶治疗股骨头坏死的作用机制涉及到血液循环、能量代谢、炎症反应及免疫过程，利用差异蛋白质组学寻找的蛋白质二硫键异构酶(P4HB)、钙黏蛋白2(CDH2)、膜联蛋白A2(ANXA2)、枯草杆菌前蛋白转换酶/可信9型(PCSK9)、乳脂球-表皮生长因子8(MFGE8)、骨形态发生蛋白等可能是鹿角胶的重要靶点，鹿角胶可能通过调控转化生长因子β、糖酵解/糖异生、PI3K-Akt信号通路等治疗股骨头坏死。

https://orcid.org/0000-0003-4703-2096 (胡亚楠)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 鹿角胶, 血清, 蛋白质组学, 液质联用, 股骨头坏死, 差异蛋白, kegg通路分析, 转化生长因子β

Abstract: BACKGROUND: The research group has found that the small molecule peptides of antler gum are rich in peptide chains that promote bone growth, proliferation and ossification of bone marrow mesenchymal stem cells. The specific mechanism and target of antler glue in the treatment of avascular necrosis of the femoral head are still unclear, which needs further studies.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of antler glue in the treatment of femoral head necrosis based on proteomics.
METHODS: Thirty-six female Wistar rats, SPF grade, were randomized into a blank group, a model group, and an antler glue group. The rats in the latter two groups were given retinoic acid 70 mg/kg once a day for 8 weeks to establish a rat model of femoral head necrosis, while the rats in the blank group were not treated. At 8 weeks after modeling, the rats in the antler glue group were given antler glue 0.35 g/kg, and those in the model and blank groups were given the same volume of 0.9% sodium chloride solution, once a day by gavage for 8 weeks. Pathological examination of bone tissue was used for verifying the successful modeling and the repair effect of antler glue on the femoral head. Non-standard (Label-free) proteome quantification technology was used to detect differential genes among groups. Biological function of differential proteins and signaling pathways involved were enriched based on GO and KEGG database analyses. STRING database was used to construct the target protein-protein interaction network diagram. The study protocol was approved by the Animal Experiment Ethics Committee of Shandong Academy of Traditional Chinese Medicine.
RESULTS AND CONCLUSION: The pathological sections of bone tissue showed that antler glue could effectively repair the necrotic femoral head. A total of 1 457 kinds of proteins were identified, including 353 kinds of common differential proteins between blank group and model group as well as between model group and antler glue group. In the model group, 97 kinds of differential proteins that increased or decreased showed a significant callback after intervention with antler glue. The mechanism of antler glue in the treatment of femoral head necrosis involves blood circulation, energy metabolism, inflammatory reaction and immune process. Protein disulfide isomerase (P4HB), cadherin 2 (CDH2), annexin A2 (ANXA2), proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9), milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFGE8), and bone morphogenetic protein may be important targets of antler glue. Antler glue may treat femoral head necrosis by regulating transforming growth factor β, glycolysis/gluconeogenesis, and PI3K-Akt signaling pathways.

Key words: antler glue, serum, proteomics, liquid chromatography-mass spectrometry, femoral head necrosis, differential protein, KEGG pathway analysis, transforming growth factor β

中图分类号:

胡亚楠, 王平, 杜海涛, 景田园, 王程程. 血清蛋白质组学技术发现鹿角胶治疗维甲酸致股骨头坏死模型大鼠的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2243-2251.

Hu Yanan, Wang Ping, Du Haitao, Jing Tianyuan, Wang Chengcheng. Mechanism by which antler glue treats avascular necrosis of the femoral head induced by retinoic acid in rats: a serum proteomics study[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(14): 2243-2251.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠36只，分为3组，每组10只进入结果分析。
2.2 大体观察及骨组织病理学检查结果 ①空白组正常大鼠饮食正常，状态活跃；股骨头骨质较硬，骨头表面光滑；病理组织观察可见股骨头内骨细胞整齐均匀、饱满清晰；②模型组大鼠食量减少，体质量明显下降，精神萎靡，出现跛脚现象；股骨头骨质变软易折，关节表面较为粗糙；病理组织观察可见骨陷窝空缺较多，骨细胞核碎裂，结缔组织增生，大量的骨髓细胞坏死，连接股骨头韧带远端可见坏死，同时伴有少量炎性细胞浸润，说明造模成功；③鹿角胶组大鼠造模期间体质量下降，出现跛脚现象，经鹿角胶灌胃后，食量明显增多，体质量增加，活动量增减，跛脚现象逐渐减轻，股骨头表面轻度凹陷，病理组织观察显示股骨头关节腔表面略有破损，少量骨髓细胞坏死，骨髓腔活跃增加，说明股骨头坏死现象有所改善，见图1。

2.3 蛋白质鉴定与差异蛋白统计实验共鉴定蛋白1 457种。其中模型组鉴定出1 060种蛋白，鹿角胶组993种。模型组与空白组相比，差异蛋白数量为707种，其中下调蛋白360种，上调蛋白347种；鹿角胶组与模型组比较，差异蛋白数量为518种，其中下调蛋白286种，上调蛋白232种，见图2。

空白组与模型组、模型组与鹿角胶组共同差异蛋白共有353个。在模型组升高或降低差异蛋白，经过鹿角胶干预后，明显回调的蛋白有97种，见表1，2。

2.4 差异蛋白GO分析结果依据相关生物学过程(biological process，BP)、细胞组成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)分类分析，选取前10个被显著富集的基因本体注释术语。空白组与模型组、模型组与鹿角多肽组比较差异蛋白GO分析，见图3，4。

其中BP涉及cellular process、biological regulation、response to stimulus、multicellular organismal process、metabolic process、localization、developmental process、immune system process、signaling等过程；CC包括cell、intracellular、protein-contaiing complex；MF涉及catalytic activity、molecular function regulator、structural molecule activity、molecular transducer activity、transporter activity等。
2.5 差异蛋白通路富集结果利用KEGG信息数据库对空白组、模型组和鹿角胶组差异蛋白涉及的通路进行分析，见图5，6。

模型组与正常组比较，主要富集通路包括补体和凝血级联、甘油磷脂代谢、卵母细胞减数分裂、坏死性凋亡、心肌细胞中的肾上腺素能信号、血小板活化、百日咳、白细胞介素17等通路。鹿角胶组与模型组主要富集通路包括糖酵解/糖异生、戊糖磷酸途径、PI3-Akt、花生四烯酸代谢、RAP1、破骨细胞分化、ECM-受体相互作用、细胞黏附分子、肌动蛋白细胞骨架的调控、转化生长因子β等通路。
2.6 共同差异蛋白互作网络分析为更好揭示鹿角胶干预股骨头坏死大鼠作用机制，对模型组vs.空白组、鹿角胶组vs.模型组共同涉及的回调蛋白做蛋白互作网络分析。
发现蛋白质二硫键异构酶(P4HB)、钙黏蛋白2(CDH2)、膜联蛋白A2(ANXA2)、枯草杆菌前蛋白转换酶/可信9型(PCSK9)、乳脂球-表皮生长因子8(MFGE8)、腱生蛋白(TNC)、层粘连蛋白亚基γ-1(LAMC1)、血管细胞黏附蛋白1(VCAM1)、转化生长因子β1蛋白(TGFB1)等连接度较高，分别为9，8，7，6，6，6，6，5，5，5，见图7。

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引言

股骨头坏死是由于骨折、髋部创伤或大量使用激素等原因导致股骨头血液循环发生障碍，造成骨细胞等死亡的一个病理过程[1]。股骨头坏死多发于中青年，目前全球已有超2 000万患者，其中中国约有810万，且男性患者明显高于女性，患病率逐年升高[2]，给患者及其家庭带来了严重的经济与心理负担，对社会经济发展的影响日益突出。股骨头坏死与中医典籍记载的骨痹、骨萎相似，属于痹病范畴，病因包括先天不足、后天失于濡养、烦劳过度、外邪侵袭等。中医治疗原则以补肝肾、强筋骨、养气血、通络止痛为主。在中医脏腑核心理论中，肾主藏精，其充在骨，肾与骨有着密切联系，《素问•生气通天论》言：“阳气者，精则养神，柔则养筋”。肾阳的温煦作用能够促进和激发精血津液化生和运行输布，使骨髓得充，筋骨得养。因此在中医药治疗中，以推动肾阳温煦作用来治疗股骨头坏死是一种有效的途径。
鹿角胶为鹿角经水煎煮、浓缩制成的固体胶，其性温，味甘咸，归肾、肝经，药用历史已有千年。鹿角始载于《神农本草经》，具有“益精血、强筋骨”作用。《本草纲目》言“鹿角胶，壮元阳，补血气，生精髓，暖筋骨之药也”。现代药理学研究表明，鹿角胶具有抗股骨头坏死、骨质疏松、肾虚腰脊冷痛及膝关节炎作用。课题组前期研究发现鹿角胶小分子肽富含促进骨生长的肽链，对骨髓间充质干细胞具有良好的促增殖、促成骨化作用，既可直接提供骨细胞生长所必需的营养成分，又兼具承载功能，能够促进骨细胞的存活与功能的建立[3-5]。但目前对鹿角胶防治股骨头坏死的研究仅停留在物质基础及药效学研究方面，对机制研究的较少，相关机制尚不明确。为了全面揭示鹿角胶对股骨头坏死的作用机制，作者应用蛋白质组学技术对维甲酸导致的股骨头坏死大鼠血清进行检测分析，以揭示其可能的作用靶点及其特点，并对于蛋白作用靶点进行分析。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2020年11月至2021年1月在山东省中医药研究院药理实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级雌性Wistar大鼠36只，体质量180-220 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK(鲁)20190003。饲养于山东省中医药研究院药理实验中心SPF级动物实验室，室温20-24 ℃，湿度45%-60%，12 h光照和12 h黑暗周期，标准动物饲料进行喂养，开展实验前所有大鼠先适应性饲养3 d。
1.3.2 鹿角胶的制备鹿角片购于国药乐仁堂河北药业有限公司，药品生产许可证号：冀20150051，生产批号：20081701，经山东省中医药研究院中药资源室林慧彬研究员鉴定为鹿科动物马鹿Cervus elaphus Linnaeus锯茸后翌年春季脱落的角基。按中国药典方法制备成鹿角胶[6]，冷冻干燥为鹿角胶冻干粉。
1.3.3 实验试剂维甲酸(山东良福制药有限公司，批准文号：国药准字H10970053，生产批号：200813)；胰蛋白酶(北京Promega生物技术有限公司，生产批号：Lot# 0000325797)；碳酸氢铵(生产批号：BCBG5031V)、尿素(生产批号：WXBD4821V)、二硫苏糖醇(生产批号：SLCD4701)、碘乙酰胺(生产批号：WXBC8963V)、高丰度蛋白去除试剂盒 Seppro ® Rat Spin Columns (生产批号：SLCF4477)均为上海Sigma-Aldrich贸易有限公司产品；BCA试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，生产批号：20200722)；体积分数4%中性甲醛固定液(南昌雨露实验器材有限公司，生产批号：190803)；5%硝酸脱钙液(北京吉美生物技术有限公司，生产批号：190315)。
1.3.4 实验仪器 KDM型控温电热套(鄄城华鲁电热仪器有限公司)；BP211D赛多利斯电子分析天平(德国赛多利斯公司)；HHS6数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；LGJ-10冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)；BDS200-PH倒置生物相差显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司)；DW-HL388超低温冷冻储存箱(中科美菱低温科技股份有限公司)；Allegra X-30R全能高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特公司)； EASY-nLC 1200超高液相色谱仪、OrbitrapExploris™480高分辨质谱仪(德国赛默飞世尔科技公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组采用随机数字表法将大鼠分为空白组、模型组、鹿角胶组3组，每组12只。

1.4.2 股骨头坏死大鼠模型制备维甲酸可造成股骨头中钙、锌、羟脯氨酸等成分比例性丢失，从而进一步导致其他有机质及无机质的相继丢失，使股骨头失养发生坏死[7]，因此实验采用灌胃维甲酸法制备股骨头坏死模型。模型制备方法参考课题组前期实验方法[8]，除空白组外，其余2组大鼠灌胃维甲酸 70 mg/kg，每日 1 次，连续灌胃8周，建立股骨头坏死模型；空白组为正常大鼠。

1.4.3 给药造模8周后开始给药，根据文献[9]的方法，鹿角胶组给予鹿角胶0.35 g/kg，模型组、空白组予同体积0.9%氯化钠溶液，每天灌胃1次，连续给药8周。
1.4.4 骨组织进行病理学检查经8周造模和8周给药后，采用戊巴比妥麻醉大鼠，取各组大鼠股骨头组织，经体积分数4%中性甲醛固定，5%硝酸脱钙液脱钙5 d，用大头针扎骨组织无阻力后，进行24 h清水冲洗，取材，脱水机脱水后，常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色，光镜下观察骨细胞及髓腔形态、结构和数量的变化以验证造模是否成功。
1.4.5 蛋白质鉴定与差异蛋白统计
(1)取材及样品制备：末次给药后禁食12 h，颈静脉取血，4 ℃放置30-45 min，4 ℃、1 300×g条件下离心10 min，取上清液于液氮中保存。
(2)检测酶解肽段：检测时将上述样品于4 ℃、12 000×g离心10 min，去除细胞碎片，上清液使用高丰度蛋白去除试剂盒 Seppro ® Rat Spin Columns 按照说明书去除高丰度蛋白。利用BCA 试剂盒进行蛋白浓度测定。各样品蛋白取等量胰蛋白酶进行酶解：用裂解液将体积调整至一致，再加入二硫苏糖醇(DTT)使其终浓度为5 mmol/L，56 ℃还原30 min。之后加入碘乙酰胺(IAA)使其终浓度为11 mmol/L，室温避光孵育15 min。将烷基化好的样本转移至超滤管，室温12 000×g离心20 min，用8 mol/L 尿素置换3次，再用置换buffer置换尿素3次，以蛋白酶∶蛋白1∶50的比例加入胰蛋白酶，酶解过夜。使用液相色谱-质谱联用分析仪对酶解所得的肽段进行检测，测结果导入相关数据库进行数据分析。
(3)生物信息学分析：所测试蛋白有效数据纳入标准：Score > 5，Count > 2，Variability< 50%。以差异表达量变化超过1.5作为显著上调的变化阈值，小于1/1.5作为显著下调的变化阈值[10]。将LC-MS采集的数据文件导入Proteome Discoverer中进行搜索，对蛋白质定量分析采用ProGroup算法。根据GO(http://www.geneontology.org/)和KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)数据库分析对差异蛋白的生物功能及参与的信号通路进行富集。为研究差异蛋白之间的相互作用关系，采用蛋白质互作STRING Database(https://string-db.org/)构建靶点蛋白相互作用图。
1.5 主要观察指标 ①差异表达蛋白分析；②差异蛋白GO功能富集分析；③差异蛋白KEGG信号通路分析；④靶点蛋白相互作用图(PPI)。
1.6 统计学分析采用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析。数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

股骨头坏死的高致残性和高增长率给无数家庭和社会造成巨大的负担。目前，西医治疗股骨头坏死以手术为主，术后不良反应较大，效果不十分理想，仅用于重症。随着近年来的发展，开发高效、低毒的治疗股骨头坏死新药成为国内外学者研发重点。鹿角胶在治疗股骨头坏死中取了得良好疗效，如YUN等[11]发现鹿角的主要成分鹿角多肽可通过EPK途径和部分PI3K/Akt途径促进细胞的增殖、分化与矿化。刘小元等[12]发现使用了负载有鹿角粉的3D打印支架可诱导骨缺损区修复重建及骨形成。课题组前期将鹿角胶负载于壳聚糖支架上发现，鹿角胶可有效改善骨细胞变性、坏死情况，激发成骨细胞生长，促进骨的形成[8]。目前对鹿角胶防治股骨头坏死机制研究较少，此次实验通过对大鼠血清总蛋白进行提取、酶切，采用生物信息技术对获得的数据进行分析，挖掘鹿角胶治疗股骨头坏死的靶点与通路，为鹿角胶的进一步应用提供基础。
鹿角胶干预的股骨头坏死大鼠血清蛋白质组学KEGG富集分析结果显示，鹿角胶可通过转化生长因子β信号通路、糖酵解/糖异生通路、PI3K-AKT信号通路、破骨细胞分化、肌动蛋白细胞骨架的调控等发挥作用。鹿角胶组与模型组相比，转化生长因子β信号通路中的丝裂原活化蛋白激酶1/3(MAPK1/3)、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A调节亚基A(PPP2R1)显著上调，转化生长因子β1、凝血酶反应蛋白1(THBS1)、潜伏转化生长因子β结合蛋白1(LTBP1)、神经细胞黏附蛋白(NEO1)显著下调。其中转化生长因子β1是关节软骨细胞的关键合成因子，可刺激软骨细胞释放细胞外基质分子[13]，通过抑制成骨细胞分泌破骨细胞分化因子受体激活剂核因子κB配体，从而限制破骨细胞的形成，间接促进基质的产生和成骨细胞向成骨细胞分化[14]，对维持成骨细胞和破骨细胞的动态平衡起重要作用。转化生长因子β1还可刺激软骨细胞合成成熟关节软骨中的Ⅱ型蛋白多糖和胶原等细胞外基质分子，导致关节软骨退化，破坏骨组织的动态平衡[13]。结果中，模型组/空白组转化生长因子β1含量升高，破骨细胞形成减少，使骨吸收减少，造成股骨头养分不足；同时促进了蛋白多糖的产生，导致骨组织滑膜和骨赘的异常生长，使股骨头内骨组织力学结构改变，引起股骨头坏死。鹿角胶干预后，转化生长因子β1含量降低，恢复骨吸收，优化骨平衡，促进了坏死股骨头的修复。骨形态发生蛋白信号通路同属转化生长因子β家族，骨形态发生蛋白是目前发现的唯一能够单独诱导间充质细胞向骨组织方向分化的生长因子，被认为是骨组织形成过程中最关键的调节因子。骨形态发生蛋白可促进骨髓间充质干细胞向软骨母细胞和成骨细胞的分化，促进骨损伤的修复[15]。课题组前期研究发现，骨形态发生蛋白7可更好地引导骨髓间充质干细胞成骨，鹿角胶联合基因转染可以增强大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力、黏附能力、分化成熟能力，增强碱性磷酸酶活性的表达和骨钙素合成能力，提高细胞整合素aspi的表达，从而介导细胞一细胞间的黏附和信号传递[16]。转化生长因子β具有活化剂的作用，可显著提高骨形态发生蛋白信号，而骨形态发生蛋白2也能抑制转化生长因子β的信号，二者相互作用，共同调节骨代谢。
糖酵解/糖异生通路是机体能量代谢的核心通路。糖酵解产生的大量中间代谢物，对各种生物合成途径至关重要。蛋白质组学结果提示，鹿角胶可能通过刺激糖酵解促进骨生成。成骨细胞可将大部分葡萄糖转化为乳酸盐，鹿角胶组中甘油磷酸盐的增高刺激了细胞的有氧糖酵解过程，为细胞的成骨分化提供大量能量。糖酵解过程是破骨细胞进行骨吸收的主要能量来源[17]，糖酵解速率的下降会导致Ⅰ型胶原蛋白的降解。转化生长因子β1可通过上调糖酵解的关键蛋白GLUT1和HKⅡ刺激关节软骨细胞进行糖酵解代谢，导致乳酸的分泌和葡萄糖的摄取均增加，同时不会影响细胞的氧化磷酸化过程[18]。而骨形态发生蛋白2可以明显促进线粒体氧化磷酸化代谢，对葡萄糖的摄取和糖酵解关键蛋白的表达无明显影响。鹿角胶可补益中气，故其可推动股骨头坏死部位的血液生成及运行，通行又兼补益，骨得以濡养则可助其恢复正常。但目前为止鹿角胶治疗股骨头坏死的研究大多着眼于对骨细胞的影响，对其能量代谢方面的研究几乎空白，值得进一步深究。
PI3K-AKT信号通路是细胞生长、代谢、分化、增殖、存活、血管生成、维持葡萄糖稳态的重要通路，能够抑制细胞凋亡。PI3K及其下游靶标在骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化过程中起重要作用，AKT2可以促进骨髓间充质干细胞从G0/G1期进入S期和G2/M期，刺激成骨细胞生长[19]。抑制PI3K-AKT信号通路可使破骨细胞内Ca2+浓度升高，导致细胞伪足收缩，破坏吸收骨架结构，从而抑制骨吸收。敲除Akt2基因也可影响糖酵解/糖异生通路，使机体发生糖代谢紊乱[20]。PI3K-AKT信号通路在鹿角胶干预后表现活跃，提示鹿角胶可通过激活PI3K-AKT信号通路来修复线粒体的结构和功能[21]，纠正糖代谢，重建细胞骨架，恢复细胞内外钙稳态。
转化生长因子β通路通过PI3K/AKT/mTOR/S6K1信号通路影响成骨细胞的生物活性[22]，转化生长因子β信号通路和PI3K-AKT信号通路均在糖代谢过程中起重要作用[23-24]，而糖酵解/糖异生通路为转化生长因子β信号通路和PI3K-AKT信号通路的正常运行提供能量。3条通路相互影响、相互协调，共同调节骨代谢，促进骨生成，见图8。

通过对回调的共同差异表达蛋白功能富集发现，蛋白质二硫键异构酶(P4HB)、钙黏蛋白2(CDH2)、膜联蛋白A2(ANXA2)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9型(PCSK9)、乳脂球-表皮生长因子8(MFGE8)等连接度较高。P4HB是编码脯氨酰4-羟化酶膜蛋白β亚基的蛋白编码基因，可改变细胞内外的蛋白质结构，在细胞黏附和细胞迁移中发挥重要作用。P4hb基因缺失可导致增加成纤维细胞中热休克蛋白47的表达升高，导致成骨细胞功能障碍，并导致骨形成缺陷和骨脆性[25]。此外，p4hb突变还会破坏Ⅰ型胶原三螺旋结构的形成，引发骨不全症[26]。P4HB可以从血液迁移到骨骼并分化成破骨细胞，破骨细胞在骨骼维持和体内平衡方面起着关键作用[27]。
与空白组相比，模型组P4HB表达升高了2.091倍，经鹿角胶干预后，P4HB水平在鹿角胶组已与空白组无明显差异，这表明鹿角胶可能通过P4HB调节细胞迁移和动态平衡而参与骨代谢。CDH2是一种介导细胞间黏附的膜糖蛋白，转化生长因子β通路中的细胞间相互作用就是依赖于CDH2进行的[28]，CDH2可通过改变细胞密度、表面物质的构成促进间充质干细胞分化，且可在胶原水凝胶微环境中促进软骨细胞分化，促进软骨缺损的修复[29]。在模型组中，ANXA2水平明显下降。ANXA2是钙依赖蛋白家族的成员，参与血管生成、离子通道激活和细胞间相互作用，可以通过与FOXQ1结合调节Wnt信号通路，促进间充质干细胞成骨分化[30]。ANXA2升高可减弱成骨细胞的生长，降低骨密度[31]。鹿角胶可能是通过调高ANXA2水平，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化来促进骨生成发挥作用的。TNC可通过细胞表面受体直接影响细胞形态，在创伤愈合条件下会重新表达，通过改变细胞微环境中的力学和生物学因素，TNC能调控细胞黏附，也可调控细胞信号放大和基因表达程序[32]。TNC不仅可以促进骨髓间充质干细胞的增殖，还可以促进runx2和sox-9的表达[33]。
另外PCSK9、MFGE8、TGFB1等多个与补血凝血相关的蛋白连接度也较高。PCSK9在调节血浆胆固醇动态平衡方面起着至关重要的作用[34]。PCSK9通过与低密度脂蛋白受体结合并促进其溶酶体降解来上调低密度脂蛋白胆固醇水平[35]，造成低密度脂蛋白的堆积，使其携带的胆固醇积存于血管壁上，血运受阻，股骨头失养而坏死。使用PCSK9抑制剂可有效降低关节炎患者的血脂紊乱和炎症情况[36]。MFGE8是间充质干细胞分泌的一种抗纤维化因子，可通过抑制转化生长因子β信号通路[37]、Actin Cytoskeleton 信号通路来影响骨生成[38]。MFGE8可间接下调破骨细胞的生成和骨丢失，抑制核因子κB受体活化因子配体诱导的破骨样细胞分化和功能，并可用于治疗抑制炎性骨丢失，是促进血管内皮细胞增殖和血管形成的活性因子之一，在机体损伤修复和血管重建的过程中扮演重要角色。药效学研究也证实了鹿角胶能明显提升凝血酶原时间及活化凝血活酶时间[39]，清除脑组织缺血损伤过程中产生的氧自由基[40]，改善缺血微环境，恢复凝血平衡。
综上所述，此次研究采用蛋白质组学技术分析了鹿角胶对股骨头坏死大鼠干预前后的蛋白质变化，对筛选出的差异表达的蛋白进行分析后发现，P4HB、CDH2、ANXA2、PCSK9、MFGE8、TNC、TGFB1等可能是鹿角胶的重要靶点，鹿角胶可能通过转化生长因子β、PI3K-ART、糖酵解/糖异生等重要信号通路改善骨代谢、调节血管生长来防治股骨头坏死，下一步将研究鹿角胶对转化生长因子β通路、血液循环、能量代谢的影响，阐明鹿角胶抗股骨头坏死的作用机制，揭示鹿角胶通过肾主骨理论“温煦”作用防治股骨头坏死的现代科学内涵。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

血清蛋白质组学技术发现鹿角胶治疗维甲酸致股骨头坏死模型大鼠的机制

Mechanism by which antler glue treats avascular necrosis of the femoral head induced by retinoic acid in rats: a serum proteomics study

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