小型猪内翻膝内侧半月板的基因表达谱分析

doi:10.12307/2021.212

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (32): 5109-5115.doi: 10.12307/2021.212

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小型猪内翻膝内侧半月板的基因表达谱分析

方业汉，张键，黄晖，周钢，熊小龙，林坚平

海南省人民医院(海南医学院附属海南医院)骨科中心，海南省海口市 570311

收稿日期:2020-08-31 修回日期:2020-09-01 接受日期:2020-10-30 出版日期:2021-11-18 发布日期:2021-07-26
通讯作者: 林坚平，博士，教授，硕士生导师，海南省人民医院(海南医学院附属海南医院)骨科中心，海南省海口市 570311
作者简介:方业汉，男，1983年生，湖北省云梦县人，2010年华中科技大学同济医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事关节外科与运动医学方面的研究。
基金资助:
海南省重点研发计划(ZDYF2017112)，项目负责人：林坚平

Gene expression profiling of the medial meniscus in a minipig model of varus knee

Fang Yehan, Zhang Jian, Huang Hui, Zhou Gang, Xiong Xiaolong, Lin Jianping

Orthopedics Center, Hainan General Hospital (Hainan Affiliated Hospital of Hainan Medical University), Haikou 570311, Hainan Province, China

Received:2020-08-31 Revised:2020-09-01 Accepted:2020-10-30 Online:2021-11-18 Published:2021-07-26
Contact: Lin Jianping, MD, Professor, Master’s supervisor, Orthopedics Center, Hainan General Hospital (Hainan Affiliated Hospital of Hainan Medical University), Haikou 570311, Hainan Province, China
About author:Fang Yehan, Master, Associate chief physician, Orthopedics Center, Hainan General Hospital (Hainan Affiliated Hospital of Hainan Medical University), Haikou 570311, Hainan Province, China
Supported by:
the Key Scientific Research and Development Plan of Hainan Province, No. ZDYF2017112 (to LJP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
内翻膝：在人类主要表现为两下肢自然伸直或站立时，两内踝能相碰而两膝不能靠拢的畸形疾病。此次实验通过切除后肢前交叉韧带及外侧副韧带，破坏膝关节外侧的角度稳定结构，使小型猪在站立位时，身体质量更多地集中于膝关节内侧关节面上。26周时间的过度压力和摩擦力作用，会导致膝关节内侧软骨面磨损，半月板退行性病变，从而继发骨性关节炎。
基因表达谱：在此次实验中指构建五指山小型猪处于内翻膝状态下的内侧半月板组织的非偏性cDNA文库，主要通过高通量的猪全基因组芯片扫描，进行猪半月板组织的cDNA测序，收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体组成，从而描绘小型猪内侧半月板组织在内翻膝状态下的基因表达种类和丰度信息。

背景：内翻型膝关节骨性关节炎常合并有明显的内侧半月板病变，然而，其发生机制尚不明确。
目的：寻找内翻膝继发内侧半月板病变的分子机制。
方法：切除7只成年五指山小型猪右侧后肢前交叉韧带及外侧副韧带，造成内翻膝模型(实验侧)，而左侧后肢行假手术(对照侧)。造模后26周时取内侧半月板，行基因芯片分析。实验中的所有程序均于2017-12-05经海南省人民医院医学伦理委员会审核批准，批准号Med-Eth-Re [2020] 5。
结果与结论：2组样本中共发现差异表达基因893个，其中上调537个，下调356个。差异最明显的生物进程包括性别决定、间质形态发生、一氧化氮生物合成过程的调节；细胞成分包括膜的固有成分、质膜的整体成分、内质网膜、核外膜-内质网膜网络；分子功能包括过渡金属离子结合、铁离子结合。信号通路有2型糖尿病、TRP通道的炎性介质调节、AMPK信号通路。提示内翻膝半月板基因表达出现明显变化，这些差异表达的基因可能揭露出内翻膝继发半月板病变的机制，将为其治疗和早期诊断提供潜在靶点。

https://orcid.org/0000-0001-5857-4208 (方业汉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 内翻膝, 半月板, 五指山小型猪, 基因芯片分析, 基因表达谱, 差异表达基因, 分子机制, 实验研究

Abstract: BACKGROUND: Varus-type osteoarthritis is often accompanied by obvious medial meniscus lesions. However, the underlying mechanism of its occurrence is yet unclear.
OBJECTIVE: To explore the molecular mechanism of medial meniscus lesions secondary to varus knees.
METHODS: The anterior cruciate ligament and lateral collateral ligament of the right rear limbs of seven Wuzhishan minipigs were resected to establish a varus knee model (experimental side), while the left hind legs were subjected to sham operation (control side). Medial meniscus samples were taken for a gene chip analysis at 26 weeks after modeling. An ethic approval was obtained from the Medical Ethics Committee of Hainan General Hospital with an approval No. Med-Eth-Re[2020]5 on December 5, 2017.
RESULTS AND CONCLUSION: The samples in the two groups showed significant differences in the gene expression. A total of 893 differentially expressed genes were found, in which 537 were upregulated and 356 were downregulated. The significantly affected biological processes included sex determination, interstitial morphogenesis, and regulation of nitric oxide biosynthetic process. The significantly affected cellular components included intrinsic component of membrane, integral component of plasma membrane, endoplasmic reticulum membrane, and epinuclear membrane-endoplasmic reticulum network. The significantly affected molecular functions included transition metal ion binding and iron ion binding. The significantly affected pathways included type II diabetes mellitus, inflammatory mediator regulation of TRP channels, and AMPK signaling pathway. These findings suggest significant changes in gene expression of varus knee meniscus, and these differentially expressed genes may reveal the mechanism of medial meniscus lesions secondary to varus knee, providing a potential target for its treatment and early diagnosis.

Key words: varus knee, meniscus, Wuzhishan minipig, gene chip analysis, gene expression profile, differentially expressed gene, molecular mechanism, experimental study

中图分类号:

方业汉, 张键, 黄晖, 周钢, 熊小龙, 林坚平. 小型猪内翻膝内侧半月板的基因表达谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5109-5115.

Fang Yehan, Zhang Jian, Huang Hui, Zhou Gang, Xiong Xiaolong, Lin Jianping . Gene expression profiling of the medial meniscus in a minipig model of varus knee[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(32): 5109-5115.

图/表（结果） 7

2.1 小型猪内翻膝内侧半月板样本RNA的评估
2.1.1 RNA 的完整性提取的总RNA行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1 所示，显示14个RNA样品中28S及18S条带清晰，二者比例约为2∶1，5S 条带亦清晰可见，表明所有样本的总RNA是完整的。
2.1.2 RNA 的纯度及浓度用分光光度计测量提取的RNA吸光度值，结果见表1 。所有样本的A260/A280比值均位于1.8-2.1之间，且A260/A230比值大于1.8，说明 RNA 纯度高，可以满足实验要求。

2.2 小型猪内翻膝内侧半月板的差异表达基因情况将芯片扫描后获得的所有基因表达数据，经过标准化处理后做一散点图，可以直观反映出在两样本间发生差异表达基因的分布情况，如图2所示。

根据差异基因判定标准，共发现差异表达基因893个，其中上调基因537个，下调基因356个。按照表达差异幅度排序，前10位已知名称差异基因分别是TFAP2D、HOXD13、CES1、SPMI、PAK5、C7H6orf15、GCNT7、VIL1、INA、COL7A1，见表2 。

2.3 小型猪内翻膝内侧半月板差异表达基因的GO富集分析对上述分析得到的差异表达基因经GO分析，按基因的功能相关性分为生物进程、细胞成分和分子功能三大类。以基因富集分数排名，前10位的生物进程(见表3)包括细胞对激素刺激的反应、对激素的反应、性别决定、肌肉纤维发育、间质形态发生、细胞对内源性刺激的反应、C21-类固醇激素代谢过程、神经肽信号通路、活性氧代谢过程的负调控、一氧化氮生物合成过程的调节。

前10位的细胞成分(见表4)包括转录因子复合体、肌节、收缩纤维部分、肌原纤维、收缩纤维、细胞体、膜的固有成分、质膜的组成成分、内质网膜、核外膜-内质网膜网络。

前10位的分子功能(见表5)包括转录调控区序列特异性DNA结合、RNA聚合酶Ⅱ远端增强子序列特异性结合、激素活性、序列特异性双链DNA结合、病毒受体活性、劫持分子功能、增强子结合、过渡金属离子结合、铁离子结合、双链DNA结合。

2.4 小型猪内翻膝内侧半月板差异表达基因的KEGG 通路分析差异表达基因经KEGG通路分析后，共发现36条出现差异调节的信号通路。按照信号通路富集分数排名，前10位的通路依次为2型糖尿病、甲状腺激素合成、味觉转导、催乳素信号通路、寿命调节通路、卵巢类固醇生成、神经活性配体-受体相互作用、TRP通道的炎性递质调节、泛酸和辅酶A的生物合成、AMPK信号通路，见表6。

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引言

材料方法

1.1 设计自身对照动物实验。
1.2 时间及地点于2017年12月至2019年1月在海南省农科院动物实验中心和上海康成生物科技有限公司实验室完成。
1.3 材料由海南省农业科学院动物科学与兽医研究所提供的7只雄性五指山小型猪[动物许可证号：SCXK(琼)2014-0006]，年龄6.1-7.4个月，平均(6.8±0.3)个月，体质量18.6–21.2 kg，平均(19.4±3.4) kg。为保持膝关节组间同质性，研究仅选取雄性五指山小型猪。小型猪整个生命周期均采用圈养的饲养方式，猪圈温度14-22 ℃，相对湿度55%-70%，自然光照。实验中的所有程序均于2017-12-05经海南省人民医院医学伦理委员会审核批准，批准号Med-Eth-Re [2020] 5。

1.4 方法
1.4.1 造模方法通过肌内注射盐酸赛拉嗪注射液(0.3 mL/kg)和戊巴比妥钠(20 mg/kg)麻醉成功后，对手术部位进行剃毛和消毒。实验侧为右后肢，以外侧髌旁入路，切口起自髌骨上方，下至胫骨结节，长约10.0 cm；然后通过向内侧脱位髌骨以打开关节；用钳子将前交叉韧带夹持固定，并在紧贴胫骨止点处切除长约1.0 cm韧带；关节线分离暴露外侧副韧带，同样切除1.0 cm的长度，从而造成小型猪内翻膝模型。用100 mL无菌生理盐水冲洗术野后，将关节囊用3-0丝线间断缝合。对照侧为左后肢，行假手术，即采取类似于上述关节囊的切口进行手术，但未对韧带、半月板、软骨或骨进行任何操作。
1.4.2 术后处理造模后每天检查2次，观察小型猪的进食及活动情况。为了避免感染，所有动物均采用肌注青霉素(160万单位)和曲马多(100 mg)治疗7 d。待伤口完全愈合后，小型猪可自由活动。
1.4.3 取材造模后第26周通过急性大量放血法处死动物[8]，标准化分离半月板：从前方切开膝关节囊后，靠近股骨侧沿关节线切断关节囊及韧带等结构，将胫骨自股骨上离断。然后从胫骨上完整切下内侧半月板，用磷酸盐缓冲盐水洗涤干净后切成黄豆大小的组织块。标本选取位于半月板体部红色和白色交界处的组织块，并立即置于冻存管内保存在液氮中。以上操作在小型猪死亡后立即进行，并在10 min内完成。

1.4.4 RNA提取与评估经过DNase消化处理后，根据制造商的说明，使用E.Z.N.A Total RNA Kit II从半月板组织中提取总RNA。通过NanoDrop ND-1000分光光度计评估RNA的数量和质量(A260/A280 和 A260/A230)，以检测RNA是否降解并测量其浓度。通过标准变性琼脂糖凝胶电泳评估RNA的完整性。
1.4.5 芯片扫描实验 RNA样品标记和阵列杂交是根据基于安捷伦单色微阵列的基因表达分析协议(Agilent Technology)进行的。简而言之，线性扩增每个样品的总RNA，并使用安捷伦Quick Amp单色标记试剂盒中的Cy3-UTP标记。标记的cRNA按照制造商的说明通过RNeasy Mini Kit进一步纯化。通过NanoDrop ND-1000测量标记的cRNA的浓度和比活性。之后，通过加入11 μL 10×封闭剂和2.2 μL 25×片段化缓冲液，裂解1 μg每个标记的cRNA，在60 ℃加热30 min，最后加入55 μL 2×GE杂交缓冲液稀释标记的cRNA。将100 μL的杂交溶液分配到垫片载玻片中，并组装到基因表达微阵列载玻片上。将载玻片置于安捷伦杂交炉中，于65 ℃孵育17 h，使RNA与安捷伦全猪基因组微阵列杂交。将杂交后的阵列洗涤、固定并使用安捷伦DNA微阵列扫描仪进行扫描。
1.4.6 芯片数据分析通过Agilent Feature Extraction Software (版本11.0.1.1)从扫描采集的阵列图像中提取原始基因表达数据。
使用Agilent Gene Spring GX software (版本12.1)软件系统对芯片数据执行分位数归一化和后续数据处理。在对原始数据进行分位数归一化之后，选择14个样本中至少有7个具有“检测到”标记的基因(“所有目标值”)用于进一步的数据分析。使用倍数变化阈值≥2.0，P值≤0.05过滤鉴定2组差异有显著性意义的差异表达基因。通过倍数变化过滤来鉴定2个样品的差异表达基因。
以标准富集计算方法进行基因本体(GO)分析和Pathway分析，定位差异表达基因的功能。为了进行差异基因的GO分析，使用topGO来推断它们所涉及的分子功能，并使用KEGG途径来进行差异表达基因的途径分析以推断所涉及的途径。所有微阵列数据均符合MIAME标准[9]，并且原始数据可通过GEO数据库( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获得，登录号为GSE145402。

讨论

由于直接人体实验的困难和理想动物模型的欠缺，极大限制了内翻膝骨性关节炎发病机制的研究，尤其是半月板病变的具体作用。目前小型猪作为动物模型已被广泛应用于生物医学研究领域。研究显示小型猪的器官和新陈代谢特点与人类高度相似[10-11]，甚至作为半月板主要成分的胶原蛋白结构也与人类具有很高的相似性[12]。相较于既往研究中常采用的豚鼠、大鼠及兔子等小型动物[5-7]，小型猪的后腿膝关节及半月板更大，有利于进行干预及观察。圈养小型猪的日常活动以站立及跑动等为主，其后腿膝关节所承受的生物力学特点更接近人类站立行走时的膝关节。而且经过驯养育种后的五指山小型猪，具有遗传特性均一、性情温顺、健康状况良好、对手术耐受性好等优点。基于以上优势，作者选择五指山小型猪作为实验动物，模拟内翻膝内侧副韧带挛缩而外侧副韧带松弛的生物力学特征，经过圈养时间积累制造小型猪内翻膝动物模型。
韧带结构对于维持膝关节正常的应力环境至关重要。临床上可见前交叉韧带功能缺陷导致的半月板损伤[13]，动物实验也观察到切除前交叉韧带后会导致半月板出现退变性改变[8]。此次研究通过前交叉韧带切除和外侧副韧带切除模拟临床常见的内翻膝。由于失去了韧带在维持膝关节稳定方面的协同作用，半月板承受的异常应力明显增加，使半月板细胞暴露于张力、压缩和静水压力、流体压力、流体流动等复杂且不均匀的应力-应变环境中。这些物理信号通过一些特殊的机制影响了半月板细胞的生物学反应，导致半月板合成/分解代谢或促炎/抗炎反应的失衡。其中最重要的一种媒介因子是一氧化氮，研究显示一氧化氮可上调关于半月板基质分解代谢，并促进炎症反应基因的表达，导致半月板胶原纤维降解、软骨糖胺多糖释放增多[14-15]；同时，研究显示一氧化氮可通过下调JNK通路而降低细胞的自噬能力，影响了半月板细胞的正常生理功能，导致半月板退变[16]；而透明质酸、硒及白细胞介素10等可通过抑制一氧化氮的合成代谢，进而表现出延缓或改善半月板退变的作用[17-19]。此次研究发现表达上调基因的生物进程包括了一氧化氮生物合成过程，这验证了一氧化氮参与前交叉韧带切除和外侧副韧带切除后内翻膝半月板病变的过程，因而推测针对一氧化氮代谢的治疗措施可能是延缓或逆转韧带功能缺失后半月板病变的一个可能途径。
临床流行病学显示，膝关节骨性关节炎半月板退变更常发生于中老年女性患者[20-21]，提示性激素在半月板退变中存在重要作用。五指山小型猪膝关节行前交叉韧带切除和外侧副韧带切除后，半月板也出现类似的退变，作者推测其主要原因为：①性激素可能直接参与了半月板退变的调控机制。虽然研究采用了雄性五指山小型猪，但在差异基因分析中发现许多与雄性相关的生物进程出现下调，比如性别决定、男性性腺发育、男性性别分化等，雄性特征受到下调抑制，提示雄激素表达水平下调可能直接参与了前交叉韧带切除和外侧副韧带切除后内翻膝半月板病变的发生。②性激素可能通过影响患者肌肉力量、步行耐力和平衡能力而间接导致半月板病变[22]。此次实验发现有许多骨骼运动系统发育相关的生物进程出现下调，比如肌肉纤维发育、间质形态发生等。目前研究显示，雄激素可以明显促进骨骼肌肉系统发育，因而雄性动物多表现得更为强壮，而强壮的肌肉更有助于维持关节在运动中的稳定性[23-24]。当这种动态的稳定机制下降时，半月板受到的异常应力增加，从而通过上述机制导致半月板病变。
异常机械应力刺激或炎性因子可促进半月板纤维软骨细胞内ANKH和ENPP1基因的过表达，会导致细胞内钙浓度升高或增强钙信号传导，从而降低半月板的自我修复能力[25-26]。而磷酸柠檬酸则可通过直接抑制病理性钙化和骨化分类基因的表达，表现出抑制半月板细胞的增殖和半月板细胞介导的钙化的作用，发挥延缓和逆转半月板退变或骨性关节炎的作用[27]。这些研究反映半月板纤维软骨细胞内钙离子沉积水平与半月板退变正相关，正如此次实验显示差异基因中表达上调的分子功能包括过渡金属离子结合，其中钙离子就是其中的重要一员。此外，作者还观察到表达上调的分子功能有铁离子结合，有其他研究也发现遗传性血色素沉着症模型小鼠因为全身组织内铁超负荷，更易发生膝关节骨性关节炎及半月板退变[28]，这提示铁离子可能也在半月板退变中占据一定的作用，值得进一步深入研究。
通过差异表达基因KEGG通路分析发现，上调的信号通路富集分数排在前列的有2型糖尿病、AMPK信号通路、TRP通道的炎性递质调节，其中2型糖尿病是差异最为明显的信号转导系统。胰岛素样生长因子在正常生理活动中起着极为重要的作用，与骨骼肌肉系统发育及半月板修复功能密切相关[29]，胰岛素抵抗在一定程度上影响了胰岛素样生长因子的促进修复作用，导致半月板出现退变。胰岛素分泌受损则会导致细胞对糖的利用能力下降，继而激发细胞的能量感受器AMPK信号通路，此通路上调，将进一步改变细胞的能量代谢状态，具体表现在分解代谢增强，而合成代谢受到抑制，最终导致半月板细胞外基质改变。此次实验中表达下调的基因涉及的细胞成分包括膜的固有成分、质膜的整体成分、内质网膜、核外膜-内质网膜网络即印证了这种改变。在临床上也观察到2型糖尿病患者并发半月板退变的风险也明显高于正常人群[30]，这提示2型糖尿病作为一种全身性代谢性疾病，可能在半月板病变中也有重要作用。TRP通道的炎性递质调节与MAPK通路具有协同作用，受损关节由于促炎症因子(如白细胞介素1及肿瘤坏死因子α)及激活的细胞内MAPK通路会引起一系列的反应，如基质金属蛋白酶分泌增加、ADAMTS-4活性增强、趋化因子浓度增加、一氧化氮合成增加等[15，31-32]，最终诱导组织分解代谢，而拮抗合成代谢，抑制组织的修复功能。TRP通道的炎性递质调节信号通路的上调，表明炎性介质参与了韧带功能缺失后半月板退变过程。
目前关于基因芯片测序的样本量尚没有统一的要求，文献显示此样本量可以满足统计分析的要求[9]。实验研究选择自身对照，优势在于基因同源性更高，基因出现表达差异的研究意义更为明显，但也存在小型猪后腿负重相互干扰等问题，可进一步采用同种异体对照基因芯片分析。半月板是由多种细胞构成的，包括半月板纤维细胞、半月板软骨细胞、血管上皮细胞等，因而基因芯片分析获得的差异表达基因是整体组织的生物信息学反应。半月板各组成细胞在内翻膝半月板病变中的具体作用则难以明确界定。可通过细胞分离培养或单细胞基因测序进一步研究[33]。此外，由于种属特异性，动物实验获得的结果与人体实际表现可能存在差异，因而实验所获得的结果于人类而言只具有类比性，仅提示人类内翻膝半月板病变可能存在的机制。
总的来说，五指山小型猪前交叉韧带切除和外侧副韧带切除后内翻膝半月板基因表达出现明显变化，深入研究这些差异表达基因可能揭露出内翻膝继发半月板病变的机制，也可能揭示内翻膝半月板病变治疗和早期诊断的潜在靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

小型猪内翻膝内侧半月板的基因表达谱分析

Gene expression profiling of the medial meniscus in a minipig model of varus knee

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