转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系

doi:10.12307/2022.008

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (1): 45-51.doi: 10.12307/2022.008

• 造血干细胞 hematopoietic stem cells • 上一篇下一篇

转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系

杨腾云1，李彦林1，刘德健1，王国梁1，郑竹君2

昆明医科大学第一附属医院，1运动医学科，2康复科，云南省昆明市 650032

收稿日期:2020-12-02 修回日期:2020-12-05 接受日期:2021-01-29 出版日期:2022-01-08 发布日期:2021-10-23
通讯作者: 李彦林，博士，教授，昆明医科大学附属第一医院运动医学科，云南省昆明市 650032
作者简介:杨腾云，男，1993年生，重庆市人，汉族，昆明医科大学附属第一医院运动医学科在读硕士，主要从事骨关节损伤修复与重建研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81960409，81760403)，项目负责人：李彦林；云南省专家工作站项目(2018IC102)，项目负责人：李彦林；云南省骨关节疾病临床医学中心(ZX2019-03-04)，项目负责人：李彦林

Chondrogenic differentiation of peripheral blood-derived mesenchymal stem cells induced by transforming growth factor beta 3: a dose-effect relationship

Yang Tengyun1, Li Yanlin1, Liu Dejian1, Wang Guoliang1, Zheng Zhujun2

1Department of Sports Medicine, 2Department of Rehabilitation, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Received:2020-12-02 Revised:2020-12-05 Accepted:2021-01-29 Online:2022-01-08 Published:2021-10-23
Contact: Li Yanlin, MD, Professor, Department of Sports Medicine, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Yang Tengyun, Master candidate, Department of Sports Medicine, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81960409 (to LYL), No. 81760403 (to LYL); the Expert Workstation Project of Yunnan Province, No. 2018IC102 (to LYL); the Yunnan Province Clinical Center for Bone and Joint Diseases, No. ZX2019-03-04 (to LYL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

外周血源性间充质干细胞：从外周血中分离培养的间充质干细胞，其取材简单、创伤小、所致并发症少、不存在伦理学问题等，具有成骨、成脂、成软骨分化能力，已在体内外软骨组织工程实验中展现出良好的修复能力。

重复测量方差分析：在给予一种或多种因素处理后，分别在不同时间点上通过重复测量同一受试对象的实验指标，或者通过重复测量同一个个体不同部位或者组织的实验指标，分析前对数据间是否相关进行球形检验，根据其结果选择相应量表数据综合分析。

背景：随着软骨组织工程技术的发展，国内外已有应用外周血源性间充质干细胞修复软骨缺损的体外培养及动物实验，并取得了不错的进展，转化生长因子β3常被用于细胞体外培养以诱导间充质干细胞成软骨分化。但在实验应用中，很少涉及转化生长因子β3量效探讨，涉及量效的细胞培养实验又经常误用单因素方差分析或t 检验来分析这类资料。
目的：采用重复测量方法分析转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系，以期获得较佳的转化生长因子β3用量，获得较好的成软骨分化效果。
方法：动员、提取、培养滇南小耳猪外周血源性间充质干细胞，分别加入含不同质量浓度转化生长因子β3(25-500 μg/L)的成软骨诱导液进行成软骨诱导分化，对照组不作诱导处理，培养第2，4，6，8，10，12，14天，CCK-8法检测各组细胞增殖情况；培养第3，7，14，21天，收集各组细胞培养上清，ELISA法检测 Ⅱ型胶原水平；培养第21天，进行甲苯胺蓝染色观察聚集蛋白聚糖表达；培养第21天，进行免疫细胞化学染色观察 Ⅱ型胶原表达。

结果与结论：在25-500 μg/L范围内，转化生长因子β3质量浓度在40 μg/L时外周血源性间充质干细胞生长增殖能力最强，转化生长因子β3质量浓度在40，80 μg/L时更容易促进外周血源性间充质干细胞成软骨分化。

https://orcid.org/0000-0003-3224-6040(杨腾云)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 外周血源性间充质干细胞, 细胞因子, 转化生长因子β3, 重复测量, 软骨组织工程, Ⅱ型胶原, 聚集蛋白聚糖, 软骨修复

Abstract: BACKGROUND: With the development of cartilage tissue engineering technology, there have been in vitro culture and animal experiments on repairing cartilage defects with peripheral blood-derived mesenchymal stem cells, and good progress has been made. Transforming growth factor beta 3 is often used in cell culture in vitro to induce chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. However, in the experimental application, the dose-effect study of transforming growth factor beta 3 is rarely involved, and the cell culture experiments involving dose-effect often misuse one-way analysis of variance or t-test to analyze this kind of data.
OBJECTIVE: To analyze the dose-effect relationship of chondrogenic differentiation potency of peripheral blood-derived mesenchymal stem cells induced by transforming growth factor beta 3 by repeated measurement, in order to obtain a better dosage of transforming growth factor beta 3, and obtain a better effect of chondrogenic differentiation of peripheral blood-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: After mobilization, extraction and culture of peripheral blood-derived mesenchymal stem cells of Diannan small eared pigs, transforming growth factor beta 3 at different concentrations (25-500 μg/L) was added for chondrogenic differentiation or not added (control group). Cell proliferation in each group was detected by CCK8 assay at 2, 4, 6, 8, 10, 12 and 14 days. At 3, 7, 14 and 21 days of culture, the supernatant of each group was collected, and the level of type II collagen in the supernatant was detected by ELISA. At 21 day of culture, toluidine blue staining was used to observe the expression of the aggregated proteoglycan. At 21 days, immunocytochemical staining was performed to observe the expression of type II collagen.
RESULTS AND CONCLUSION: In the range of 25-500 μg/L, the proliferation ability of peripheral blood-derived mesenchymal stem cells was the strongest at the concentration of transforming growth factor beta 3 at 40 μg/L. The concentration of transforming growth factor beta 3 was more likely to promote the chondrogenic differentiation of peripheral blood-derived mesenchymal stem cells in 40 and 80 μg/L.

Key words: stem cells, peripheral blood derived mesenchymal stem cells, cytokines, transforming growth factor beta 3, repeated measurements, cartilage tissue engineering, collagen type II, aggrecan, cartilage repair

中图分类号:

杨腾云, 李彦林, 刘德健, 王国梁, 郑竹君. 转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 45-51.

Yang Tengyun, Li Yanlin, Liu Dejian, Wang Guoliang, Zheng Zhujun. Chondrogenic differentiation of peripheral blood-derived mesenchymal stem cells induced by transforming growth factor beta 3: a dose-effect relationship[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(1): 45-51.

图/表（结果） 8

2.1 PBMSCs形态学及鉴定结果
2.1.1 PBMSCs形态学培养1 d后，镜下可见散在短梭形、多角形细胞贴壁生长，3 d后换液将未贴壁细胞移除，7 d后短梭形及多角形贴壁细胞增多，培养10 d后可见贴壁细胞增多后呈集落样生长，见图1A，第1代细胞培养1 d后，大部分细胞贴壁呈梭形，少部分胞质内颗粒较多，折光性差，核不清楚的圆形细胞悬浮，更换培养液时被清除，约10 d后细胞贴满培养瓶壁，多为梭形，形态较一致，呈“鱼群状”，第2-5代细胞基本呈梭形，形态变化不明显，见图1B。

2.1.2 流式细胞仪分析结果流式细胞仪分析结果显示：CD44、CD90呈强阳性，细胞表面造血系标记CD34、CD45为阴性，符合间充质干细胞的生物学特性，见图2。

2.1.3 多向分化能力检测结果 PBMSCs在成骨诱导液作用
下，1周左右细胞开始聚集，增殖速度明显减慢，随后在镜下观察可见结节形成，细胞形态从长梭形逐渐转变为多角形，诱导至21 d时，茜素红染色显示有钙结节在胞浆内形成，见图3A；PBMSCs在成脂诱导液作用下，7 d后细胞体积、细胞核增大，诱导18 d后油红O染色可见脂滴在胞浆内形成，见图3B。此结果证明该细胞具有成骨、成脂多向分化能力。

2.2 转化生长因子β3促进PBMSCs成软骨诱导分化的作用
2.2.1 转化生长因子β3诱导后PBMSCs增殖曲线对照组未加入诱导液培养，其他实验组加入含不同质量浓度转化生长因子β3的诱导液之后，采用统计学两因素重复测量方差分析方法比较各组各时间段细胞活力值，结果如下：球形检验结果显示P < 0.05，证明实验数据不对称，应以“多变量检验结果”为此次研究最终结果。多变量检验结果显示：增殖时间效应显著(F=1 831.163，P < 0.001)，表明各实验组随培养天数的递增而出现明显变化；增殖时间*浓度分组交互效应显著(F=2.892，P < 0.001)，表明不同质量浓度转化生长因子β3组在不同时间的变化趋势也有显著差异；主体间检验结果显示浓度分组效应显著(F=266.276，P < 0.001)，表明细胞增殖随转化生长因子β3质量浓度的变化而出现明显变化。
各质量浓度转化生长因子β3组细胞生长曲线大致相似，与对照组各时间点相比差异均有显著性意义，随着培养时间延长，各组细胞生长曲线基本相似，大致呈“S”形，前期增长不明显，为细胞生长潜伏期，中期进入细胞对数生长期，差异逐渐增大，中后期达生长高峰，而后基本维持水平或下降，表明细胞进入凋亡期。
以上结果显示与对照组(不加入转化生长因子β3)相比，各质量浓度转化生长因子β3均能促进细胞生长，并且随质量浓度增加，细胞生长周期延长，较晚达到平台期；在2.5-40 μg/L时，随质量浓度增加PBMSCs生长增殖能力增强；在80-500 μg/L时，PBMSCs生长增殖能力又出现减弱，见表1，图4。

2.2.2 酶联免疫吸附法检测Ⅱ型胶原A1水平对照组未加入诱导液培养，其他实验组加入含不同质量浓度转化生长因子β3的诱导液之后，采用统计学两因素重复测量方差分析方法比较各组各时间段细胞培养上清中Ⅱ型胶原A1水平，结果如下：球形检验结果显示P > 0.05，证明此次研究数据对称，以“主体内效应检验结果”为此次研究最终结果。主体内效应检验结果显示：时间效应显著(F=3 425.986，P < 0.001)，表明各质量浓度转化生长因子β3组Ⅱ型胶原A1水平随培养天数的递增而出现明显变化；时间*浓度分组交互效应显著(F=42.395，P < 0.001)，表明不同质量浓度转化生长因子β3组在不同培养天数Ⅱ型胶原A1水平的变化趋势也有显著差异；主体间效应检验结果显示浓度分组效应显著(F=324.553，P < 0.001)，表明Ⅱ型胶原A1水平随转化生长因子β3质量浓度的变化而出现明显变化。
各组PBMSCs分化曲线基本相似，第一时点细胞处于增殖期，未见明显分化，与对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，从第二时间点开始，各组间差异逐渐显著，各组Ⅱ型胶原A1水平随培养时间的增长逐步递增。随着转化生长因子β3质量浓度增加，在7-14 d时Ⅱ型胶原A1水平增长较明显，在第14天后增长减缓，第21天时达到分化高峰，此时40，80 μg/L转化生长因子β3组Ⅱ型胶原A1水平差异无显著性意义(P > 0.05)，但明显优于其他质量浓度组。
以上结果表明，高于2.5 μg/L时转化生长因子β3均能促进PBMSCs分化，并且在5-40 μg/L范围有一定时间浓度依赖，随着转化生长因子β3质量浓度增高和培养时间延长，分化产生Ⅱ型胶原A1更多；80 μg/L转化生长因子β3促进
PBMSCs分化能力与40 μg/L相当，高于80 μg/L时促进PBMSCs
分化能力又减弱。各组相比较之下转化生长因子β3质量浓度在40，80 μg/L时更容易促进PBMSCs成软骨分化，见表2。

2.2.3 甲苯胺蓝染色结果成软骨诱导培养21 d，对照组蛋白聚糖弱表达；各质量浓度转化生长因子β3组均有不同程度蛋白聚糖表达，40，80 μg/L组有大量蛋白聚糖表达，染色明显稍强于其他组，见图5。

2.2.4 Ⅱ型胶原免疫组化染色结果成软骨诱导培养21 d，对照组黄染程度较低，各诱导组细胞胞浆内出现不同程度的黄染，其中40，80 μg/L组染色细胞数量和染色强度均明显高于其他组，见图6。
2.3 生物相容性 0-500 μg/L转化生长因子β3均能促进PBMSCs生长与分化，未出现明显细胞毒性，两者之间具有良好的生物相容性。

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引言

近年来，随着组织工程软骨修复领域的发展，间充质干细胞在修复软骨缺损方面显示出了较好的效果，有望成为软骨再生的候选者[1-3]。由于外周采血简便、更微创，所致并发症少，且不存在伦理学问题等优点，因此外周血源性间充质干细胞(peripheral blood mesenchymal stem cells，PBMSCs)非常适用于临床，具有良好的应用前景[4-5]。不仅如此，FU等[6]认为相比兔骨髓间充质干细胞，兔PBMSCs具有相似的生物学特性，甚至更强大的成软骨分化能力和更弱的成骨分化能力，这使得PBMSCs在软骨修复的组织工程学方面具有更强的优势；WANG等[7]也得出了相同的结论。
软骨的生长分化是一个复杂的生物过程，它通过细胞外多种信号分子调控、多种细胞因子参与、细胞与细胞间的多因素相互协同作用[8-10]。细胞因子是体外诱导间充质干细胞成软骨分化培养的重要成分。大多数前期研究证实了转化生长因子β3是诱导PBMSCs成软骨分化的潜在理想因子[11-14]，
其主要机制为转化生长因子β与特定的Ⅱ型受体结合，招募相应的Ⅰ型受体，启动一系列导致其特定受体Smads
(R-Smads)磷酸化的级联反应，然后转移至细胞核中，通过调节软骨相关基因Sox-9的表达，进而调节细胞的成软骨分化能力。一般来说，转化生长因子β信号依赖于Smad2和Smad3。此外，在软骨形成过程中，转化生长因子β信号也可以通过非特异性MAPK途径介导，如P38、JNK和ERK1/2信号途径[15-17]。相关信号通路基本清晰，在此不作深入研究，但有关转化生长因子β3用量的研究并不多，涉及量效的细胞培养实验经常误用单因素方差分析。该研究采用重复测量方法分析转化生长因子β3诱导PBMSCs成软骨分化的量效关系，以期获得较佳的转化生长因子β3用量，以便为后续应用于组织工程中产生较小的生物毒性作用和理想的体外修复效果。

材料方法

1.1 设计随机对照细胞实验，重复测量方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020年7至10月在昆明医科大学细胞工程研究中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 7月龄滇南小耳猪1只，体质量15 kg，雄性，一般情况良好，由昆明医科大学动物科提供，该实验经昆明医科大学伦理委员会审核通过(KMMU2020510)。
1.3.2 实验仪器超净工作台、超高速离心机、CO2培养箱(美国Thermo公司)；自动温控细胞培养箱(美国Corning公司)；流式细胞分析仪(EPICS-XLII，美国EPICS公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)；高压灭菌锅(上海华线医用核子仪器有限公司)；-20 ℃/-80 ℃低温冰箱(日本Sanyo公司)；数码照相机(日本Panasonic公司)。
1.3.3 实验试剂 PERCOLL细胞分离液(美国Sigma公司)；胰蛋白酶(美国Gibco公司)；肝素钠注射液 (江苏万邦生化医药股份有限公司)；DMEM/F12完全培养基、优质胎牛血清(美国Gibco公司)；鼠抗猪CD34、CD44、CD45、CD90抗体(美国BD公司)；MTT(美国AMRESO公司)；EDTA(美国CXBIO公司)；噻唑蓝(美国Gibco公司)；间质干细胞成骨分化诱导液、二甲基亚砜(美国Sigma公司)；间质干细胞成脂分化诱导液、茜素红、油红O(广州赛业科技有限公司)；粒细胞集落刺激因子(杭州九源基因公司)；CXCR4趋化因子受体拮抗剂AMD3100(美国Sigma公司)；转化生长因子β3(美国Preprotech公司)；Ⅱ型胶原抗体(博奥森)；Ⅱ型胶原A1酶联免疫检测试剂盒(Mlbio公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 滇南小耳猪PBMSCs动员根据课题组前期研究方法[18]，采用粒细胞集落刺激因子+AMD3100动员滇南小耳猪外周血：按每日20 μg/kg连续5 d经耳缘静脉注射粒细胞集落刺激因子，第5天同时按5 mg/kg经耳缘静脉注射AMD3100，2 h后用肝素化采血管抽取前腔静脉血20 mL。
1.4.2 PBMSCs分离、培养及传代培养采用课题组前期研究方法[18]，在超净台内用等量的PBS将采集的外周血标本稀释2倍，并缓慢将其混匀备用。取密度为1.073 g/L的Percoll淋巴细胞分离液6 mL加入到15 mL离心管中，将6 mL稀释好的外周血按1∶1比例沿离心管壁慢慢加入到Percoll淋巴细胞分离液中，2 000 r/min离心25 min，离心完毕，均匀吸取离心管内第一层与第三层之间的灰白色雾状层单核细胞于新的离心管中，加入PBS洗涤3次，每次5 min，取细胞沉淀，用8 mL含体积分数为15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基重悬，接种至25 cm2细胞培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱培养，接种后72 h半量换液，以后每隔
2 d换液1次，弃去未贴壁细胞及死细胞，每日倒置显微镜观察细胞生长状态，待细胞长至80%密度时进行传代。
1.4.3 PBMSCs的鉴定
(1)流式细胞仪检测：采用课题组前期研究方法[18]，收集第3代生长状态良好的细胞，用PBS(含1%胎牛血清蛋白)清洗细胞3次，计数细胞，重悬细胞后流式细胞仪检测表面标记CD90、CD45、CD44、CD34的表达。
(2)成骨分化：采用课题组前期研究方法[18]，PBMSCs铺于6孔板(细胞爬片)，细胞浓度为1×109 L-1，每孔接种105个细胞，细胞融合达80%以上，弃掉原培养基，更换新鲜培养基，加入成骨诱导剂(包含10-8 mol/L地塞米松+10 mmol/L
β-甘油磷酸钠+50 mg/L维生素C)，3 d换液1次，培养21 d后进行茜素红染色，观察结果并拍照。
(3)成脂分化：采用课题组前期研究方法[18]，PBMSCs铺于6孔板(细胞爬片)，细胞浓度为1×109 L-1，每孔接种105个细胞，细胞融合达80%以上，弃掉原培养基，更换新鲜培养基，加入成脂诱导剂(包含10-6 mol/L地塞米松+
5×10-4 mol/L IBMX+10 mg/L胰岛素+ 2×10-4 mol/L吲哚美辛)，3 d换液1次，培养18 d后进行油红O染色，观察结果并拍照。
1.4.4 转化生长因子β3促进PBMSCs成软骨诱导分化实验分9组：对照组，PBMSCs不作诱导处理；2.5，5，10，20，40，80，160，500 μg/L转化生长因子β3组，PBMSCs用不同质量浓度转化生长因子β3进行成软骨诱导分化。细胞铺于6孔板，细胞浓度为1×109 L-1，每孔接种105个细胞，每组3个重复，进行Ⅱ型胶原染色，收集培养上清采用酶联免疫吸附法检测Ⅱ型胶原A1水平；细胞铺于96孔板，细胞浓度为2.5×107 L-1，每孔接种2 500个细胞，CCK-8法检测细胞增殖情况，每组3个重复；细胞铺于24孔板，内含细胞爬片，细胞浓度为2×108 L-1，每孔接种104个细胞，每组3个重复，进行甲苯胺蓝染色。
当PBMSCs融合达80%左右时，弃去原培养基，更换新鲜培养基，加入成软骨诱导剂(50 mg/L维生素C+100 nmol/L地塞米松+100 mg/L丙酮酸钠+50 g/L ITS(胰岛素、人转铁蛋白、亚硒酸)+5.35 mg/L亚油酸+不同质量浓度的转化生长因子β3+1.25 μg/L胎牛血清蛋白)，隔3 d换液1次，培养第2，4，6，8，10，12，14天，CCK-8法检测各组细胞增殖情况；培养第3，7，14，21天，收集各组细胞培养上清，酶联免疫吸附法检测上清液中Ⅱ型胶原A1水平；培养第21天，进行甲苯胺蓝染色，观察聚集蛋白聚糖表达；培养第21天，进行免疫细胞化学染色，观察Ⅱ型胶原表达。
1.5 主要观察指标 ①光镜下观察PBMSCs生长形态；②通过CCK-8法检测细胞增殖活力，了解细胞增殖情况；③收集各组细胞培养上清，酶联免疫吸附法测定上清液中Ⅱ型胶原A1水平；④通过甲苯胺蓝染色强度，观察聚集蛋白聚糖表达；⑤通过免疫细胞化学染色强度，观察Ⅱ型胶原表达。
1.6 统计学分析所有实验数据均以x±s表示，应用统计学软件SPSS 22.0，采用重复测量方差分析行统计学处理，以α=0.05为检验水准，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

年龄增长、劳损、创伤、先天关节解剖异常等可引起慢性退行性关节疾病，如骨关节炎、类风湿关节炎，导致人体大关节(髋关节、膝关节、肘关节，尤其是膝关节)的软骨全层退化[19]。对于轻度至中度骨关节炎，临床上的保守疗法通常包括非类固醇抗炎药和其他口服镇痛药、减肥、物理治疗和运动。如果症状得不到有效缓解，采用非手术有创治疗，如皮质类固醇注射、透明质酸衍生物和其他生物活性注射剂注射[2]。然而，关节软骨组织缺乏血管、神经、淋巴等组织，软骨细胞数量有限，加之结构损伤和普遍的炎症环境，均使软骨修复和关节功能恢复受限[3]。
随着组织工程研究领域的发展，应用间充质干细胞修复软骨缺损显示出了较好的效果。目前国内外学者对于骨髓、脂肪等来源间充质干细胞的研究较为成熟，研究也已进展至临床治疗试验中[20-22]。近年对PBMSCs研究发现，由于其取材时操作简单、创伤小、所致并发症少，且不存在伦理学问题等优点成为组织工程领域的理想种子细胞[4-5]。该研究采用课题组前期研究方法[18]，动员滇南小耳猪外周血后，经采血、密度梯度离心法成功分离提取出PBMSCs，经过细胞原代培养及传代培养，细胞呈“鱼群样”生长，符合间充质干细胞形态学特征。经流式细胞学鉴定，细胞表面造血系标记CD34、CD45呈阴性，而CD44、CD90强阳性，符合间充质干细胞的生物学特性。多向分化潜能结果显示在成骨、成脂诱导液作用下，能向骨和脂肪分化。以上结果证实成功提取并培养出PBMSCs。
间充质干细胞成软骨分化是一个由多种信号因子共同参与的复杂过程，受多种信号转导途径调控，形成复杂的转录网络[23]。而间充质干细胞要分化成稳定的透明软骨，需要在适当的时间内加入适当剂量的细胞因子，以诱导软骨生成，并维持软骨表型，转化生长因子β被证明是软骨细胞内蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成的有效刺激因子[9]。
THIELEN等[24]报道了转化生长因子β在软骨形成早期大量表达，转化生长因子β1、转化生长因子β3主要表达在增殖区，且转化生长因子β3表达量高于其他转化生长因子β，而转化生长因子β2主要表达于增生肥大区，说明表明转化生长因子β1、转化生长因子β3在软骨形成中扮演重要角色。RIM等[25]研究表明转化生长因子β1、β2和β3均能诱导人间充质干细胞成软骨分化，但转化生长因子β3诱导形成的软骨微球更多，且糖胺聚糖和Ⅱ型胶原含量也更多。然而BIANCHI等[11]实验结果显示转化生长因子β1、转化生长因子β3在体外实验中有相似效果，而后选用转化生长因子β3诱导软骨细胞分化，结果显示能形成连续的软骨层。两项研究的结果差异可能来源于培养的细胞不同和使用的因子剂量不同。目前在有关软骨分化实验中，应用较多的仍为转化生长因子β3，质量浓度通常为10 μg/L。郭宇鹏等[26]使用1，2.5，5 μg/L转化生长因子β3进行体外诱导肌腱干细胞分化，结果发现高质量浓度长时间处理会促进肌腱干细胞向软骨分化。RUHL等[27]使用质量浓度为0.5-25 μg/L
的转化生长因子β3诱导间充质干细胞成软骨分化，结果显示质量浓度大于5 μg/L组诱导效果明显高于低质量浓度组。在预实验中，转化生长因子β3以常用质量浓度10 μg/L
为中心，设置在2.5-40 μg/L范围，得出了随浓度增高，PBMSCs成软骨分化效果更好。然后将质量浓度范围增大至2.5-160 μg/L，并设置500 μg/L组，实验结果表明对比不加入转化生长因子β3，加入后能明显促进PBMSCs生长分化，并且转化生长因子β3在5-40 μg/L范围有一定时间浓度依赖，随着质量浓度增高和培养时间延长，分化产生Ⅱ型胶原A1更多。在该实验中，转化生长因子β3在5-40 μg/L范围有一定时间、浓度依赖，随着质量浓度增高和培养时间延长，分化产生转化生长因子β3更多；80 μg/L转化生长因子β3促进PBMSCs分化能力与40 μg/L
组相当，高于80 μg/L组促进PBMSCs分化能力又减弱，表明40，80 μg/L转化生长因子β3能在更长时间段诱导PBMSCs分化产生更多Ⅱ型胶原A1，成软骨分化效果更佳。KRÜGER等[28]在软骨修复实验中报道了50-250 μg/L甚至是500 μg/L转化生长因子β3的大范围质量浓度均能促进软骨修复，但大于900 μg/L转化生长因子β3则会产生毒副作用，造成骨赘生成，滑膜增生等。相比之下，该实验选取的质量浓度相对较小，所以相关高质量浓度所产生的量效结果还需进一步实验证实。该实验为体外实验，故无法对骨赘生成、滑膜增生等毒副作用进行评估。
该实验采用重复测量统计，将时间、质量浓度两个因素均考虑在内，证明了两因素之间存在交互作用。该实验结果为之后的细胞实验提供了一个质量浓度选择参考区间，可有效减少细胞因子本身具有的生物毒性，也避免了细胞因子资源使用的浪费。该研究的不足之处是对于其他来源间充质干细胞是否具有同等量效不得而知。而且，目前成软骨诱导分化实验中，倾向于多种因子共同诱导，所以涉及多细胞因子叠加后的量效关系还需进一步探讨研究。另外，还缺乏相应的体内实验来对其加以证实。
综上所述，在0-500 μg/L范围内，转化生长因子β3能有效促进PBMSCs增殖和分化，质量浓度在40 μg/L时PBMSCs
生长增殖能力增强，质量浓度在40，80 μg/L时更容易促进PBMSCs成软骨分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系

Chondrogenic differentiation of peripheral blood-derived mesenchymal stem cells induced by transforming growth factor beta 3: a dose-effect relationship

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