MiR-106b-5p调控老年骨质疏松性骨折的分子网络

doi:10.12307/2022.039

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (2): 239-244.doi: 10.12307/2022.039

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MiR-106b-5p调控老年骨质疏松性骨折的分子网络

王海龙1，李龙1，伊力哈木·托合提1，刘旭2，那次克道尔吉2，陈洪涛2，崔泳3

1新疆医科大学第七附属医院骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；2 新疆医科大学第六附属医院运动损伤科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830010；3新疆医科大学第五附属医院骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011

收稿日期:2020-09-28 修回日期:2020-09-30 接受日期:2020-12-09 出版日期:2022-01-18 发布日期:2021-10-27
通讯作者: 崔泳，新疆医科大学第五附属医院骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
作者简介:王海龙，新疆医科大学第七附属医院骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2017D01C276)，项目负责人：崔泳

Molecular network of miR-106b-5p regulating osteoporotic fracture in the elderly

Wang Hailong1, Li Long1, Yilihamu Tuoheti1, Liu Xu2, Nacikedaoerji2, Chen Hongtao2, Cui Yong3

1Department of Orthopedics, the Seventh Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Sports Injury, the Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830010, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Department of Orthopedics, the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2020-09-28 Revised:2020-09-30 Accepted:2020-12-09 Online:2022-01-18 Published:2021-10-27
Contact: Cui Yong, Department of Orthopedics, the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Wang Hailong, Department of Orthopedics, the Seventh Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2017D01C276 (to CY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
老年骨质疏松性骨折：骨质疏松症是最常见的全身性和代谢性骨骼疾病，骨质疏松性骨折是继发于骨质疏松症、低能量暴力导致的骨折。伴随中国进入老年社会，骨质疏松性骨折发病率逐年快速升高，逐渐成为骨质疏松症患者的首发症状和就诊原因。
MicroRNAs：MicroRNAs在多种生物功能中的关键调节作用是一个成熟的概念，其与多种生理和病理条件的关系也在推动MicroRNAs作为生物标志物的临床应用。MicroRNAs的识别应该是骨质疏松性骨折的诊断学和治疗学中向前迈出的重要一步。新的生物标记物对于改善骨质疏松性骨折患者的治疗是可取的。
背景：骨质疏松性骨折是与年龄有关的疾病，由于人口老龄化，其发病率和患病率不断上升。
目的：鉴定miRNA与老年骨质疏松性骨折有关。
方法：通过limma包分析GSE93883中骨质疏松性骨折相关的差异表达miRNA；通过RAID数据库预测差异表达miRNA的靶标基因，并通过PPI(蛋白质-蛋白质相互作用)网络识别关键miRNA及靶标基因；富集分析识别靶标基因参与的生物功能和信号通路。最后，收集5例老年骨质疏松性骨折和5例老年非骨质疏松性骨折患者的骨组织，利用qPCR和Western blot验证关键miRNA及信号通路。
结果与结论：①共获得21个骨质疏松性骨折相关的差异表达miRNA并预测得到530个靶标基因；通过PPI网络鉴定miR-106b-5p为关键调控基因，其靶标基因主要与MAPK活性的激活等生物功能以及PI3K-Akt和转化生长因子β信号通路相关；②qPCR结果验证了miR-106b-5p在老年骨质疏松性骨折骨组织中的表达较对照骨组织显著下调(P < 0.05)；Western blot结果显示PI3K-Akt和转化生长因子β信号通路在老年骨质疏松性骨折中被激活；③提示：miRNA参与老年骨质疏松性骨折，并与PI3K-Akt和转化生长因子β信号通路相关。miR-106b-5p可能抑制骨质疏松性骨折的发生，并成为潜在的标志物和治疗靶标。

https://orcid.org/0000-0001-5670-4718 (崔泳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨质疏松性骨折, miR-106b-5p, PI3K-Akt, 转化生长因子β, 差异表达

Abstract: BACKGROUND: Osteoporotic fractures are age-related diseases, with increasing incidence and prevalence due to the aging population.
OBJECTIVE: To identify whether miRNA is associated with osteoporotic fracture.
METHODS: The differential expression of miRNA (DEM) related to osteoporotic fracture in GSE93883 was analyzed by limma package. The target genes of differentially expressed miRNA were predicted by RAID database, and the key miRNAs and target genes were identified by protein-protein interaction network. Enrichment analysis identified the biological functions and signaling pathways involved in target genes. Finally, qPCR and western blot were used to verify the key miRNAs and signal pathways in bone tissue of five elderly patients with osteoporotic fractures and five elderly patients with non-osteoporotic fractures.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 21 differentially expressed miRNAs related to osteoporotic fracture were obtained and 530 target genes were predicted. MiR-106b-5p was identified as a key regulatory gene by protein-protein interaction network. The target genes were mainly related to the activation of MAPK activity, PI3K-Akt signaling pathway and transforming growth factor β signaling pathway. In addition, qPCR results confirmed significant downregulation of miR-106b-5p in elderly osteoporotic fracture (P < 0.05). Western blot results showed that PI3K-Akt and transforming growth factor β signaling pathways were significantly activated in elderly osteoporotic fractures. Therefore, miRNA is involved in elderly osteoporotic fracture and is associated with PI3K-Akt and transforming growth factor βsignaling pathways. MiR-106b-5p may inhibit the occurrence of osteoporotic fractures and become a potential marker and therapeutic target.

Key words: osteoporotic fracture, miR-106b-5p, PI3K-Akt, transforming growth factor, differential expression

中图分类号:

王海龙, 李龙, 伊力哈木·托合提, 刘旭, 那次克道尔吉, 陈洪涛, 崔泳. MiR-106b-5p调控老年骨质疏松性骨折的分子网络[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 239-244.

Wang Hailong, Li Long, Yilihamu Tuoheti, Liu Xu, Nacikedaoerji, Chen Hongtao, Cui Yong. Molecular network of miR-106b-5p regulating osteoporotic fracture in the elderly[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(2): 239-244.

图/表（结果） 4

2.1 分子网络学分析
2.1.1 骨质疏松性骨折的差异表达miRNAs 为了确定在骨质疏松性骨折中差异表达的miRNAs，获得了骨质疏松性骨折、骨质疏松性非骨折和对照样本的miRNA表达谱，见图1A。以P < 0.05且 |log2 FC| ≥2为标准，骨质疏松性骨折和对照之间获得了37个差异表达的miRNAs，见图1B；骨质疏松性非骨折和对照之间获得了51个差异表达的miRNAs，见图1C。在这些差异表达miRNAs中，鉴定出21个miRNAs为骨质疏松性骨折相关的miRNAs，见图1D。

2.1.2 DEM及靶基因的筛选与鉴定利用RAID数据库预测21个miRNAs的调控靶标基因，共得到了530个骨质疏松性骨折相关miRNA的靶标基因。通过构建靶标基因的PPI网络，鉴定出连接度(degree)最高的前10个靶标基因，见图2A，并进一步识别了10个靶标基因所对应的DEM，见图2B。其中，miR-106b-5p调控最多的靶标基因(CCND1，MAPK1，STAT3，VEGFA和MYC)而被筛选为核心miRNA。与对照组相比较，miR-106b-5p在骨质疏松性骨折中差异表达下调(P < 0.01)，见图2C。

2.1.3 miRNAs靶基因的GO和KEGG途径 GO功能注释分析结果表明，骨质疏松性骨折相关miRNAs的靶标基因主要参与凋亡进程， MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)活性的激活等生物进程，见图3A。
KEGG通路分析表明，靶标基因主要富集的途径是“PI3K-Akt(磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B)信号通路”“MAPK信号通路”等，见图3B。
另外，对miR-106b-5p的信号通路网络研究结果表明，其与TGF-β(转化生长因子β)信号通路和PI3K-AKT信号通路密切相关，见图3C。

2.2 核心miRNA和信号通路的验证结果通过qPCR实验，验证了miR-106b-5p在老年骨质疏松性骨折与对照的骨组织相比差异表达显著下调(P < 0.05)，见图4A。Western blot实验结果显示，老年骨质疏松性骨折的骨组织中TGF-β信号通路和PI3K-AKT信号通路被激活，见图4B。

参考文献

[1] XIE Y, ZHANG L, XIONG Q, et al. Bench-to-bedside strategies for osteoporotic fracture: From osteoimmunology to mechanosensation. Bone Res. 2019;7:25.
[2] CHEN J, HONG Z, ZHAO C, et al. Associations between polymorphisms of the PDLIM4 gene and susceptibility to osteoporotic fracture in an elderly population of Han Chinese. Biosci Rep. 2019;39(1): BSR20181505.
[3] LIU DB, SUI C, WU TT, et al. Association of Bone Morphogenetic Protein (BMP)/Smad Signaling Pathway with Fracture Healing and Osteogenic Ability in Senile Osteoporotic Fracture in Humans and Rats. Med Sci Monit. 2018;24:4363-4371.
[4] LU J, REN Z, LIU X, et al. Osteoporotic Fracture Guidelines and Medical Education Related to the Clinical Practices: A Nationwide Survey in China. Orthop Surg. 2019;11:569-577.
[5] LIU R, CHAO A, WANG K, et al. Incidence and risk factors of medical complications and direct medical costs after osteoporotic fracture among patients in China. Arch Osteoporos. 2018;13:12.
[6] KIM HY, HA YC, KIM TY, et al. Healthcare Costs of Osteoporotic Fracture in Korea: Information from the National Health Insurance Claims Database, 2008-2011. J Bone Metab. 2017;24:125-133.
[7] TAGUCHI Y, INOUE Y, KIDO T, et al. Treatment costs and cost drivers among osteoporotic fracture patients in Japan: a retrospective database analysis. Arch Osteoporos. 2018;13:45.
[8] BARTEL DP. Metazoan MicroRNAs. Cell. 2018;173:20-51.
[9] PICKERING ME, MILLET M, ROUSSEAU JC, et al. Selected serum microRNA, abdominal aortic calcification and risk of osteoporotic fracture]. PLoS One. 2019;14:e0216947.
[10] SUN X, GUO Q, WEI W, et al. Current Progress on MicroRNA-Based Gene Delivery in the Treatment of Osteoporosis and Osteoporotic Fracture. Int J Endocrinol. 2019;2019:6782653.
[11] TANG X, BAI Y, ZHANG Z, et al. A validated miRNA signature for the diagnosis of osteoporosis related fractures using SVM algorithm classification. Exp Ther Med. 2020;20:2209-2217.
[12] RAMIREZ-SALAZAR EG, CARRILLO-PATINO S, HIDALGO-BRAVO A, et al. Serum miRNAs miR-140-3p and miR-23b-3p as potential biomarkers for osteoporosis and osteoporotic fracture in postmenopausal Mexican-Mestizo women. Gene. 2018;679:19-27.
[13] FISCHER M, QUAAS M, STEINER L, et al. The p53-p21-DREAM-CDE/CHR pathway regulates G2/M cell cycle genes. Nucleic Acids Res. 2016;44:164-174.
[14] FANG H, ZHANG H, WANG Z, et al. Systemic immune-inflammation index acts as a novel diagnostic biomarker for postmenopausal osteoporosis and could predict the risk of osteoporotic fracture. J Clin Lab Anal. 2020;34:e23016.
[15] BOTTANI M, BANFI G, LOMBARDI G. The Clinical Potential of Circulating miRNAs as Biomarkers: Present and Future Applications for Diagnosis and Prognosis of Age-Associated Bone Diseases. Biomolecules. 2020;10(4):589.
[16] HADJIARGYROU M, KOMATSU DE. The Therapeutic Potential of MicroRNAs as Orthobiologics for Skeletal Fractures. J Bone Miner Res. 2019;34:797-809.
[17] ZARECKI P, HACKL M, GRILLARI J, et al. Serum microRNAs as novel biomarkers for osteoporotic vertebral fractures. Bone. 2020;130: 115105.
[18] KANGAS R, TORMAKANGAS T, FEY V, et al. Aging and serum exomiR content in women-effects of estrogenic hormone replacement therapy. Sci Rep. 2017;7:42702.
[19] ZHANG J, YU X, YU Y, et al. MicroRNA expression analysis during FK506-induced osteogenic differentiation in rat bone marrow stromal cells. Mol Med Rep. 2017;16:581-590.
[20] YANG Y, FANG S. Small non-coding RNAs-based bone regulation and targeting therapeutic strategies. Mol Cell Endocrinol. 2017;456:16-35.
[21] FANG T, WU Q, ZHOU L, et al. miR-106b-5p and miR-17-5p suppress osteogenic differentiation by targeting Smad5 and inhibit bone formation. Exp Cell Res. 2016;347:74-82.
[22] HU H, HE X, ZHANG Y, et al. MicroRNA Alterations for Diagnosis, Prognosis, and Treatment of Osteoporosis: A Comprehensive Review and Computational Functional Survey. Front Genet. 2020;11:181.
[23] CHEN YJ, CHANG WA, HUANG MS, et al. Identification of novel genes in aging osteoblasts using next-generation sequencing and bioinformatics. Oncotarget. 2017;8:113598-113613.
[24] ZHENG CX, SUI BD, LIU N, et al. Adipose mesenchymal stem cells from osteoporotic donors preserve functionality and modulate systemic inflammatory microenvironment in osteoporotic cytotherapy. Sci Rep. 2018;8:5215.
[25] HE H, CHEN K, WANG F, et al. miR-204-5p promotes the adipogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells by modulating DVL3 expression and suppressing Wnt/beta-catenin signaling. Int J Mol Med. 2015;35:1587-1595.
[26] MEI Y, BIAN C, LI J, et al. miR-21 modulates the ERK-MAPK signaling pathway by regulating SPRY2 expression during human mesenchymal stem cell differentiation. J Cell Biochem. 2013;114:1374-1384.
[27] SHUAI Y, JIANG Z, YUAN Q, et al. Deciphering the Underlying Mechanism of Eucommiae Cortex against Osteoporotic Fracture by Network Pharmacology. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;2020:7049812.
[28] ZHANG H, HU H, GREELEY N, et al. STAT3 restrains RANK- and TLR4-mediated signalling by suppressing expression of the E2 ubiquitin-conjugating enzyme Ubc13. Nat Commun. 2014;5:5798.
[29] SOWERWINE KJ, SHAW PA, GU W, et al. Bone density and fractures in autosomal dominant hyper IgE syndrome. J Clin Immunol. 2014;34: 260-264.
[30] NICOLAIDOU V, WONG MM, REDPATH AN, et al. Monocytes induce STAT3 activation in human mesenchymal stem cells to promote osteoblast formation. PLoS One. 2012;7:e39871.
[31] BUETTMANN EG, MCKENZIE JA, MIGOTSKY N, et al. VEGFA From Early Osteoblast Lineage Cells (Osterix+) Is Required in Mice for Fracture Healing. J Bone Miner Res. 2019;34:1690-1706.
[32] TOMLINSON RE, MCKENZIE JA, SCHMIEDER AH, et al. Angiogenesis is required for stress fracture healing in rats. Bone. 2013;52:212-219.
[33] DUAN X, MURATA Y, LIU Y, et al. Vegfa regulates perichondrial vascularity and osteoblast differentiation in bone development. Development. 2015;142:1984-1991.
[34] HU K, OLSEN BR. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair. J Clin Invest. 2016;126:509-526.
[35] GHAYOR C, WEBER FE. Epigenetic Regulation of Bone Remodeling and Its Impacts in Osteoporosis. Int J Mol Sci. 2016;17(9):1446.
[36] LAMOUREUX F, BAUD’HUIN M, RODRIGUEZ CALLEJA L, et al. Selective inhibition of BET bromodomain epigenetic signalling interferes with the bone-associated tumour vicious cycle. Nat Commun. 2014;5:3511.
[37] HIGUCHI C, MYOUI A, HASHIMOTO N, et al. Continuous inhibition of MAPK signaling promotes the early osteoblastic differentiation and mineralization of the extracellular matrix. J Bone Miner Res. 2002;17:1785-1794.
[38] SUN X, XIE Z, MA Y, et al. TGF-beta inhibits osteogenesis by upregulating the expression of ubiquitin ligase SMURF1 via MAPK-ERK signaling. J Cell Physiol. 2018;233:596-606.
[39] MACFARLANE EG, HAUPT J, DIETZ HC, et al. TGF-beta Family Signaling in Connective Tissue and Skeletal Diseases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017;9(11):a022269.
[40] HAGHIGHIZADEH E, SHAHREZAEE M, SHARIFZADEH SR, et al. Transforming growth factor-beta3 relation with osteoporosis and osteoporotic fractures. J Res Med Sci. 2019;24:46.
[41] SUN X, LI X, QI H, et al. MiR-21 nanocapsules promote early bone repair of osteoporotic fractures by stimulating the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. J Orthop Translat. 2020;24: 76-87.
[42] LI H, LI T, FAN J, et al. miR-216a rescues dexamethasone suppression of osteogenesis, promotes osteoblast differentiation and enhances bone formation, by regulating c-Cbl-mediated PI3K/AKT pathway. Cell Death Differ. 2015;22:1935-1945.
[43] DE-UGARTE L, YOSKOVITZ G, BALCELLS S, et al. MiRNA profiling of whole trabecular bone: identification of osteoporosis-related changes in MiRNAs in human hip bones. BMC Med Genomics. 2015;8:75.

引言

骨质疏松症是临床最常见的骨骼疾病之一，它可以在任何年龄发生。骨质疏松症的主要特点是骨量和质量的下降，使患者容易发生骨质疏松性骨折(脆性骨折)，造成创伤[1]。骨质疏松症在老龄人口中普遍存在，并已成为世界范围内健康威胁的主要因素之一。随着社会经济的快速改善，人类预期寿命的延长和出生率的降低，中国人口在过去几十年中已大幅老龄化，导致骨质疏松等与老龄化有关的慢性病的发病率随之上升[2]。据报道，2010年，全世界约有2 100万男性和1.37亿女性在50岁及以上时处于骨质疏松性骨折的高风险期[3]。在中国，超过1/3的女性和大约1/10的男性患有严重的骨质疏松性骨折[4]。有研究表明，骨质疏松性骨折与后续发生骨折的高风险和高死亡率密切相关[5]。此外，骨质疏松性骨折对患者和医疗系统造成很大的经济压力[6-7]。因此，预防和治疗骨质疏松性骨折尤为重要。
在目前正在开发的几种新技术中，使用microRNAs (miRNAs)作为骨质疏松性骨折的生物标志物是很有吸引力的。miRNAs是一种小的内源性调节RNA，通过充当调控基因表达的表观遗传关键因素，影响许多生理和病理生理过程[8]。尽管miRNAs并不完全互补于mRNA序列，miRNAs与具有相似序列的目标基因相互作用，抑制了不同基因的翻译。许多研究报道，miRNA通过其在成骨细胞和破骨发生中的活性来调节骨的发育和稳态[9]。有趣的是，miRNAs也参与了骨重塑和骨质疏松等许多骨代谢疾病的过程。miRNA在骨质疏松症和难治性骨质疏松性骨缺损方面显示出前所未有的诊断和治疗潜力[10-11]。目前，已有大量研究证实了骨质疏松性骨折中miRNAs与骨折及愈合受损相关[12-13]。鉴于这些结果，miRNAs或许可以作为诊断骨质疏松性骨折的生物标志物，也可以作为治疗骨质疏松性骨折患者骨丢失的靶点。
越来越多的miRNA阵列数据被上传并存储在基因表达总括(GEO)数据库中。利用GEO数据库，一些研究通过高通量miRNA阵列分析miRNA的表达特征，以进行生物标志物鉴定。这项研究通过GSE93883明确骨质疏松性骨折和miRNA之间的联系，并收集老年骨质疏松性骨折的临床样本进行验证，以了解骨质疏松性骨折的特征性miRNA及其调控网络机制，为鉴定老年骨质疏松性骨折的生物标志物和治疗靶标奠定理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 分子网络学分析
1.1.1 数据收集及差异分析收集GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)的GSE93883数据集，其中包含6例骨质疏松性骨折样本、6例骨质疏松非骨折样本、6例非骨质疏松非骨折样本的miRNA表达谱。通过limma R软件包计算骨质疏松性骨折与对照样本，以及骨质疏松非骨折与对照样本之间的差异表达miRNA(DEM)。P < 0.05 且 |log2 fold change (FC)|≥2筛选显著差异表达的miRNA。此外，利用RAID数据库(http://www.rna-society.org/raid)设置筛选得分大于0.7，预测miRNA的靶标基因。
1.1.2 PPI网络分析和富集分析根据String数据库(http://string-db.org/)中蛋白质相互作用信息，构建靶标基因的PPI网络，并进行连接度(degree)排序。利用clusterProfiler R软件包进行基因本体论(gene ontology，GO)与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)途径分析。设置筛选阈值P < 0.05。
1.2 核心miRNA和信号通路的验证
1.2.1 时间及地点实验于2020年5月至6月在新疆医科大学第七附属医院骨科实验室完成。
1.2.2 样本收集 5例老年骨质疏松性骨折和5例老年非骨质疏松性骨折患者的骨组织收集自新疆医科大学第七附属医院。T值[(骨密度-骨峰值)/标准差]< -2.5的老年骨折为老年骨质疏松性骨折的纳入标准。纳入研究的非骨质疏松性骨折患者为T值> -2.5且由创伤所致骨折。这项研究得到了新疆医科大学伦理委员会的批准。所有患者均充分了解这项研究，并签署了书面同意书。
1.2.3 实时定量PCR 利用Trizol提取200 μg液氮研磨的骨组织中的总RNA。随后，通过miScript Ⅱ RT Kit (Qiagen)将RNA反转录成互补DNA(cDNA)。最后，用miScript SYBR Green PCR Kit检测miR-106b-5p的表达。U6为内参基因，基因表达结果以2−ΔΔCt方法计算。引物序列为：miR-106b-5p(F：5‘-TGC GGC AAC ACC AGT CGA TGG-3’，R：5‘-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3’)；U6(F：5‘-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，R：5‘-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’)。
1.2.4 Western blot 采用Western blot方法检测骨组织样本中Akt和转化生长因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)蛋白的表达水平。从骨组织中提取总蛋白，用Bio-Rad进行定量分析。然后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS-PAGE)分离蛋白质，并转印到PVDF膜上。分别与Akt (Abcam)和TGF-β(Abcam)抗体在37 ℃下孵育过夜后，用辣根过氧化物酶结合二抗(Abcam)在37 ℃孵育1 h。以GAPDH为内参对照。最后，利用凝胶成像系统(Bio-Rad)对蛋白质表达进行评价。
1.2.5 主要观察指标骨组织中miR-106b-5p含量，以及TGF-β和AKT蛋白表达水平。
1.2.6 统计学分析在SPSS 22.0中进行统计学分析，结果以柱形图形式给出，用x±s表示。学生t检验用于两组之间的比较，双边α=0.05。采用Lasso Cox比例风险回归分析确定骨质疏松性骨折的独立危险因素。P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

身体正常的骨形成和功能依赖于动态平衡过程，在动态平衡过程中，成骨细胞诱导成骨，而破骨细胞诱导骨吸收。因此，由于骨质疏松症等因素打破骨形成的动态平衡，一般倾向于骨量丢失，削弱骨强度，相应地诱发骨质疏松性骨
折[14]。目前，人们已经做了大量的工作来识别和验证miRNAs作为骨折风险的循环生物标记物[15-16]。此次研究发现骨质疏松性骨折和对照组织之间的37个差异表达miRNA中，有21个与骨折相关。其中，在骨质疏松性骨折中下调的hsa-miR-106b-5p被鉴定为核心miRNA。研究报道miR-106b-5p在绝经后妇女椎体骨折中差异表达[17]。据报道，miR-106-5p与血清17β-雌二醇显著相关，并被预测为血管内皮生长因子和Smad 6/7的上游调节因子[18]。在FK506促进成骨分化和骨形成的过程中，miR-106b-5p显著差异上调表达，参与干细胞分化、TGF-β受体信号转导[19]。miR-106b-5p通过靶向RANKL和其他细胞因子(白细胞介素8、基质金属蛋白酶2和TWIST)，被证实是一种新的破骨和骨溶解抑制剂[20]。还有研究显示，miR-106b-5p通过靶向Smad 5抑制成骨细胞分化[21]。因此，作者认为miR-106b-5p可以作为骨质疏松性骨折的潜在保护性治疗靶标。
miR-106b-5p的靶标基因中，细胞周期调节蛋白D1 (Cyclin D1，CCND1)与绝经后骨质疏松有关，在破骨细胞中参与Wnt/β-catenin信号[22]。CCND1通过促进细胞增殖，调节细胞周期从G1期向S期的转变[23]。骨髓间充质干细胞在维持骨质疏松相关的骨内动态平衡的微环境中具有重要作用[24]。已有研究发现下调表达的CCND1可导致人骨髓间充质干细胞向成脂而非成骨方向分化[25]。骨细胞通过细胞骨架适应和MAPK通路在骨折中发挥抗炎作用[1]。MAPK1是活性氧、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路中的常见基因，MAPK磷酸化后通过相关转录因子的分化来促进脂肪形成和成骨，是间充质干细胞分化过程中唯一的活跃信号[26]。MAPK的激活在破骨发生中也起着关键作用[27]。人类和小鼠信号转导与转录激活子3(signal transducers and activators of transcription-3，STAT3)的缺乏与骨异常和破骨细胞数量增加有关，其发挥抗炎作用，是抑制破骨作用的一个重要分子途径[28]。造血细胞特异性STAT3缺陷小鼠通过增加破骨作用而发生骨质疏松，导致骨小梁和皮质骨的减少[29]。研究显示，通过STAT途径发出信号对成骨细胞的分化是很重要的[30]。此外，早期成骨细胞系细胞的血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)是骨折愈合所必需的[31]。VEGFA由于对促进血管生成有很强的亲和力，而骨修复的过程需要血管生成[32]。这在其他研究中得到了证实，组成型Osx-Cre小鼠中的VEGFA缺失在长骨发育和修复期间损害成骨细胞生成[33-34]。成骨细胞中MYC(c-Myc)的减少具有抑制破骨作用[35]。MYC或许可以作为调控成骨细胞和破骨细胞分化的靶标[36]。
为进一步探讨骨质疏松性骨折中miRNA的调控分子机制，对靶标基因进行了功能富集分析。MAPK信号通路是与骨折相关的miRNA靶基因的富集结果，MAPK信号的持续抑制促进细胞外基质的早期成骨分化和矿化[37]。TGF-β激活MAPK通路，抑制间充质多能细胞和成骨前细胞的成骨作用[38]。在一些研究中，TGF-β3被认为是骨质疏松严重程度的一个指标。TGF-β在骨质疏松症中对骨形成和吸收具有双重作用 [3，39]。有研究表明，血清TGF-β3水平与骨密度T评分呈显著正相关，与骨质疏松性骨折的发生呈负相关[40]。TGF-β和VEGF在骨折中迅速位于骨折部位，促进血管形成，同时从外周血中吸收各种类型的干细胞，诱导其分化为成骨细胞，加速骨折修复[41]。PI3K-Akt途径的活化参与人骨质疏松过程中，促进成骨分化并保护成骨损伤[42-43]。
miRNAs在多种生物功能中的关键调节作用是一个成熟的概念，其与多种生理和病理条件的关系也在推动其作为生物标志物的临床应用。此次研究结果提示miR-106b-5p可以作为老年骨质疏松性骨折的生物标志物和治疗靶标而进行深入研究。miR-106b-5p可能通过TGF-β和PI3K-Akt途径调节骨质疏松性骨折的进展。
此次研究的局限性在于分析的基因表达谱收集自公共数据库，样本数量相对较小。为了解决这一问题，需要进一步收集临床样本进行实验验证重要的分析结果。尽管如此， miR-106b-5p对老年骨质疏松性骨折的预测作用仍需要大量临床样本进行验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

MiR-106b-5p调控老年骨质疏松性骨折的分子网络

Molecular network of miR-106b-5p regulating osteoporotic fracture in the elderly

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[1]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[2]	王琴, 沈呈, 廖静, 杨烨. 达格列净干预改善糖尿病肾病模型大鼠的肾脏损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1216-1222.
[3]	徐静, 严永敏, 蔡梦洁. miR-373下调转化生长因子βⅡ型受体表达抑制肝星状细胞活化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 756-761.
[4]	杨腾云, 李彦林, 刘德健, 王国梁, 郑竹君. 转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 45-51.
[5]	聂慧娟, 黄织春. 转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞转分化过程中Hedgehog信号通路的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 754-760.
[6]	杨振, 李浩, 付力伟, 高仓健, 姜双鹏, 王福鑫, 苑志国, 孙志强, 查康康, 田广招, 曹福洋, 眭翔, 刘舒云, 郭全义. 3D生物打印负载转化生长因子β3的软骨复合支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5445-5452.
[7]	李英莲, 常琼. 慢性阻塞性肺疾病合并骨质疏松患者血清肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1、白细胞介素6水平的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5085-5090.
[8]	方业汉, 张键, 黄晖, 周钢, 熊小龙, 林坚平. 小型猪内翻膝内侧半月板的基因表达谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5109-5115.
[9]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.
[10]	周武, 王彬娉, 王雅雯, 程亚楠, 黄谢山. 转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3630-3635.
[11]	杨莉, 李雪莉, 宋静卉, 禹卉千, 王伟霞. 隐丹参酮抑制模型兔耳增生性瘢痕的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3150-3155.
[12]	蔺海旗, 陈亮, 唐璐, 翁锡全, 林文弢. 尿液蛋白质组学评估机体病理性变化的意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3259-3266.
[13]	刘治军, 刘少津, 魏合伟, 万雷, 黄宏兴, 乔荣勤. 补肾健脾活血方干预去势大鼠肌肉骨骼转化生长因子β/骨形态发生蛋白2信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2219-2223.
[14]	涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.
[15]	李树源, 周琦石, 李悦, 周宏亮, 杨佳宝, 胡柽. 不同组织部位诱导膜血管化及成骨因子表达的比较[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 667-672.