转化生长因子β1及Ras同源基因家族成员A在软骨细胞分化过程中对细胞形态和细胞骨架的影响

doi:10.12307/2022.474

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (14): 2144-2149.doi: 10.12307/2022.474

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转化生长因子β1及Ras同源基因家族成员A在软骨细胞分化过程中对细胞形态和细胞骨架的影响

陈宇婷1，贺飞明1，向伟1，2，王超1，2，曹薇薇1，王维山2，刘伟1

1石河子大学医学院/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆维吾尔自治区石河子市 832000；2石河子大学医学院第一附属医院骨科中心，新疆维吾尔自治区石河子市 832000

收稿日期:2021-02-03 修回日期:2021-02-05 接受日期:2021-03-10 出版日期:2022-05-18 发布日期:2021-12-21
通讯作者: 刘伟，博士，副教授，石河子大学医学院/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆维吾尔自治区石河子市 832000
作者简介:陈宇婷，女，1996年生，福建省武夷山市人，汉族，石河子大学医学院在读硕士，主要从事细胞信号转导及细胞迁移的相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81460338)，项目负责人：刘伟

Effects of transforming growth factor beta1 and Ras homolog gene family member A on cell morphology and cytoskeleton during chondrocyte differentiation

Chen Yuting1, He Feiming1, Xiang Wei1, 2, Wang Chao1, 2, Cao Weiwei1, Wang Weishan2, Liu Wei1

1Shihezi University School of Medicine/Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Joint Surgery, First Affiliated Hospital, Shihezi University School of Medicine, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2021-02-03 Revised:2021-02-05 Accepted:2021-03-10 Online:2022-05-18 Published:2021-12-21
Contact: Liu Wei, MD, Associate professor, Shihezi University School of Medicine/Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Chen Yuting, Master candidate, Shihezi University School of Medicine/Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460338 (to LW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
转化生长因子β1：是来自转化生长因子β超家族中具有多种生物学功能的生长因子，可调节细胞生长、增殖和分化，参与骨组织基质中胶原蛋白和蛋白聚糖的生成，保持软骨细胞处在未分化的状态，抑制其终末肥大，能够保护和修复关节软骨、抑制骨关节炎的发生。
骨关节炎：是一种在中老年人群中常见的退化性关节疾病，主要表现为关节软骨的退化、软骨下骨硬化及骨质增生。

背景：骨关节炎的重要病理变化是关节软骨的退变，转化生长因子β1和Ras同源基因家族成员A分别在维持关节软骨稳态和骨关节炎的发生发展中起重要作用。
目的：探讨转化生长因子β1、Ras同源基因家族成员A在软骨细胞分化过程中对细胞形态、骨架及相关因子表达的影响，以及转化生长因子β1与Ras同源基因家族成员A、性别决定区Y框蛋白9之间的相互调控关系。
方法：外源性添加转化生长因子β1不同质量浓度、不同时间刺激ATDC5细胞，检测Ras同源基因家族成员A、性别决定区Y框蛋白9的蛋白表达情况；转化生长因子β1、LY-364947(一种有效的ATP竞争性转化生长因子β受体Ⅰ抑制剂)、溶血磷脂酸(Ras同源基因家族成员A激动剂)不同组合处理ATDC5细胞72 h，检测Ras同源基因家族成员A、性别决定区Y框蛋白9、转化生长因子β的蛋白表达情况，并观察细胞形态、细胞骨架的变化情况。
结果与结论：①随着转化生长因子β1作用质量浓度和时间的增加，Ras同源基因家族成员A、性别决定区Y框蛋白9蛋白表达水平显著升高(P < 0.001)；②相比空白对照组，溶血磷脂酸能够显著提高Ras同源基因家族成员A、性别决定区Y框蛋白9蛋白表达水平(P < 0.001)，但溶血磷脂酸对转化生长因子β的蛋白表达水平没有影响(P > 0.05)，转化生长因子β1+溶血磷脂酸处理细胞使Ras同源基因家族成员A、性别决定区Y框蛋白9和转化生长因子β的蛋白表达水平都显著升高(P < 0.001)，LY-364947使Ras同源基因家族成员A、性别决定区Y框蛋白9的蛋白表达水平降低(P < 0.001)，并且显著减弱了溶血磷脂酸对Ras同源基因家族成员A、性别决定区Y框蛋白9的激活作用(P < 0.001)；③相比未经处理的空白对照组，转化生长因子β1、溶血磷脂酸、转化生长因子β1+溶血磷脂酸处理ATDC5细胞后，细胞形态伸长、胞内肌动蛋白丝排列更加有序，聚集在细胞边缘的肌动蛋白丝增多，LY-364947使细胞形态变为多边形，肌动蛋白丝排列紊乱，细胞边缘的肌动蛋白丝减少；LY-364947+溶血磷脂酸对细胞形态和骨架的改变情况与LY-364947处理组有类似的结果；④提示在ATDC5细胞中，转化生长因子β1对Ras同源基因家族成员A、性别决定区Y框蛋白9的蛋白表达水平有浓度剂量和时间叠加作用，转化生长因子β1可能是Ras同源基因家族成员A、性别决定区Y框蛋白9的上游因子，转化生长因子β1通过调控Ras同源基因家族成员A、性别决定区Y框蛋白9的表达调节细胞骨架的功能，进而参与调节骨关节炎的发生发展过程。
缩略语：性别决定区Y框蛋白9：SRY related HMG box-9，SOX-9；Ras同源基因家族成员A：Ras homolog gene family member A，RhoA

https://orcid.org/0000-0001-9331-0654 (陈宇婷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 转化生长因子β1, RhoA, 性别决定区Y框蛋白9, 细胞骨架

Abstract: BACKGROUND: The important pathological change of osteoarthritis is the degeneration of articular cartilage. Transforming growth factor β1 and Ras homolog gene family member A play an important role in maintaining the stability of articular cartilage and the occurrence and development of osteoarthritis, respectively.
OBJECTIVE: To investigate the effects of transforming growth factor-β1 and Ras homolog gene family member A on chondrocyte morphology, cytoskeleton and expression of related factors during chondrocyte differentiation, and the mutual regulation relationship between transforming growth factor-β1, Ras homolog gene family member A and SRY related HMG box-9.
METHODS: Exogenous transforming growth factor β1 at different concentrations was added to stimulate ATDC5 cells to detect the protein expression of Ras homolog gene family member A and SRY related HMG box-9 at different times. Transforming growth factor-β1, LY-364947 (a potent ATP-competitive inhibitor of transforming growth factor-β receptor I) and lysophosphatidic acid (a Ras homolog gene family member A agonist) were used in different combinations to deal with ATDC5 cells for 72 hours. The protein expression levels of Ras homolog gene family member A, SRY related HMG box-9 and transforming growth factor-β were detected, and the changes in cell morphology and cytoskeleton were also observed.
RESULTS AND CONCLUSION: With the increase of transforming growth factor-β1 concentration and time, the expression levels of Ras homolog gene family member A and SRY related HMG box-9 proteins increased significantly (P < 0.001). Compared with the control group, lysophosphatidic acid significantly increased the expression levels of Ras homolog gene family member A and SRY related HMG box-9 protein (P < 0.001), but lysophosphatidic acid treatment had no effect on the protein expression level of transforming growth factor-β1 (P > 0.05). The combination of transforming growth factor-β1 and lysophosphatidic acid significantly increased the protein levels of transforming growth factor-β1, Ras homolog gene family member A, and SRY related HMG box-9 in the treated cells (P < 0.001). LY-364947 decreased the protein levels of RhoA and SRY related HMG box-9 (P < 0.001), and significantly reduced the activation effects of lysophosphatidic acid on Ras homolog gene family member A and SRY related HMG box-9 (P < 0.001). Compared with the control group, after treatment with transforming growth factor-β1, lysophosphatidic acid and their combination, the cell morphology was elongated, the intracellular actin filaments were arranged in a more orderly manner, and the number of actin filaments aggregated at the cell edge was increased. LY-364947 made the morphology of cells become polygonal, the arrangement of actin filaments was disordered, and the actin filaments at the edge of cells decreased. The changes in cell morphology and cytoskeleton by LY-364947+lysophosphatidic acid treatment were similar to those in the LY-364947 treatment group. Therefore, in ATDC5 cells, transforming growth factor-β1 has a superposition effect on Ras homolog gene family member A and SRY related HMG box-9 protein expression in concentration, dose and time. Transforming growth factor-β1 may be the upstream factor of Ras homolog gene family member A and SRY related HMG box-9, regulates the expression of Ras homolog gene family member A and SRY related HMG box-9 to regulate the function of cytoskeleton, and thus participates in the development and progression of osteoarthritis.

Key words: osteoarthritis, transforming growth factor-β1, Ras homolog gene family member A, SRY related HMG box-9, cytoskeleton

中图分类号:

陈宇婷, 贺飞明, 向伟, 王超, 曹薇薇, 王维山, 刘伟. 转化生长因子β1及Ras同源基因家族成员A在软骨细胞分化过程中对细胞形态和细胞骨架的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2144-2149.

Chen Yuting, He Feiming, Xiang Wei, Wang Chao, Cao Weiwei, Wang Weishan, Liu Wei . Effects of transforming growth factor beta1 and Ras homolog gene family member A on cell morphology and cytoskeleton during chondrocyte differentiation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(14): 2144-2149.

图/表（结果） 5

2.1 不同质量浓度转化生长因子β1处理对ATDC5细胞中RhoA、SOX9蛋白表达水平的影响为了探讨转化生长因子β1质量浓度与RhoA、SOX9蛋白表达水平之间的关系，采用不同质量浓度的转化生长因子β1(0，5，10，50，100 μg/L)处理ATDC5细胞72 h，检测RhoA和SOX9蛋白表达，见图1。

结果表明，与空白对照组(0 μg/L转化生长因子β1组)相比，随着转化生长因子β1质量浓度的增加，RhoA和SOX9的蛋白表达水平升高，在10，50和100 μg/L时，二者的蛋白表达水平都显著升高(P < 0.001)；结果提示，外源性转化生长因子β1能够激活RhoA、SOX9的表达，对二者的蛋白表达水平具有浓度剂量作用。
2.2 转化生长因子β1刺激不同时间对ATDC5细胞中RhoA、SOX9蛋白表达水平的影响为了探讨转化生长因子β1刺激ATDC5细胞不同时间与RhoA、SOX9蛋白表达之间的关系，采用10 μg/L的转化生长因子β1处理ATDC5细胞，分别在0，6，12，24，48，72 h收获细胞，检测RhoA、SOX9的蛋白表达，见图2。

结果显示，与对照组(处理0 h组)相比，随着转化生长因子β1作用时间的增加，RhoA和SOX9的蛋白表达水平增加；转化生长因子β1刺激细胞6，12，24，48，72 h，RhoA蛋白表达水平不断增高(P < 0.001)。除了转化生长因子β1刺激细胞6 h组的SOX9蛋白表达水平差异无显著性意义外，转化生长因子β1刺激细胞12，24，48，72 h组的SOX9蛋白表达水平不断增高(P < 0.001)。实验结果表明，转化生长因子β1持续刺激ATDC5细胞，能够提高RhoA、SOX9蛋白表达水平，转化生长因子β1对提高RhoA、SOX9蛋白表达水平具有一定的时间叠加作用。
2.3 不同外源因子处理对ATDC5细胞中转化生长因子β、RhoA、SOX9蛋白表达水平的影响为了探讨转化生长因子β1、RhoA、SOX9在ATDC5细胞中的相互调控关系，采用转化生长因子β1(10 μg/L)、LY-364947(10 μmol/L)、溶血磷脂酸(10 μmol/L)、转化生长因子β1(10 μg/L)+溶血磷脂酸(10 μmol/L)、LY-364947(10 μmol/L)+溶血磷脂酸(10 μmol/L)不同组合处理ATDC5细胞72 h，检测转化生长因子β、RhoA、SOX9蛋白表达水平的变化情况，见图3。

与空白对照组相比，外源性转化生长因子β1刺激细胞后，能够显著提高细胞内转化生长因子β、RhoA、SOX9和的蛋白表达水平(P < 0.001)；RhoA的激动剂溶血磷脂酸处理细胞后，细胞内RhoA和SOX9的蛋白表达水平显著增强(P < 0.001)，但转化生长因子β的蛋白表达水平没有明显变化(P > 0.05)；转化生长因子β1+溶血磷脂酸处理细胞后，转化生长因子β、RhoA和SOX9的蛋白表达水平都显著高于空白对照组(P < 0.001)。LY-364947阻断转化生长因子β信号通路后，转化生长因子β、RhoA和SOX9的蛋白表达水平相比空白对照组显著降低(P < 0.001)，LY-364947+溶血磷脂酸处理细胞后， LY-364947抑制了溶血磷脂酸对RhoA、SOX9的激活作用，使二者的蛋白表达水平低于空白对照组(P < 0.001)。实验结果表明，在ATDC5细胞的分化过程中，转化生长因子β1能够调控RhoA和SOX9的蛋白表达水平，可能是RhoA和SOX9的上游因子。
2.4 不同外源因子处理对ATDC5细胞形态和细胞骨架的影响为了探讨转化生长因子β1、RhoA、SOX9信号通路与细胞骨架之间的调节关系，采用转化生长因子β1(10 μg/L)、LY-364947(10 μmol/L)、溶血磷脂酸(10 μmol/L)、转化生长因子β1(10 μg/L)+ 溶血磷脂酸(10 μmol/L)、LY-364947(10 μmol/L)+溶血磷脂酸(10 μmol/L)不同组合处理ATDC5细胞72 h，观察各组细胞形态、肌动蛋白的分布与排列情况，见图4。

结果表明，与空白对照组相比，转化生长因子β1、溶血磷脂酸、转化生长因子β1+溶血磷脂酸刺激细胞后，细胞呈现多边形或梭形，细胞伸长更加明显，聚集在细胞边缘的有序排列的肌动蛋白丝数量增加。转化生长因子β1+溶血磷脂酸刺激细胞后，对细胞形态、肌动蛋白丝排列与分布的改变有叠加作用。与对照组相比，LY-364947刺激细胞后，细胞形态多为多边形，细胞伸长的特点变弱，伪足伸出减少，肌动蛋白丝排列紊乱，聚集在细胞边缘的肌动蛋白丝数量减少。LY-364947+溶血磷脂酸处理细胞后，对细胞形态和骨架的改变情况与LY-364947处理组有类似的结果，细胞形态为多边形，伸长变弱，伪足伸出减少，肌动蛋白丝的排列紊乱及聚集在细胞边缘的数量减少，表明LY-364947抑制了溶血磷脂酸对细胞形态及骨架的改变情况。细胞形态实验结果表明，转化生长因子β1、RhoA信号通路能够调节软骨细胞内肌动蛋白丝的排列与分布，转化生长因子β1、RhoA可能通过共同调节细胞骨架的功能，调控细胞极性，从而影响软骨细胞的分化、迁移。

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引言

骨关节炎是一种退化性关节疾病，在中老年人群中十分常见，主要表现为关节软骨的退化、软骨下骨硬化及骨质增生等，其发病率居全身关节疾病的首位，最终的致残率可达到53%[1]，骨关节炎患者的数量预计未来将大幅增加[2]。骨关节炎的具体发病机制目前还需深入研究，发病因素主要有软骨细胞被破坏、细胞外基质合成与降解受到阻碍。关节软骨的细胞外基质稳态主要靠软骨细胞来维持，关节软骨细胞功能丧失是导致骨关节炎发病的主要因素[3]。
转化生长因子β1是来自转化生长因子β超家族中的具有多种生物学功能的生长因子，可调节细胞生长、增殖和分化，参与骨组织基质中胶原蛋白和蛋白聚糖的生成，可保持软骨细胞处在未分化的状态，抑制其终末肥大，能够保护和修复关节软骨、抑制骨关节炎的发生[4]。近期研究表明，转化生长因子β1与骨关节炎病情严重程度存在相关性，轻中度组骨关节炎的转化生长因子β1水平高于重度组，KL分级与转化生长因子β1水平呈负相关[5]。Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family，member A，RhoA)属于Ras超家族，是RhoGTP酶中的经典成员，RhoGTP酶是肌动蛋白细胞骨架的最具特征的上游调节因子[6]。RhoA是早期软骨形成分化的重要调节因子，能够促进软骨细胞的增殖并抑制其肥大[7]，参与细胞骨架组织、细胞形态和软骨形成基因表达的调控[8]。
转录因子性别决定区Y框蛋白9(SRY related HMG box-9，SOX-9)是非组蛋白核蛋白高迁移率族超家族的成员，已被证明是软骨细胞形成所必需的，它可以直接调节软骨细胞外基质中胶原蛋白和蛋白聚糖的表达，并与相关基因一起直接调节Ⅱ型胶原蛋白基因的转录[9]。近期有研究表明，小鼠肥大性软骨细胞中靶向持续的SOX9表达会引起软骨稳态失衡，发生严重的自发性骨关节炎[10]。
有研究表明，转染转化生长因子β1到软骨细胞中能促进SOX9的mRNA表达，使软骨细胞变为梭形，聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白表达增加，而Ⅰ型胶原蛋白显著下降[11]。
在肥大软骨细胞中过表达SOX9的转基因小鼠，会发生严重的骨关节炎，使促进软骨生成的转化生长因子β的表达降低，破坏了软骨的稳态，引起骨关节炎的加速、自发发展。XU等[12]发现转化生长因子β1能够激活RhoA/ROCK通路的信号传导来诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化，同时伴有SOX9的表达量增加，在抑制了RhoA/ROCK信号通路后，该效应被抑制。
转化生长因子β1、RhoA、SOX9分别在骨关节炎的发生和发展中起重要作用，但在前软骨细胞系ATDC5细胞中三者是否存在相互调控作用目前未见公开文献报道。在此次研究中，前软骨细胞系ATDC5细胞被用作研究对象[13]，探讨转化生长因子β1对RhoA、SOX9是否存在调控关系，转化生长因子β1、RhoA在软骨细胞分化过程中对细胞形态、细胞骨架的影响，进而影响骨关节炎的发生和发展，这将有助于进一步揭示骨关节炎的具体分子机制，并为骨关节炎的临床防治提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞水平体外实验，配对样本t检验。
1.2 时间及地点于2020年1-10月在石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室完成。
1.3 材料 ATDC5细胞购于南京科佰生物科技有限公司；DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰酶购于GIBCO公司；FITC标记的鬼笔环肽、溶血磷脂酸(RhoA激动剂)购于Abcam公司；Triton X-100、抗荧光衰减封固剂、高效RIPA裂解液、DAPI溶液购于索莱宝；Recombinant Human 转化生长因子β1购于PEPROTECH公司；LY-364947(ATP竞争性的转化生长因子β受体Ⅰ抑制剂)购于MCE公司；预染的蛋白marker购于赛默飞公司。
1.4 方法
1.4.1 ATDC5细胞培养及外源性因子处理ATDC5细胞的步骤 ATDC5细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，添加100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素。当细胞融合度达到60%-70%时，在超净台内，先用PBS清洗细胞3次，加入2 mL预先在EP管中混匀的含有相应外源性因子的完全培养基(10 μg/L 转化生长因子β1、10 μmol/L LY-364947、10 μmol/L溶血磷脂酸、10 μg/L 转化生长因子β1+10 μmol/L 溶血磷脂酸、10 μmol/L LY-364947+10 μmol/L 溶血磷脂酸)，于培养箱(37 ℃，体积分数5%CO2)中培养。
1.4.2 ATDC5细胞肌动蛋白丝染色 ATDC5细胞爬片于12孔板中(2×104个/孔)，添加不同外源因子处理细胞72 h，在室温(23 ℃)下用40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min。加入含有1%Triton X-100的PBS孵育细胞5 min，然后每孔加入1×FITC标记的鬼笔环肽工作液100 μL，在室温下避光湿盒中孵育60 min，再加入DAPI溶液，室温避光湿盒中孵育5 min。最后用抗荧光衰减的封固剂封固，用倒置荧光显微镜在Ex/Em=493/517 nm处观察细胞肌动蛋白丝的染色情况。
1.4.3 Western blot 待检测的细胞用预冷PBS轻轻冲洗3次，用适量的高效RIPA裂解液提取细胞蛋白质。蛋白质用SDS-PAGE凝胶电泳90 min后，湿转到PVDF膜上，用含5% BSA的1×TBST在室温(23 ℃)下封闭膜2 h，加入一抗在4 ℃冰箱中孵育过夜(RhoA为1∶400，SOX9为1∶400，转化生长因子β为1∶1 000，β-actin为1∶1 500；转化生长因子β抗体来自Cell Signaling Technology公司，β-actin 抗体、RhoA抗体、SOX9抗体来自博士德)，TBST洗膜后，在室温下用二抗(山羊抗鼠及山羊抗兔IgG来自中杉金桥)孵育膜2 h，TBST洗膜4次。FluoChem HD-2成像仪采集蛋白条带，用图像处理软件ImageJ扫描条带灰度。
1.5 主要观察指标 ①Western blot检测不同质量浓度(0，5，10，50，100 μg/L)转化生长因子β1处理ATDC5细胞72 h后RhoA、SOX9的蛋白表达水平；②Western blot检测转化生长因子β1处理ATDC5细胞不同时间(0，6，12，24，48，72 h)后RhoA、SOX9的蛋白表达水平；③Western blot检测不同外源因子(10 μg/L转化生长因子β1、10 μmol/L LY-364947、10 μmol/L 溶血磷脂酸、10 μg/L转化生长因子β1+10 μmol/L 溶血磷脂酸、10 μmol/L LY-364947+10 μmol/L 溶血磷脂酸)处理ATDC5细胞72 h后转化生长因子β、RhoA、SOX9的蛋白表达水平；④倒置荧光显微镜观察不同外源因子处理ATDC5细胞72 h后细胞的形态及细胞骨架变化。
1.6 统计学分析至少进行3次独立实验，采用SPSS 25.0软件对数据进行统计学分析，两样本之间的比较采用配对样本t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎是关节退行性疾病，会导致关节软骨的逐渐丧失，对患者的生活质量产生严重影响[1]，目前其具体的发病机制还有待进一步研究。这种疾病通常与多种因素有关，如年龄、遗传、创伤和肥胖引起的生理过程失衡[14]。已有研究证明，关节软骨退变是导致骨关节炎的最直接原因，而软骨退变的本质为软骨细胞合成和降解之间的失衡[3]。
转化生长因子β1是一种关节软骨细胞的合成因子，由血小板、巨噬细胞和许多其他类型的细胞分泌，可以刺激软骨细胞释放细胞外基质，还通过影响破骨细胞生长来影响骨吸收和恢复[15]。研究表明，转化生长因子β1是骨关节炎患者滑液和血清炎症的相对独立指标，转化生长因子β1与骨关节炎存在相关性[16]。在骨性关节炎的早期，转化生长因子β的上调刺激软骨细胞的增殖，并试图修复受损的软骨[17]，但对于骨关节炎的晚期，转化生长因子β1水平显著降低，而炎性细胞因子(如白细胞介素1)的表达增加[18]。正常关节软骨中转化生长因子β1的沉默或转化生长因子β1信号通路的抑制可能导致软骨退化和蛋白多糖丢失[19]，将转化生长因子β1导入骨膜或关节腔可促进细胞外基质成分中的蛋白聚糖及胶原蛋白合成，并诱导软骨细胞分化和软骨形成[4，20]，当发生骨关节炎时，关节内转化生长因子β1基因过表达，可以增进关节软骨的修复，有效阻断兔骨关节炎的急性炎症反应[21]。在骨关节炎大鼠模型中上调转化生长因子β1的表达，可以防止软骨损伤，改善骨关节炎[4]。转化生长因子β1诱导ATDC5细胞12 d后，蛋白聚糖和胶原蛋白表达在细胞中上调，且有明显的时间依赖性，表明转化生长因子β1促进了ATDC5细分泌细胞外基质[22]。
RhoA作为RhoGTP酶中的经典成员，能调节细胞的生长分化以及细胞骨架，RhoA是早期软骨形成分化重要的调节因子，控制着细胞骨架、形态和软骨形成基因的表达，可以促进软骨细胞增殖并抑制其终末分化[7-8]。研究表明，SOX9可以反式激活软骨细胞特异性基质基因，并且可以直接调节软骨细胞增殖和成熟所必需的结缔组织生长因子[23]。人类SOX9单倍体功能不全会导致驼核发育不良，其特征是软骨内骨骼的全身性发育不良[24]。通过腺病毒转染转化生长因子β1到软骨细胞中，促进软骨生成基因SOX9的mRNA表达，并使软骨细胞形态变为梭形，聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白表达增加，而Ⅰ型胶原蛋白表达显著下降[11]。在肥大软骨细胞中过表达SOX9的转基因小鼠，会发生严重的骨关节炎，使促进软骨生成的转化生长因子β表达降低，破坏了软骨的稳态，引起骨关节炎的加速、自发发展。由此可提示，在骨关节炎的发生发展中，转化生长因子β与SOX9之间可能存在着相互调控关系，但在前软骨细胞ATDC5细胞中，转化生长因子β对SOX9的调控关系目前未见公开文献报道。此次研究结果表明，外源性添加转化生长因子β1对ATDC5细胞中SOX9的蛋白表达水平有浓度剂量和时间叠加作用，使细胞伸长，肌动蛋白丝染色增强且有序排列的肌动蛋白丝增多，阻止转化生长因子β信号通路传递使SOX9的蛋白表达水平下降，细胞伪足减少，肌动蛋白丝排列紊乱，可知在软骨细胞的分化过程中，转化生长因子β1可能是SOX9的上游因子，转化生长因子β1可以使ATDC5细胞的极性增加。
有研究表明，抑制RhoA/ROCK信号有效地减少了关节软骨的退化，有利于关节软骨的维护和修复[25]。类似的，骨关节炎患者的关节软骨中，RhoA/ROCK途径可以被瘦素激活导致细胞的微丝骨架改变，促使关节软骨发生退化[26]。WOODS等[27]研究表明，RhoA的过度表达能抑制ATDC5细胞中蛋白聚糖及胶原蛋白的表达。此次研究结果显示，激活 RhoA使ATDC5细胞中SOX9的蛋白表达水平增加、细胞伸长，肌动蛋白丝染色增强且有序排列的肌动蛋白丝增多，可知激活RhoA可以使ATDC5细胞的极性增加，与DENG等[7，28]的研究结果一致。XU等[12]发现转化生长因子β1能够激活RhoA/ROCK通路的信号传导来诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化，同时伴有SOX9的表达量增加，在抑制了RhoA/ROCK信号通路后，转化生长因子β1诱导的细胞骨架被中断，软骨细胞特异性基因表达下调，提示在ATDC5细胞骨架的构建过程中，转化生长因子β1可能通过RhoA、SOX9相关的通路对细胞骨架网络构建产生一定的影响，具体的影响过程还有待进一步研究。
转化生长因子β1、RhoA和SOX9都在维持关节软骨内环境稳态中发挥着作用，此次研究初步提示，在前软骨细胞系ATDC5细胞中，转化生长因子β1对RhoA和SOX9的蛋白表达水平有浓度剂量和时间叠加作用，转化生长因子β1可能为RhoA和SOX9的上游调节因子，转化生长因子β1和RhoA可使ATDC5细胞极性增强，可能通过促进软骨细胞的运动来维持关节软骨内环境的稳态。这将有助于进一步揭示骨关节炎具体的发病分子机制，并为骨关节炎的临床防治提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

转化生长因子β1及Ras同源基因家族成员A在软骨细胞分化过程中对细胞形态和细胞骨架的影响

Effects of transforming growth factor beta1 and Ras homolog gene family member A on cell morphology and cytoskeleton during chondrocyte differentiation

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