3D生物打印负载转化生长因子β3的软骨复合支架

doi:10.12307/2021.237

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (34): 5445-5452.doi: 10.12307/2021.237

• 组织工程软骨材料Tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

3D生物打印负载转化生长因子β3的软骨复合支架

杨振1，2，李浩1，2，付力伟1，2，高仓健1，2，姜双鹏2，王福鑫2，苑志国2，孙志强1，2，查康康1，2，田广招1，2，曹福洋2，眭翔2，刘舒云2，郭全义2

1南开大学医学院，天津市 300071；2解放军总医院第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853

收稿日期:2020-06-28 修回日期:2020-07-03 接受日期:2020-08-04 出版日期:2021-12-08 发布日期:2021-07-26
通讯作者: 郭全义，教授，解放军总医院第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853
作者简介:杨振，男，1993 年生，河南省商丘市人，汉族，南开大学医学院在读硕士，主要从事软骨、半月板组织工程相关方向的研究
基金资助:
国家重点研发计划课题(2019YFA0110600)，项目负责人：郭全义；国家自然科学基金(81772319)，项目负责人：郭全义

Cartilage composite scaffold loaded with transforming growth factor beta 3 using three-dimensional bioprinting

Yang Zhen1, 2, Li Hao1, 2, Fu Liwei1, 2, Gao Cangjian1, 2, Jiang Shuangpeng2, Wang Fuxin2, Yuan Zhiguo2, Sun Zhiqiang1, 2, Zha Kangkang1, 2, Tian Guangzhao1, 2, Cao Fuyang2, Sui Xiang2, Liu Shuyun2, Guo Quanyi2

1Medical College of Nankai University, Tianjin 300071, China; 2Institute of Orthopedics, the First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China

Received:2020-06-28 Revised:2020-07-03 Accepted:2020-08-04 Online:2021-12-08 Published:2021-07-26
Contact: Guo Quanyi, Professor, Institute of Orthopedics, the First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
About author:Yang Zhen, Master candidate, Medical College of Nankai University, Tianjin 300071, China; Institute of Orthopedics, the First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
Supported by:
the National Key Research and Development Plan Project, No. 2019YFA0110600 (to GQY); the National Natural Science Foundation of China, No. 81772319 (to GQY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
3D生物打印：通过精准控制生物材料、种子细胞、生长因子在整体3D结构中的位置、组合与互相作用，使之具有生物活性，并能实现与目标组织或生物器官接近相同，甚至更优越的功能。
转化生长因子β3：作为关节软骨组织形成的重要调节因子，可以促进干细胞迁移和成软骨分化，增强软骨损伤的修复，是一种理想的干细胞招募和促分化因子。
背景：通过募集内源性干细胞原位再生软骨损伤的治疗策略，是未来软骨组织工程研究的新方向。
目的：构建既能募集干细胞又能促进其黏附和增殖，且有利于新生组织成熟的组织工程软骨复合支架。
方法：将脱细胞软骨细胞外基质(extracellular matrix，ECM)与甲基丙烯酸酯化明胶(methacrylated gelatin，GelMA)混合配制光敏性生物墨水，利用3D生物打印技术分别制备单纯聚己内酯[poly(Ɛ-caprolactone)，PCL]支架、PCL/GelMA/ECM支架。将转化生长因子β3(transforming growth factor β3，TGF-β3)负载于生物墨水中制备PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架，检测其缓释性能。从形态学、组织学、生物化学、生物力学等角度评价PCL/GelMA/ECM支架的物理化学性质。利用CCK-8法检测PCL/GelMA/ECM支架的细胞毒性。将脂肪间充质干细胞接种于PCL/GelMA/ECM支架上，1，4，7 d后，共聚焦显微镜下观察细胞活性，扫描电镜观察细胞黏附。将PCL/GelMA/ECM支架植入SD大鼠皮下，组织学观察炎性细胞浸润与支架降解。利用Transwell小室实验检测PCL/GelMA/ECM支架、PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架对脂肪间充质干细胞迁移的影响，以单独培养的细胞为阴性对照。
结果与结论：①PCL/GelMA/ECM支架呈现三维立体多孔网状结构，无细胞成分，含有Ⅱ型胶原和糖胺聚糖等软骨特异性成分，支架弹性模量为(14.24±2.44)MPa；②PCL/GelMA/ECM支架无明显的细胞毒性；③脂肪间充质干细胞紧密贴附于PCL/GelMA/ECM支架上，细胞活性良好，可分泌细胞外基质；④PCL/GelMA/ECM支架植入大鼠皮下1周后有轻度急性炎症反应，3周后炎性反应减轻，并可见逐步支架降解；⑤PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架具有良好的缓释性能，可持续释放TGF-β3达60 d；⑥相对于阴性对照组，PCL/GelMA/ECM支架、PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架均可促进脂肪间充质干细胞的迁移，其中以PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架促迁移作用更显著；⑦结果表明，3D打印PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架可促进脂肪间充质干细胞的增殖、黏附与迁移。
https://orcid.org/0000-0002-2267-4589 (杨振)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨, 材料, 支架, 转化生长因子β3, 3D生物打印, 软骨损伤, 脂肪间充质干细胞, 招募, 迁移

Abstract: BACKGROUND: The therapeutic strategy of in situ regeneration of cartilage injury by recruiting endogenous stem cells is a new research direction of cartilage tissue engineering in the future.
OBJECTIVE: To construct a tissue engineering cartilage composite scaffold that can not only recruit stem cells, promote cell adhesion and proliferation, but also be beneficial to the maturation of neo-tissue.
METHODS: Acellular cartilage extracellular matrix (ECM) and methacrylate gelatin (GelMA) were mixed to prepare photosensitive bio-ink, and three-dimensional bioprinting technology was used to prepare polycaprolactone (PCL) scaffolds and PCL/GelMA/ECM scaffolds. Transforming growth factor β3 (TGF-β3) was loaded into bio-ink to prepare PCL/GelMA/ECM/TGF-β3 scaffold, and its sustained release performance was tested. The physical and chemical properties of PCL/GelMA/ECM scaffolds were evaluated from the point of view of morphology, histology, biochemistry and biomechanics. CCK-8 assay was used to detect the cytotoxicity of PCL/GelMA/ECM scaffolds. After adipose-derived mesenchymal stem cells were seeded on PCL/GelMA/ECM scaffold for 1, 4 and 7 days, the cell viability was observed by confocal microscope and the cell adhesion was observed by scanning electron microscope. PCL/GelMA/ECM scaffolds were implanted subcutaneously in SD rats, and the infiltration of inflammatory cells and the degradation of scaffolds were observed histologically. The effects of PCL/GelMA/ECM scaffold and PCL/GelMA/ECM/TGF-β3 scaffold on the migration of adipose-derived mesenchymal stem cells were detected by Transwell chamber test, and the cells cultured alone were used as negative control.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The PCL/GelMA/ECM scaffolds had a three-dimensional porous reticular structure, without cellular components, contained cartilage-specific components such as type II collagen and glycosaminoglycan and its elastic modulus was (14.24±2.44) MPa. (2) PCL/GelMA/ECM scaffolds showed no obvious cytotoxicity. (3) Adipose-derived mesenchymal stem cells were adhered closely to the PCL/GelMA/ECM scaffolds, had good cell activity and could secrete extracellular matrix. (4) One week after PCL/GelMA/ECM scaffolds were implanted subcutaneously in rats, there was a mild acute inflammatory reaction, and the inflammatory reaction was alleviated after 3 weeks, and the scaffolds were gradually degraded. (5) PCL/GelMA/ECM/TGF-β3 scaffold had good sustained release performance, and TGF-β3 could be released continuously for 60 days. (6) Compared with the negative control group, PCL/GelMA/ECM scaffolds and PCL/GelMA/ECM/TGF-β3 scaffolds could promote the migration of adipose-derived mesenchymal stem cells, and PCL/GelMA/ECM/TGF-β3 scaffold could promote the migration of adipose-derived mesenchymal stem cells more significantly. (7) The results showed that three-dimensional printing PCL/GelMA/ECM/TGF-β3 scaffolds could promote the proliferation, adhesion and migration of adipose-derived mesenchymal stem cells.

Key words: one, materials, scaffold, transforming growth factor-β3, 3D bioprinting, cartilage injury, adipose derived mesenchymal stem cells, recruitment, migration

中图分类号:

杨振, 李浩, 付力伟, 高仓健, 姜双鹏, 王福鑫, 苑志国, 孙志强, 查康康, 田广招, 曹福洋, 眭翔, 刘舒云, 郭全义. 3D生物打印负载转化生长因子β3的软骨复合支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5445-5452.

Yang Zhen, Li Hao, Fu Liwei, Gao Cangjian, Jiang Shuangpeng, Wang Fuxin, Yuan Zhiguo, Sun Zhiqiang, Zha Kangkang Tian Guangzhao, Cao Fuyang, Sui Xiang, Liu Shuyun, Guo Quanyi. Cartilage composite scaffold loaded with transforming growth factor beta 3 using three-dimensional bioprinting[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(34): 5445-5452.

图/表（结果） 9

2.1 3D打印支架的大体观和微观结构观察大体观可见PCL纤维呈现十字交叉网格结构，纤维排列整齐均匀，GelMA/ECM生物墨水材料均匀填充在PCL纤维之间，见图1A所示。通过扫描电镜观察支架的横切面和纵切面的内部结构可以发现，3D打印PCL/GelMA/ECM支架呈现三维立体多孔的网格状结构，PCL纤维形成的大孔与GelMA/ECM凝胶形成的疏松的小孔互相连通，孔径尺寸分布100-200 μm之间，见图1B所示。

2.2 3D打印支架的组织学检测苏木精-伊红染色可以看出GelMA/ECM生物墨水材料中无细胞核成分，提示细胞等免疫原性成分去除比较彻底(图2A)。甲苯胺蓝染色和番红染色呈阳性(图2B，C)，提示PCL/GelMA/ECM支架中含有糖胺聚糖成分；Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈弱阳性(图2D)，提示PCL/GelMA/ECM支架含有少量的Ⅰ型胶原；Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性(图2E)，说明该支架含有大量的Ⅱ型胶原蛋白。

2.3 3D打印支架的生物化学检测正常软骨的胶原含量为(246.21±27.8) mg/g，3D打印PCL/GelMA/ECM支架为(61.63± 1.27) mg/g；正常软骨的糖胺聚糖含量为(5.94±1.16) mg/g，3D打印PCL/GelMA/ECM支架仅为(0.71±0.072) mg/g，见图3。3D打印PCL/GelMA/ECM支架含有一定量的胶原和糖胺聚糖，但与正常软骨相比含量较低。

2.4 3D打印支架生物力学检测 3D生物打印PCL/GelMA/ECM支架的压缩模量为(14.24±2.44) MPa，高于PCL支架的(10.41±1.13) MPa(P < 0.05)和人膝关节正常软骨压缩模量(4.3-13.0 MPa)[28]，具有良好的生物力学性能，可以在软骨再生的时间窗口内提供力学支撑。
2.5 3D打印支架缓释性检测负载于GelMA/ECM生物墨水中的TGF-β3累计释放曲线见图4。在缓释检测的60 d内，前1周内释放较快，因子累计释放率已达约60%，呈现短期内的突释现象，随后的1-4周释放速度逐渐减缓，而4-8周的释放规律类似于零级释放动力学，60 d累计释放率约达80%，并且仍有缓慢释放的趋势。

2.6 3D打印支架的细胞毒性实验 CCK-8细胞毒性实验结果显示，支架浸提液与脂肪间充质干细胞共培养1，4，7 d后，实验组与阴性对照组细胞数量明显增多，并且二者在不同时间点的吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5，提示该支架无明显细胞毒性，具有良好的细胞相容性，为植入动物体内提供了有利的理论支撑。

2.7 3D打印支架的细胞活性检测兔脂肪间充质干细胞在支架上培养1，4，7 d后的死活染色结果，见图6所示，活细胞(绿色荧光)数量随着时间延长数量逐渐增加，而死细胞(红色荧光)则极少，说明细胞在支架上的活力良好，该支架有利于细胞生长增殖。

2.8 3D打印支架上的细胞黏附和形态观察兔脂肪间充质干细胞在3D打印PCL/GelMA/ECM支架上培养1，4，7 d后的扫描电镜结果，见图7所示，可见大量片状细胞均附着于支架表面生长，形态多样且产生大量ECM，仅存在少量圆球形细胞；随着时间延长，可见细胞明显紧密贴附、相互融合成片状，并生长入微孔内，说明该支架适合细胞生长，并且促进细胞分泌大量ECM。

2.9 3D打印支架的免疫排斥和降解反应将支架埋植大鼠背部皮下后，第1周出现急性炎症反应，呈现白色炎症组织块，且炎症区域大于支架；第3周可见炎症反应减轻，支架与周围组织边界不清，见图8。为了进一步观察支架植入后的组织学特点对其行苏木精-伊红染色，第1周可见炎性细胞浸润在支架内部和支架与组织交界处，而第3周炎性细胞浸润减轻，见图8，表明3D打印PCL/GelMA/ECM支架具有良好的生物相容性；在第1周时，支架GelMA/ECM成分少量降解，到第3周时该成分降解增多，反映出GelMA/ECM成分具有良好的可降解性。

2.10 3D打印支架募集效应检测细胞迁移结晶紫染色结果及定量分析结果见图9所示，与阴性对照组相比， PCL/GelMA/ECM支架组、PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架组的脂肪间充质干细胞迁移数增多(P < 0.05，P < 0.000 1)；与PCL/GelMA/ECM支架相比，PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架组的细胞迁移数目更多(P < 0.000 1)。

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引言

关节软骨是一种缺乏血管、淋巴和神经的致密的结缔组织，一旦损伤自我再生和修复能力极为有限[1]。目前单纯软骨损伤无有效的治疗方法，只能对症处理，而软骨组织工程的出现为软骨的损伤再生修复带来了新的希望[2-3]。基于外源性细胞的组织工程技术通过结合不同种子细胞和细胞载体开发生物工程组织体进行体内组织损伤修复，是一种持续发展的策略，实验模型和临床证实能够再生关节软骨[4-5]。虽然此技术取得了相对满意的治疗结果，但是依然面临着一些问题：种子细胞供体有限，体外扩增容易失去细胞表型；需要二次手术，时间间隔比较长并且花费较高；病原体传播的风险高[6-7]。
近些年，通过招募内源性干细胞归巢至损伤部位以促进软骨再生修复的原位组织工程策略，已经受到了学者们的广泛关注[8-9]。该策略主要是利用宿主自身再生修复的潜力，通过构建生物功能化的支架将内源性干细胞招募到损伤部位，并提供合适的微环境以增强迁移细胞的黏附、增殖和成软骨分化，促进关节软骨的再生修复[10]。首先，需要招募足够数量能够实现损伤或病变组织再生的内源性干细胞。转化生长因子β3(transforming growth factor β3，TGF-β3)作为关节软骨组织形成的重要调节因子，可以促进干细胞迁移和成软骨分化，增强软骨损伤的修复[11-13]，是一种理想的干细胞招募和促分化因子。其次，理想的支架还应该提供干细胞诱导分化的再生微环境[14]。作者所在团队前期研究和相关文献报道，脱细胞软骨细胞外基质(extracellular matrix，ECM)可以模仿软骨细胞生长的天然微环境，适于内源性干细胞的黏附、增殖和成软骨分化[15-16]。同时，甲基丙烯酸酯化明胶(gelatin methacryloyl，GelMA)是一种经过甲基丙烯酸酯基团改性的明胶，具有良好的生物相容性和可调节的力学性能，同时具有光固化性，可与光交联剂在合适波长的光下交联形成立体的三维网格状结构及良好的温敏特征，易于成型，结构体保持时间长[17]。课题组前期研究表明，GelMA与脱细胞半月板ECM混合制备的生物墨水具有良好的细胞相容性，半月板细胞在此生物墨水中生长状态良好[17]。此外，软骨支架还应该能够保证诱导微环境的长期维持[18]。近年来新兴的3D生物打印技术可以根据损伤组织结构特点精确打印出组织仿生结构体，具有高度自动化、精密结构设计和制备能力[19-20]。聚己内酯[poly(Ɛ-caprolactone)，PCL]是常用的可降解高分子聚合物材料，其人工合成支架具有良好的力学性能、较强的可塑性、可控的降解速率、来源不受限制等优势[21-22]。
实验旨在融合3D生物打印技术和ECM制备技术，结合不同材料和活性因子的优势构建出软骨组织工程PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架，系统评价该支架的物理化学特性和生物相容性，探究其因子缓释性及对兔脂肪间充质干细胞的招募作用，为体内修复实验提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外和体内观察性实验。
1.2 时间及地点实验于2019年5月至 2020年6月在中国人民解放军总医院骨科研究所完成。
1.3 材料 GelMA与PCL材料的物理化学特性、生物相容性及产品用途，见表1；脱细胞软骨ECM由课题组前期制备。

1.3.1 实验动物 4周龄健康的新西兰大白兔4只，雌雄不拘，体质量约为1 kg；1月龄健康的SD大鼠6只，雌雄不拘，体质量280-330 g，均购自中国人民解放军总医院实验动物中心，许可证号：SCXK(京)2019-0015。实验方案由中国人民解放军总医院动物实验伦理委员会批准。
1.3.2 实验主要试剂及仪器 TGF-β3(近岸蛋白质科技有限公司，中国)；LAP光引发剂(上普博源生物科技有限公司，北京)；OCT包埋剂(SAKURA公司，日本)；苏木精-伊红染色液(北京瀚海拓新生物技术有限公司，中国)；甲苯胺蓝染色液(北京索莱宝科技有限公司，中国)；番红-O染色液(北京索莱宝科技有限公司，中国)；Ⅰ型和Ⅱ型胶原一抗(abcam公司，美国)；Ⅰ型和Ⅱ型胶原二抗(福州迈新生物技术开发有限公司，中国)；胎牛血清(元亨圣马生物技术有限公司，中国)；羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司，中国)；GENMED细胞糖胺多糖总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测试剂盒(GENMED SCIENTIFICS INC.，美国)DMEM/F12培养基(Corning公司，美国)；CCK-8试剂盒(同仁公司，日本)；酶联免疫吸附试剂盒(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA，R&D system公司，美国)；Transwell小室(corning公司，美国)；结晶紫(北京化工厂，中国)； SUNP BIOMAKER生物打印机(上普博源生物科技有限公司，中国)；扫描电子显微镜(Hitachi S-4800型，日本)；CMT5304-30KN型电子万能材料试验机(深圳三思科技有限公司，中国)；EPOCH TAKE 3酶标仪(Bio Tek公司，美国)；TCS SP8共聚焦显微镜(Leica公司，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 GelMA/ECM和GelMA/ECM/TGF-β3生物墨水制备课题组采用改良的差速离心法制备猪软骨脱细胞ECM[23-24]。具体方法如下：将新鲜猪膝关节软骨组织取出，无菌条件下剪碎成1 mm×1 mm×1 mm的薄片，使用无菌蒸馏水冲洗3次，用体积分数3%双氧水浸泡消毒灭菌30 min，无菌蒸馏水漂洗3次，30 min/次；将其放入匀浆机内打碎，加 2 倍无菌三蒸水在低温下反复粉碎猪关节软骨匀浆，加10倍体积无菌三蒸水低渗混匀，将低渗的含细胞匀浆放入-20 ℃中冷冻后，于常温融化，经4次冻融周期；梯度离心，将粉碎的匀浆2 000 r/min离心30 min，取上清；3 000 r/min离心
30 min，取上清；4 000 r/min离心30 min，取上清，反复 5 次，充分洗去细胞碎片和残留物质，洗至 pH=7.0；取上层匀浆，
4 ℃10 000 r/min离心 30 min，去上清，收集沉淀即为40 g/L无细胞的猪软骨ECM浆料。
取一定质量GelMA粉末，溶解于PBS中(pH=7.0)，制备出200 g/L的GelMA溶液，并将其与等体积ECM浆料混合，同时加入一定质量的LAP光引发剂(终浓度0.25%)，最终制备成可打印、光交联的GelMA/ECM生物墨水。将
GelMA/ECM生物墨水与100 mg/L的TGF-β3溶液按照体积比为49∶1混合，制备GelMA/ECM/TGF-β3生物墨水，其中生长因子终质量浓度为2 mg/L，且其特定浓度参考之前的研究报道[25]。
1.4.2 3D生物打印软骨支架的制备对家兔软骨的组织学和生物力学综合分析，将所得参数通过CAD设计所需要的形状，再使用Magics设计支架内部结构，利用3D-Bioplotter软件调用上述保存的数据文件，设定支架层-层之间的丝径和孔径大小，制备出单纯PCL支架、PCL/GelMA/ECM支架和PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架。具体打印参数如下：3D生物打印机喷头1为G25寸锥形针头，内径500 μm，喷头温度30 ℃，以5 mm/s速度打印GelMA/ECM生物墨水或GelMA/ECM/TGF-β3生物墨水，蓝光(405 nm)交联时间为20 s；喷头2为G60不锈钢喷嘴，内径400 μm，喷头温度为80 ℃，以5 mm/s打印PCL。打印丝间距为1.5 mm，层高为1.2 mm，平台成型温度为40 ℃，填充方式为十字交叉网格型。其中单纯PCL支架按照上述喷头2参数打印。
1.4.3 3D生物打印软骨支架的理化性质
大体观和微观结构：取PCL/GelMA/ECM支架，观察其大体形态，然后经过冷冻干燥以及真空喷金处理之后，在扫描电镜下观察其微观形态并采集照片。
组织学检测：将PCL/GelMA/ECM支架包埋于OCT包埋剂中，行冰冻切片(7 μm)，将切片于丙酮中固定20 min后，根据试剂盒说明书行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、番红-O染色、Ⅰ型胶原染色和Ⅱ型胶原染色。
生物化学检测：将统一规格的PCL/GelMA/ECM支架冷冻干燥后称质量，利用羟脯氨酸试剂盒检测支架中胶原蛋白的含量，利用GENMED细胞糖胺多糖总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测试剂盒检测糖胺聚糖含量。
生物力学检测：为了探究PCL/GelMA/ECM支架和单纯PCL支架生物力学特点，利用CMT5304-30KN型微机控制电子万能试验机对支架的压缩性能进行测试。将两种支架制备为长×宽×高为5 mm×5 mm×1.2 mm的统一规格，预压缩5%，压缩速率为4.5 mm/min，预压载荷0.8 N，压缩20个循环后进行正式测试，最大压缩10%，根据应力-应变曲线计算出压缩模量。每组重复5个样品。
缓释性能检测：取长×宽×高为5 mm×5 mm×1.2 mm的PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架，置于5 mL冻存管中，加入0.5 mL含有体积分数0.5%牛血清白蛋白的PBS溶液(pH=7.4)中，置于37 ℃恒温摇床上60 r/min振荡，分别于第1，2，3，7，14，21，28，35，50，60 天收集上清液。ELISA试剂盒检测上清液中缓释的TGF-β3量，计算支架中TGF-β3的累计释放率，所有样品独立重复3遍。
1.4.4 脂肪间充质干细胞的分离培养取4周龄新西兰大白兔 4只，按照文献[26]方法进行脂肪间充质干细胞的分离、培养和传代。在无菌条件下取兔膝关节髌下脂肪垫置于含有双抗的PBS溶液(pH=7.4)中，将其剪成1.0-2.0 mm3碎块，加入10倍体积的0.25%Ⅰ型胶原酶，置于细胞培养箱(37 ℃，体积分数5%CO2)中磁力搅拌消化1 h；后加入含体积分数15%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，经100目无菌滤器过滤，1 500 r/min离心5 min后弃去上清液，加入含体积分数15%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，移入25 cm2培养瓶，每二三天更换培养液。显微镜下观察，待细胞生长至80%-90%融合时进行传代，于细胞培养箱培养至P3代备用。使用流式细胞仪对其进行表面特异性抗原鉴定[27]。
1.4.5 3D打印PCL/GelMA/ECM支架CCK-8细胞毒性实验
支架浸提液的制备：依据国家ISO10993-12(2019)标准，将无菌的PCL/GelMA/ECM支架按照3 cm2/mL浸泡于含体积分数15%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，37 ℃孵育24 h后收集浸提液。
CCK-8检测：将P4代脂肪间充质干细胞按2 000个/孔接种于96孔板中，每孔100 μL，细胞黏附贴壁2 h后弃去含有体积分数10%胎牛血清的原培养基，分别更换为含有体积分数15%胎牛血清的DMEM/F12培养基(阴性对照)和PCL/GelMA/ECM支架浸提液，体积均为100 μL。培养1，4，7 d后弃去原培养基，PBS(pH=7.4)清洗2遍，然后每孔加入110 μL的含有10 μL CCK-8溶液和体积分数15%胎牛血清的DMEM/F12培养基，于细胞培养箱(37 ℃，体积分数5%CO2)内孵育2 h，最后在450 nm波长处检测吸光度A值。每组样品重复5次，结果取平均值。
1.4.6 3D打印PCL/GelMA/ECM支架细胞活性检测取P4代脂肪间充质干细胞，消化计数后分别种植于PCL/GelMA/ECM支架上(2×105/支架)，置于37 ℃培养箱中孵育2 h以待细胞贴壁，添加含有体积分数15%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，孵育1，4，7 d后进行死活染色，具体操作步骤参考说明书。无菌PBS轻柔清洗3次后吸净PBS，TCS-SP8共聚焦显微镜拍照观察。
1.4.7 3D打印PCL/GelMA/ECM支架细胞黏附和形态观察细胞接种方法同1.4.6，培养1，4，7 d后，PBS(pH=7.4)清洗2次，2.5%戊二醛固定支架4 h，弃液后PBS(pH=7.4)清洗2次，然后1%锇酸固定2 h，再次PBS(pH=7.4)清洗2次，分别用体积分数50%，70%，80%，90%，100%乙醇梯度脱水，每次脱水10 min，最后将样本轻粘于导电胶上，真空干燥后喷金，扫描电镜拍照观察。
1.4.8 3D打印PCL/GelMA/ECM支架免疫排斥反应与降解情况取健康SD大鼠6只，根据30-40 mg/kg剂量标准腹腔内注射20 g/L戊巴比妥钠，麻醉满意后常规背部备皮，术区消毒、铺单后，于背部取长约5 mm的切口，切开皮肤，游离皮下组织，然后将规格统一(长×宽×高为5 mm×5 mm×1.2 mm)且无菌的3D打印PCL/GelMA/ECM支架植入大鼠皮下。术后1，3周过量麻醉处死大鼠取材，标本使用40 g/L多聚甲醛固定后行苏木精-伊红染色，观察炎性细胞浸润与支架降解情况。
1.4.9 3D打印PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架募集效应检测利用Transwell小室检测PCL/GelMA/ECM支架和PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架对于脂肪间充质干细胞的募集能力，以DMEM/F12培养基为阴性对照。
在24孔板中插入Transwell小室，将两种支架加入下室中，随后取适量单纯DMEM/F12培养基加入上室和下室，放入37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱内孵育2 h。之后于上室中加入细胞(2×104个/室)，继续放入到37 ℃恒温箱中孵育24 h。用湿棉签擦除上室中未迁移的细胞，PBS(pH=7.4)洗涤后用40 g/L多聚甲醛固定迁移至下室的细胞20 min，然后用2 g/L结晶紫染色20 min。统计迁移的脂肪间充质干细胞数量，以每个孔的5个视野(放大倍数200)中的细胞平均数为迁移数据，利用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics，Bethesda，MD)来定量迁移的细胞。每组样品分别重复6次，细胞迁移数量取平均值。
1.5 主要观察指标 3D打印PCL/GelMA/ECM软骨支架的形态学、组织学、生物化学、生物力学、细胞相容性、免疫排斥反应，3D打印PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架的因子缓释性及其对脂肪间充质干细胞迁移的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行分析。数据以x±s表示，进行方差统计分析，组间采用独立样本t检验，两两比较采用Bonferroni检验，多组间采用单因素ANOVA分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

关节软骨损伤的治疗一直是临床医生面临的难题之一，再生医学的出现为软骨损伤修复治疗指明了新的方向[3]。内源性干细胞原位再生修复关节软骨需要经历3个阶段[10]：①首先是干细胞招募阶段：在自然条件下，损伤组织处需要大量干细胞富集，这些干细胞是用于损伤组织修复的主体细胞，但是在天然条件下往往无法实现足够的干细胞富集[29]；②其次是干细胞诱导分化阶段：在自然条件下，损伤部位富集的干细胞需要经过分化诱导才能再生修复损伤组织，一旦缺乏必要的诱导条件就无法再生修复损伤软骨组织；③最后是新生组织的成熟阶段：损伤软骨组织的成熟需要一定时间的积累和诱导微环境的维持，以促进功能性蛋白等分子和天然结构的再生，因此诱导微环境的维持是新生软骨组织成熟的重要保障，也是新生组织成熟的关键要素之一。实验依据招募内源性干细胞进行原位修复的3个关键要素，利用3D生物打印技术制备出PCL/GelMA/ECM软骨支架，并对其物理化学特性、安全性和生物相容性进行系统性表征，然后将TGF-β3负载到PCL/GelMA/ECM软骨支架中，探究因子缓释特性及其对兔脂肪间充质干细胞的募集作用。
天然脱细胞软骨ECM具有良好的亲水性、与天然软骨具有相似的生化成分，能够提供促进细胞附着、增殖和成软骨分化的微环境[30]。而GelMA作为一种广泛使用的生物材料，具有良好的生物相容性、可降解性、光固化性和温敏性[31-32]。实验充分结合二者优势，制备出具有可打印性的GelMA/ECM生物墨水，结合3D生物打印技术一体化打印PCL/GelMA/ECM软骨支架，通过扫描电镜观察可见，凝胶材料和PCL纤维交织成三维立体结构，相互结合紧密，且PCL形成的大孔内填充有疏松小孔的GelMA/ECM材料，合适的孔隙结构有利于细胞的迁移和黏附，这与之前的研究是一致的[15]。通过组织学染色、生物化学检测可以发现，3D打印PCL/GelMA/ECM支架具有一定量的Ⅱ型胶原和糖胺聚糖等特异性软骨ECM成分，与正常软骨相比胶原和糖胺聚糖含量相对较低，可能是由于3D打印PCL/GelMA/ECM支架中ECM成分质量较低导致的。实验中3D打印的PCL框架不但具有良好的力学性能，而且能够在体内缓慢降解，可以长期存在软骨损伤处为新生的软骨组织成熟提供合适的时间窗口[9，33]。生物力学检测结果提示，PCL/GelMA/ECM支架的压缩模量稍高于PCL支架，可能由于PCL纤维与凝胶成分紧密结合进一步提高了该支架的整体力学性能，并且两种支架的压缩模量与目前报道的人天然软骨弹性模量相当，有望在新生组织成熟过程中提供足够的力学支撑[28，33]。
实验重点探究了PCL/GelMA/ECM支架的生物相容性和体内植入后免疫排斥反应。CCK-8细胞毒性实验显示，支架浸提液组与阴性对照组的细胞数量随着培养天数增加而增加，说明该支架无细胞毒性；死活染色实验结果表明，细胞支架上培养1，4，7 d后活性良好，未见明显死细胞(红色荧光)，且活细胞(绿色荧光)数量不断增加，支架的生物相容性良好。同时，细胞与支架复合体共培养1，4，7 d的扫描电镜结果显示，脂肪间充质干细胞形态多变，能够很好地生长在支架表面，并且随着时间推移逐渐融合成片状，并分泌大量丝状或片状ECM。支架大鼠皮下免疫排斥反应实验显示，支架在植入早期会引起机体急性炎症反应，随着时间推移炎症反应逐渐减轻，说明该支架有较低的免疫原性。通过以上结果可以看出，3D打印PCL/GelMA/ECM支架无细胞毒性，同时具有良好的生物相容性和较低的免疫原性。
除了物理微环境，组织工程功能化支架的化学微环境对干细胞命运同样具有调控作用[18，34]。2010年LEE等[13]报道，负载有TGF-β3的 3D打印胶原/PCL支架可以增强内源性干细胞的迁移、黏附、增殖，成功再生兔肱骨关节面。LUO等[35]研究发现，体外TGF-β3联合机械生长因子可以协同增强人骨髓间充质干细胞迁移，并且TGF-β3/机械生长因子功能化的丝素蛋白支架能够在体内促进内源性干细胞的迁移和成软骨分化。因此，实验通过将TGF-β3负载到3D打印PCL/GelMA/ECM支架中，并在体外探究其因子缓释性能和对兔脂肪间充质干细胞迁移性的作用。体外缓释结果显示，生长因子在前1周呈现突释现象，其累计释放率约60%，在随后1-4周释放速度减缓，继而4-8周近似于线性缓慢释放，累计释放时间长达2个月。这种释放特征可以使得3D生物打印支架在损伤早期迅速募集大量内源性干细胞，后期缓慢线性释放生长因子可以维持一定数量干细胞的募集，为组织成熟和分化提供必要条件。体外募集效应检测结果表明，含有TGF-β3的3D打印PCL/GelMA/ECM支架能够显著增加干细胞的招募，这与课题组前期研究结果是一致的[36]。有趣的是，和阴性对照组相比，3D打印PCL/ GelMA /ECM支架具有一定促进脂肪间充质干细胞迁移的作用，这可能是ECM材料中存留有招募作用的活性分子[37]。因此，实验中引入的TGF-β3作为一种强效趋化性的生长因子有望实现体内干细胞的有效募集，在软骨原位再生募集阶段发挥着至关重要的作用。
综上所述，实验基于募集内源性干细胞原位修复软骨损伤的治疗理念，通过3D生物打印技术成功构建负载有TGF-β3 的PCL/GelMA/ECM支架，该支架具有良好的物理化学特性、生物相容性及低免疫原性，其优势在于理想的因子缓释性能，可以通过缓释生长因子发挥长效招募干细胞的作用。但仍需进行体外成软骨分化实验、体内干细胞原位招募实验，并进一步完善该3D打印支架的修复性能，以期弥补基于募集内源性干细胞进行软骨原位再生修复临床基础研究理论的不足。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

3D生物打印负载转化生长因子β3的软骨复合支架

Cartilage composite scaffold loaded with transforming growth factor beta 3 using three-dimensional bioprinting

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