C-X-C趋化因子受体4拮抗剂延缓豚鼠关节软骨的退变

doi:10.12307/2022.475

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (14): 2150-2154.doi: 10.12307/2022.475

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C-X-C趋化因子受体4拮抗剂延缓豚鼠关节软骨的退变

何璐，李彦林，蒙旭晗，王国梁，杨腾云，廖欣宇，周晓翔，杨光

昆明医科大学第一附属医院运动医学科，云南省昆明市 650032

收稿日期:2021-03-02 修回日期:2021-03-10 接受日期:2021-04-15 出版日期:2022-05-18 发布日期:2021-12-21
通讯作者: 李彦林，博士，教授，博士生导师，昆明医科大学第一附属医院，云南省昆明市 650032
作者简介:何璐，男，1993年生，河南省周口市人，汉族，昆明医科大学在读硕士，主要从事骨与骨关节损伤的修复与重建研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81760403，81960409)，项目负责人：李彦林；云南省医学领军人才项目(L-201601)，项目负责人：李彦林；云南省陈世益专家工作站项目(2018IC102)，项目负责人：李彦林；云南省骨关节疾病临床医学中心项目(ZX2019-03-04)，项目负责人：李彦林

C-X-C chemokine receptor type 4 antagonist delays the degeneration of articular cartilage in guinea pigs

He Lu, Li Yanlin, Meng Xuhan, Wang Guoliang, Yang Tengyun, Liao Xinyu, Zhou Xiaoxiang, Yang Guang

Department of Sports Medicine, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Received:2021-03-02 Revised:2021-03-10 Accepted:2021-04-15 Online:2022-05-18 Published:2021-12-21
Contact: Li Yanlin, MD, Professor, Doctoral supervisor, Department of Sports Medicine, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:He Lu, Master candidate, Department of Sports Medicine, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81760403 and 81960409 (to LYL); Yunnan Provincial Medical Leading Talents Project, No. L-201601 (to LYL); Chen Shiyi Expert Workstation Project in Yunnan Province, No. 2018IC102 (to LYL); Yunnan Provincial Bone and Joint Disease Clinical Medicine Center Project, No. ZX2019-03-04 (to LYL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
基质细胞衍生因子1/C-X-C趋化因子受体4：C-X-C趋化因子受体4是基质细胞衍生因子1的特异性受体。在骨关节炎的发生发展中，滑膜产生基质细胞衍生因子1，其C-X-C趋化因子受体4优先在关节软骨细胞中表达，基质细胞衍生因子1和C-X-C趋化因子受体4之间存在互补的表达模式，二者结合后可以激活细胞外信号调节酶(Erk)和相关激酶(p38 MAP激酶)信号通路，并诱导软骨细胞释放炎症因子和基质金属蛋白酶，调节骨性关节炎软骨细胞的分解代谢，导致细胞外基质降解。
C-X-C趋化因子受体4拮抗剂：C-X-C趋化因子受体4是一种位于软骨细胞表面的G蛋白偶联受体，其通过与基质细胞衍生因子1结合诱导基质金属蛋白酶从细胞外基质释放，从而加剧骨关节炎。C-X-C趋化因子受体4拮抗剂可以增强免疫细胞的细胞毒活性，具有高水平的抗人类免疫缺陷病毒(HIV)活性作用，常见的有TN14003、T140、AMD3100等，其可以通过抑制骨关节炎滑膜细胞和滑液中基质细胞衍生因子水平，阻断基质细胞衍生因子1/C-X-C趋化因子受体4信号通路，减少关节软骨细胞中基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶13的释放，从而减轻软骨退变。

背景：近年来研究表明基质细胞衍生因子1/C-X-C趋化因子受体4信号通路在骨关节炎的发生发展中起重要作用。
目的：探讨不同C-X-C趋化因子受体4拮抗剂在体内对关节软骨退变的作用。
方法：选取96只6月龄雄性Hartley豚鼠随机分成4组，TN14003治疗组、T140治疗组、AMD3100治疗组、空白对照组，每组24只。除空白对照组不做任何处理外，其余治疗组均使用Alzet微量泵直接植入并固定于豚鼠背部皮下，每天以180 mg/L的质量浓度泵入TN14003、T140、AMD3100药物，干预12周后，取膝关节软骨行苏木精-伊红染色、番红-固绿染色、改良Mankin组织学评分；免疫组织化学检测白细胞介素1和肿瘤坏死因子α的表达水平。
结果与结论：①苏木精-伊红染色、番红-固绿染色显示：TN14003治疗组显著延缓了软骨退变程度，Mankin评分最高；T140治疗组次之，AMD3100治疗组较差，空白对照组最差；各组Mankin评分差异有显著性意义(P < 0.05)；②免疫组织化学染色分析显示：各治疗组关节软骨组织中白细胞介素1和肿瘤坏死因子α阳性表达均低于空白对照组，其中以TN14003治疗组最少(P < 0.05)；③结果表明，3种C-X-C趋化因子受体4拮抗剂均可通过阻断基质细胞衍生因子1/C-X-C趋化因子受体4信号通路，降低白细胞介素1和肿瘤坏死因子α的表达水平，延缓软骨退变，其中TN14003治疗组效果最优。
缩略语：基质细胞衍生因子1：stromal cell-derived factor-1，SDF-1；C-X-C趋化因子受体4：C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4

https://orcid.org/0000-0001-6207-1996 (何璐)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, SDF-1, CXCR4, 信号通路, CXCR4受体拮抗剂, 软骨退变, 豚鼠

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that the stromal cell-derived factor 1/C-X-C chemokine receptor type 4 signaling pathway plays an important role in the occurrence and development of osteoarthritis.
OBJECTIVE: To explore the effect of C-X-C chemokine receptor type 4 antagonist on the degeneration of articular cartilage in vivo.
METHODS: Ninety-six 6-month-old male Hartley guinea pigs were randomly divided into four groups, namely, TN14003 treatment, T140 treatment, AMD3100 treatment group, and blank control group (n=24 per group). Except for the blank control group without any treatment, in the rest three groups, Alzet micro-pumps were directly implanted and fixed under the skin of the back of the guinea pigs, followed by daily injection of TN14003, T140, and AMD3100 drugs at a concentration of 180 mg/L, respectively. After 12 weeks of interventions, the articular cartilage of the knee joint was taken out from guinea pigs for hematoxylin-eosin staining, Safranin-fast green staining, and modified Mankin histological scoring. Immunohistochemical staining was used to detect the expression levels of interleukin-1 and tumor necrosis factor-α.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining and Safranin-fast green staining showed that the degree of cartilage degeneration in the TN14003 treatment group was significantly delayed, with the highest Mankin score, followed by T140 treatment group, AMD3100 group and blank control group in turn. There were significant differences in the Mankin scores between the experimental groups (P < 0.05). The results of immunohistochemical staining analysis showed that the positive expression of interleukin-1 and tumor necrosis factor-α in each experimental group was lower than that of the blank control group, among which the expression was lowest in the TN14003 treatment group (P < 0.05). To conclude, these three kinds of C-X-C chemokine receptor type 4 antagonists can all block the stromal cell-derived factor 1/C-X-C chemokine receptor type 4 signaling pathway in vivo, reduce the expression levels of interleukin-1 and tumor necrosis factor-α, and delay cartilage degeneration, among which TN14003 has the best effects.

Key words: osteoarthritis, stromal cell-derived factor 1, C-X-C chemokine receptor type 4, signaling pathway, C-X-C chemokine receptor 4 antagonist, cartilage degeneration, guinea pig

中图分类号:

何璐, 李彦林, 蒙旭晗, 王国梁, 杨腾云, 廖欣宇, 周晓翔, 杨光. C-X-C趋化因子受体4拮抗剂延缓豚鼠关节软骨的退变[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2150-2154.

He Lu, Li Yanlin, Meng Xuhan, Wang Guoliang, Yang Tengyun, Liao Xinyu, Zhou Xiaoxiang, Yang Guang. C-X-C chemokine receptor type 4 antagonist delays the degeneration of articular cartilage in guinea pigs[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(14): 2150-2154.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析选取96只6月龄雄性Hartley豚鼠，实验过程中无死亡，全部纳入结果分析。实验过程中观察TN14003治疗组动物行走无跛行和后肢伸展情况良好，T140治疗组次之，AMD3100治疗组较差，空白对照组最差。
2.2 苏木精-伊红染色结果 TN14003治疗组仅有轻微的骨关节炎改变，关节软骨较光滑，有较致密的软骨细胞外基质，软骨细胞分布密集，关节软骨表面无明显损伤、结构断裂，无软骨水肿、退变的病理改变，空骨陷窝较少，无纤维化；T140治疗组及AMD3100治疗组软骨损伤程度均较TN14003治疗组稍严重，较空白对照组明显减轻；空白对照组可见有严重的骨关节炎软骨损伤，软骨面明显变薄，表层软骨细胞脱落、排列紊乱无序，细胞核染色不均匀，细胞数量少，含少量的松质骨，空骨陷窝较多，可见明显纤维化，见图2。

2.3 番红-固绿染色结果 TN14003治疗组关节软骨厚度显著增加，软骨表面无明显破坏，软骨细胞无明显减少，蛋白多糖丢失减少，软骨损伤改善；T140治疗组及AMD3100治疗组骨关节炎软骨损伤程度均较TN14003治疗组稍加重，较空白对照组明显减轻；空白对照组软骨平面和基质结构不平整，细胞核染色不均匀，染色较淡，蛋白多糖含量明显降低，细胞排列无序。结果可见，TN14003治疗组仅有轻微的骨关节炎软骨退变，空白对照组软骨退变最明显，见图3。

2.4 改良Mankin组织学评分各组豚鼠软骨组织的改良Mankin组织学评分：TN14003治疗组为3.16±0.65，T140治疗组为5.47±0.50，AMD3100治疗组为7.17±0.32，空白对照组为12.40±0.75。TN14003治疗组评分最低，软骨损伤明显减轻，空白对照组评分最高，软骨损伤程度最严重，两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.5 免疫组织化学法检测白细胞介素1、肿瘤坏死因子α表达与TN14003治疗组相比，其余各组豚鼠软骨组织中白细胞介素1(F=98.014)、肿瘤坏死因子α(F=74.027)的表达明显增多，其中空白对照组高于AMD3100治疗组，AMD3100治疗组高于T140治疗组，两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

TN14003治疗组关节软骨侵蚀明显减轻，白细胞介素1、肿瘤坏死因子α阳性细胞表达数量少，软骨细胞分布致密，线粒体无肿胀，细胞外基质增加；相比TN14003治疗组，T140治疗组及AMD3100治疗组软骨结构较完整，白细胞介素1、肿瘤坏死因子α阳性细胞表达数量较多；空白对照组关节软骨侵蚀严重，白细胞介素1、肿瘤坏死因子α阳性细胞表达数量多，线粒体肿胀，空泡变性，见图4，图5。

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2017年2月至2018年2月在昆明医科大学基础医学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 96只6月龄雄性Hartley豚鼠，体质量(400±50) g，购于昆明医科大学实验动物学部，许可证编号：SCXK(滇)K2020-0006。所有动物饲养于昆明医科大学动物实验中心，该实验经昆明医科大学动物实验伦理委员会批准，批准文号为kmmu2021420。
1.3.2 实验试剂与仪器病理切片机(RM2135，Leica公司，德国)；普通光镜(E200，NIKON公司，日本)；苏木精-伊红染色、番红-固绿染色试剂盒(广州展晨公司，中国)；石蜡(上海华灵康复器械厂，中国)；显微摄影系统(DM4000B， Leica公司，德国)；Alzet微量泵(上海普迈生物科技有限公司，中国)；T140冻干粉、TN14003冻干粉、AMD3100冻干粉(北京中科亚光公司，中国)；兔抗豚鼠白细胞介素1抗体、豚鼠抗肿瘤坏死因子α多克隆抗体(Abcom公司，英国)。
1.4 实验方法
1.4.1 建立实验动物模型 96只6月龄雄性Hartley豚鼠随机分成4组：TN14003治疗组、T140治疗组、AMD3100治疗组、空白对照组，每组24只。除空白对照组不做任何处理外，其余治疗组均使用Alzet微量泵直接植入并固定于豚鼠背部皮下，每天以180 mg/L的质量浓度泵入TN14003、T140、AMD3100药物，每天泵入1 mL，共给药治疗12周，见图1。

1.4.2 实验动物取材与制片治疗12周后，采用戊巴比妥钠腹腔注射法处死全部实验动物，取双膝关节软骨组织，裁剪为大小约1 mm×3 mm×3 mm的组织块，多聚甲醛溶液中固定24 h，梯度乙醇脱水，对组织块进行透明和浸蜡包埋、塑形和切片；切片后置于清洁载玻片上进行苏木精-伊红染色、番红-固绿染色和封固，观察组织内部的软骨细胞改变。
1.4.3 改良Mankin组织学评分采用改良Mankin组织学评分对苏木精-伊红染色、番红-固绿染色切片的骨关节炎软骨病变严重程度进行组织病理学分级。改良Mankin 评分分值与骨关节炎严重程度的组织病理学分级直接相关，分值越高，表示软骨退变程度越严重。0分代表软骨正常，14分代表最严重的软骨病变。
1.4.4 免疫组织化学染色治疗12周后，将1.4.2中动物取材获得的软骨组织切成20 μm厚切片，置于PBS漂洗；在体积分数为3%过氧化氢溶液中孵育30 min，再次PBS漂洗；体积分数为5%羊血清37 ℃孵育30 min，加入兔抗豚鼠白细胞介素1抗体、豚鼠抗肿瘤坏死因子α多克隆抗体4 ℃孵育过夜，二氨基联苯胺显色，乙醇脱水，二甲苯透明，封固。每张切片随机观察多个视野进行图像分析，统计分析白细胞介素1和肿瘤坏死因子α阳性细胞表达数。
1.5 主要观察指标 ①苏木精-伊红染色、番红-固绿染色观察软骨细胞的变性和分布情况；②Mankin组织学评分标准评估软骨退化情况；③免疫组织化学染色观察Hartley豚鼠膝关节软骨组织中白细胞介素1和肿瘤坏死因子α的阳性细胞表达率。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析，所有数据均用x±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准 α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

作为一种促炎趋化因子，SDF-1与特异性G蛋白偶联受体CXCR4结合调节细胞运输和黏附[4，14]。研究表明，滑膜中的SDF-1与软骨细胞中的CXCR4结合，通过促进软骨细胞中转化生长因子β受体Ⅰ由激活素受体样激酶5向激活素受体样激酶1的转化，诱导关节软骨降解[15-17]。课题组前期研究发现，SDF-1/CXCR4信号通路通过释放基质金属蛋白酶13直接诱导骨关节炎软骨外基质降解，软骨外基质的完整性被破坏，直接降低了软骨的力学性能，并可能在骨关节炎的进展中起到加速作用；通过加入CXCR4拮抗剂可以阻断SDF-1/CXCR4信号通路，进而抑制其对软骨外基质的破坏[18-21]。
目前常见的特异性CXCR4拮抗剂有TN14003、T140、AMD3100等，它们在许多疾病治疗中发挥着广泛的作用。AMD3100目前已被广泛应用于治疗骨关节炎疾病的大量基础研究[10]。作为一种特异性的CXCR4拮抗剂，AMD3100通过阻断SDF-1/CXCR4信号通路，显著降低血清中基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13和SDF-1水平，减轻了基质金属蛋白激酶对软骨外基质的刺激作用，进而减轻豚鼠原发性关节炎的严重程度[11-13]。研究表明T140是一种14个残基的肽，对人类免疫缺陷病毒活性具有很高的拮抗作用，通过阻断SDF-1/CXCR4信号通路，降低软骨组织中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的降解，减轻骨关节炎疾病模型中软骨组织的退变[22]。TN14003是基于T140设计的，TN14003是通过酰胺化T140的COOH末端并用非碱性极性氨基酸取代碱性残基来降低分子的总正电荷而产生的，TN14003在细胞毒性和稳定性方面明显优于T140[8]。
该实验通过对关节软骨组织进行苏木精-伊红染色、番红-固绿染色，结果显示TN14003治疗组仅有轻微的骨关节炎改变，关节软骨的基本结构完整，有较致密的软骨细胞外基质，软骨细胞分布密集，关节软骨表面无明显损伤、结构断裂，无软骨水肿、退变的病理改变；空骨陷窝较少，无纤维化。T140治疗组及AMD3100治疗组的软骨损伤程度均较TN14003治疗组稍加重，较空白对照组明显减轻。空白对照组可见明显的软骨损伤，软骨退变最为显著，软骨面明显变薄，表层软骨细胞脱落、排列紊乱无序，细胞核染色不均匀，含少量的松质骨，空骨陷窝较多，可见明显纤维化。通过Mankin组织学评分评估软骨损伤严重程度，空白对照组Mankin评分最高，其次是AMD3100治疗组和T140组，TN14003治疗组Mankin评分最低。实验结果表明，3种 CXCR4受体拮抗剂均可在体内阻断SDF-1/CXCR4信号通路，减轻豚鼠原发性骨关节炎的严重程度，其中TN14003组的治疗效果明显优于其他组。
众所周知，炎性细胞因子参与了骨关节炎的发生和发展。在这些细胞因子中，白细胞介素1和肿瘤坏死因子α通过刺激基质金属蛋白酶和各种炎性细胞因子的释放，如一氧化氮、前列腺素E2和环氧合酶2等，抑制聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成，在骨关节炎软骨细胞外基质的降解中起关键作用[23-26]。该实验采用免疫组织化学法观察关节软骨组织中白细胞介素1、肿瘤坏死因子α的表达，结果可见TN14003治疗组关节软骨侵蚀明显减轻，软骨细胞分布致密，线粒体无肿胀，细胞外基质增加；T140治疗组及AMD3100治疗组软骨结构较完整，阳性细胞表达数量多于TN14003治疗组；空白对照组关节软骨侵蚀严重，软骨细胞阳性表达率多，线粒体肿胀，空泡变性，结果提示3种 CXCR4受体拮抗剂均可在体内阻断SDF-1/CXCR4信号通路，降低滑液中白细胞介素1和肿瘤坏死因子α的表达水平，其中TN14003治疗组的白细胞介素1和肿瘤坏死因子α表达水平低于其他组。
此次实验选择Hartley豚鼠作为自发性骨性关节炎动物模型，与人类骨关节炎的病理进展存在差异性；实验治疗时间短，未能进行不同时间段的治疗效果比较。因此，进一步工作应该选取小型猪或猴子作为实验动物模型，进行不同时间段的治疗研究，用以验证不同CXCR4拮抗剂对骨关节炎病理进展的延缓作用。
综上所述，CXCR4拮抗剂AMD3100、T140和TN14003均可通过与CXCR4竞争其配体SDF-1，使SDF-1/CXCR4信号通路失活，降低滑液中白细胞介素1和肿瘤坏死因子α的表达水平，抑制软骨细胞凋亡，减少软骨基质降解，从而减轻骨关节炎的病理改变；但AMD3100和T140对骨关节炎的治疗效果有限，TN14003的治疗效果明显优于AMD3100和T140，该实验对未来研究骨关节炎治疗的最佳候选药物提供了实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

C-X-C趋化因子受体4拮抗剂延缓豚鼠关节软骨的退变

C-X-C chemokine receptor type 4 antagonist delays the degeneration of articular cartilage in guinea pigs

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本文评价

[1]	张吉超, 董跃福, 牟志芳, 张震, 李冰言, 徐祥钧, 李佳意, 任梦, 董万鹏. 骨关节炎患者在不同步态角度下膝关节内部生物力学变化的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1357-1361.
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[4]	高俞锦, 彭双麟, 马治超, 陆诗, 曹花月, 王浪, 肖金刚. 糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 999-1004.
[5]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
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[15]	娜日松, 孙亮, 赵振群, 梁戎, 王鑫. miR-26b调控脂肪酸结合蛋白4介导脂肪细胞分化的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 260-265.