与对照组比较，实验组ATDC5细胞内Ⅱ型胶原表达显著增加(P < 0.05)，表明褪黑素可刺激ATDC5细胞增殖；与对照组比较，实验组p-AMPK蛋白表达升高(P < 0.05)，AMPK蛋白无明显变化(P > 0.05)，表明褪黑素促进ATDC5细胞增殖通路p-AMPK通路；与对照组比较，实验组褪黑素受体基因1B的蛋白表达升高(P < 0.05)，褪黑素受体基因1A的蛋白表达比较无明显变化(P > 0.05)，表明褪黑素刺激ATDC5细胞后激活褪黑素受体基因1B受体而不是褪黑素受体基因1A。综上，褪黑素刺激ATDC5细胞后激活褪黑素受体1B，通过AMPK通路促进ATDC5细胞的增殖。

ATDC5细胞是一种小鼠软骨细胞系，最早在1990年由ATSUMI等[1]从小鼠畸胎瘤细胞AT805中分离得到。作为前软骨细胞株，ATDC5细胞的分化过程与软骨形成过程十分相似，因而被广泛用于体外模拟软骨分化过程。迄今为止，ATDC5细胞已被用于大约300项研究[2]，目前ATDC5细胞的应用主要集中在骨性关节炎的研究中[3]。

青少年特发性脊柱侧凸畸形是一类多发于女性青春期、无其他骨骼发育畸形且畸形进展迅速的脊柱三维畸形的总称。临床研究发现，青少年特发性脊柱侧凸畸形患者的畸形进展速度与青春期长骨的生长发育速度呈正相关[4]；同时人体测量学研究结果显示，该类患者的矫正身高及臂展均明显长于正常同龄青少年[5]，由于矫正身高与臂展主要是由长骨的生长来决定，因此患者软骨内成骨活性异常已成为目前研究该类疾病发病机制的重点。目前在青少年特发性脊柱侧凸的细胞学研究中，使用较多的主要是人类软骨细胞，然而由于脊柱生长板获取条件极为苛刻，因而目前的研究中大多使用髂骨嵴上提取的软骨细胞。即便如此，由于家长们担心髂骨软骨细胞的提取可能对青少年产生创伤，加之伦理的限制，从髂骨中提取软骨细胞仍然存在较大困难，极大地限制了青少年特发性脊柱侧凸的研究。因而，寻找适合代替人软骨细胞的细胞对于推动青少年特发性脊柱侧凸的研究具有重大意义。目前尚无学者将ATDC5细胞用于青少年特发性脊柱侧凸的研究。

目前关于褪黑素信号通路的研究主要集中于褪黑素受体的研究中，但仍有其他信号通路可能参与褪黑素信号通路的传导。AMPK是一种异源三聚体αβγ复合物，可作为能量稳态的中心调节剂，在多种疾病的发生发展中发挥重要作用[6]。AMPK与褪黑素同样关系密切，褪黑素通过调控AMPK通路参与肿瘤[7]、心血管损伤[8-9]、坏死性结肠炎[10]、糖尿病并发症等多种疾病[11]。

因此，此次实验尝试使用ATDC5细胞重复褪黑素刺激的相关实验，观察实验结果与文献报道褪黑素刺激人软骨细胞的结果是否符合，从而验证使用ATDC5细胞代替人软骨细胞用于青少年特发性脊柱侧凸研究的合理性，并进一步检测褪黑素刺激软骨细胞后褪黑素受体及信号通路的改变，从而发现褪黑素刺激ATDC5细胞增殖的机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   体外细胞实验，组间比较采用独立样本t检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年5月至2021年5月在南京医科大学免疫学系实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   细胞   小鼠软骨细胞系ATDC5购买自凯基生物。
1.3.2   主要试剂及仪器   褪黑素(货号M5250)购自美国Sigma公司；DMEM/F12培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；HL-1培养基购自中国凯基生物；MTT(货号0793)购自美国Amersco公司；蛋白裂解液(货号89900)购自美国Thermo公司；BCA试剂盒(货号P0006)购自中国碧云天公司；Ⅱ型胶原抗体(货号28459-1-AP)购自Proteintech公司；小鼠褪黑素受体基因1A抗体(货号NBP3-03633)、褪黑素受体基因1B抗体(货号NLS932)均购自美国Novus Biologicals公司；小鼠AMPK抗体(货号5831S)、p-AMPK抗体(货号50081S)、GAPDH抗体(货号5174S)均购自美国Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔二抗购自美国EarthOx Life Sciences；ECL发光液(货号36208ES76)购自中国羿圣公司；6孔板(货号3516)、96孔板(货号3599)均购自美国Corning Incorporated公司；酶标仪(ELx800，美国)购自BioTek公司；蛋白印迹发光系统(货号5200)购自中国天能公司。
1.4   实验方法   
1.4.1   细胞培养   将ATDC5细胞置于含体积分数5%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养基中，于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养，每2 d换液一次。待细胞密度长至75%，使用含胰岛素铁硒传递蛋白的HL-1培养基继续培养，诱导分化，培养72 h后形成复层生长。

1.4.2   MTT法检测ATDC5细胞增殖率   将ATDC5细胞接种于96孔板中，接种密度2×10⁴/孔，待生长至复层生长细胞后，分为9组，对照组不给予刺激，其余8组给予不同浓度(10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10，10^-11，10^-12  mol/L)褪黑素刺激。72 h后每孔分别加入20 μL MTT溶液，于培养箱中继续孵育4 h后，每孔加入DMSO 150 μL，振荡反应10 min使沉淀溶解，用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度值。实验重复3次，取平均值。

细胞增殖率=(实验组吸光度值-对照组吸光度值)/对照组吸光度值
1.4.3   蛋白免疫印迹检测   将ATDC5细胞接种于96孔板中，接种密度2×10⁴/孔，待生长至复层生长细胞后，分组培养：对照组不给予褪黑素刺激，实验组给予10-5  mol/L的褪黑素刺激。培养24 h后，采用免疫印迹法检测褪黑素受体及AMPK通路的蛋白表达。使用含有蛋白磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液裂解ATDC5细胞，提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白质浓度。60 V电压电泳浓缩胶→120 V电压电泳分离胶→ 300 mA转膜1 h→5%脱脂奶粉中封闭1 h→加入Ⅱ型胶原抗体、p-AMPK抗体、AMPK抗体、褪黑素受体基因1A抗体、褪黑素受体基因1B抗体、GAPDH抗体(稀释比均为1∶1 000)， 4 ℃孵育过夜→PBS中洗涤3次，每次5 min→加入兔二抗(稀释比为1∶5 000)室温孵育1 h→PBS中洗涤3次，每次5 min →ECL发光液A液和B液1∶1混合→化学发光成像系统曝光。所有结果重复3次，取平均值。
1.5   主要观察指标   不同浓度褪黑素对ATDC5细胞增殖的影响，以及10^-5  mol/L褪黑素对ATDC5细胞褪黑素受体及AMPK通路的蛋白表达的影响。
1.6   统计学分析   运用SPSS 13.0软件包进行独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经南京医科大学生物统计学专家审核。
1.7   出版规范   该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

青少年特发性脊柱侧凸畸形是脊柱侧凸中最常见的一种类型，是一种包括冠状面侧弯、矢状面失衡和水平位旋转的三维畸形的总称[12]。目前对于青少年特发性脊柱侧凸的治疗主要是观察随访、佩戴支具及矫形治疗，然而这些治疗方法均有不小的弊端，观察随访无法控制脊柱侧凸进展，佩戴支具给青少年带来了沉重的心理负担，而手术矫形虽然效果显著，然而手术创伤较大且价格较为昂贵[13]。因此，从病因学角度研究青少年特发性脊柱侧凸畸形可以对该病做到早期发现、早期干预，具有极大的临床和社会意义。在青少年特发性脊柱侧凸的细胞实验中，研究者使用的大多是人原代软骨细胞，然而由于人原代软骨细胞提取条件极为苛刻，需要从青少年的髂骨中提取，对青少年是一种创伤，同时可能影响青少年最终的身高发育，因而能够取得髂骨并提取原代软骨细胞进行研究的研究团队少之又少，给青少年特发性脊柱侧凸的研究带来了极大障碍。而ATDC5细胞作为目前应用广泛的小鼠软骨细胞系，可以反映软骨形成的完整过程，因而研究是否可以使用ATDC5细胞代替人软骨细胞进行青少年特发性脊柱侧凸研究具有极其重大的意义。

褪黑素是最先被发现与青少年特发性脊柱侧凸发病相关的神经内分泌激素[14]。早在1959年，THILLARD等[14]发现鸡的松果体切除后出现了类似人类特发性脊柱侧凸的脊柱改变。随后，MACHIDA等[15-17]进一步证实了这一发现松果体的主要功能是分泌褪黑素，松果体切除必然会直接导致褪黑素水平的降低，因而，研究者推测褪黑素的降低与青少年特发性脊柱侧凸的发病存在关联，并在随后的多项研究中证实了这一推测[18-19]。而褪黑素在青少年特发性脊柱侧凸研究中的重点主要在软骨细胞上。朱锋等[20]发现褪黑素可有效促进正常软骨细胞增殖，但无法促进青少年特发性脊柱侧凸患者软骨细胞增殖。此次实验结果同样显示，褪黑素刺激可促进ATDC5细胞增殖，且ATDC5细胞增殖率与褪黑素浓度成正相关；同时发现褪黑素刺激ATDC5软骨细胞后，ATDC5细胞增殖率与文献中报道的相同浓度褪黑素刺激人原代软骨细胞的增殖率基本一致，提示在青少年特发性脊柱侧凸的研究中可使用ATDC5小鼠软骨细胞代替人原代软骨细胞，从而解决由于伦理限制等原因带来的人原代软骨细胞获得困难的问题。

根据朱锋等[20]的研究，褪黑素可刺激正常软骨细胞增殖，无法促进青少年特发性脊柱侧凸患者软骨细胞增殖，提示青少年特发性脊柱侧凸软骨细胞内褪黑素信号传导通路存在异常。褪黑素在体内发挥生理作用，主要是通过激活2个G蛋白偶联受体MT1(褪黑素受体基因1A)和MT2(褪黑素受体基因1B)完成[21]。根据以往文献报道，褪黑素信号在青少年特发性脊柱侧凸中发挥作用主要是通过褪黑素受体基因1B受体[22]，而不是褪黑素受体基因1A[23-24]。此次实验在ATDC5细胞中检测了褪黑素刺激后褪黑素受体基因1A及褪黑素受体基因1B受体的表达，发现褪黑素刺激后，褪黑素受体基因1A受体表达无明显差异，褪黑素受体基因1B表达则显著升高，进一步验证了褪黑素通过褪黑素受体基因1B受体在青少年特发性脊柱侧凸中发挥作用。 

除了褪黑素受体基因1B异常外，研究者仍在探究褪黑素信号传导通路中是否存在其他异常，从而导致青少年特发性脊柱侧凸的发病。 AMPK通路与褪黑素信号传导的密切联系已在许多疾病中得到证实[7-11]。此次实验研究了褪黑素刺激ATDC5细胞后AMPK通路蛋白的表达，发现褪黑素刺激后总AMPK蛋白无明显变化，磷酸化AMPK蛋白表达显著提高，提示AMPK通路在褪黑素信号传导异常中发挥着重要作用，从而为褪黑素信号通路传导异常导致青少年特发性脊柱侧凸的发病提供了新的思路。

实验仍存在以下缺陷：①只研究了褪黑素刺激后的ATDC5细胞增殖率，在未来的研究中还需要进一步验证瘦素等其他青少年特发性脊柱侧凸的可能致病因素刺激ATDC5细胞后增殖率与人软骨细胞是否存在差异，从而进一步研究是否可以使用ATDC5细胞代替人软骨细胞进行青少年特发性脊柱侧凸研究。②研究了褪黑素刺激后褪黑素受体1A、褪黑素受体基因1B及AMPK通路的表达，但未研究这两种受体或AMPK通路表达增高或降低对ATDC5细胞增殖的影响。在未来的研究中，课题组还将对上述问题进行进一步研究，从而进一步完善褪黑素及其信号传导通路在青少年特发性脊柱侧凸中的作用。

此次实验结果显示，褪黑素可促进小鼠软骨细胞系ATDC5增殖，其增殖率与相同浓度褪黑素刺激人软骨细胞类似，提示存在使用小鼠软骨细胞系ATDC5代替人软骨细胞进行研究的可能性。
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文题释义：
ATDC5细胞：是一种小鼠软骨细胞系，最早在1990年由ATSUMI等从小鼠畸胎瘤细胞AT805中分离得到。作为前软骨细胞株，其分化过程与软骨形成过程十分相似，因而被广泛用于体外模拟软骨分化过程。迄今为止，ATDC5细胞已被用于大约300项研究。
褪黑素：是一种主要由松果体在夜间分泌的激素，在调节人体多种生理活动中发挥着重要作用。关于褪黑素在青少年特发性脊柱侧凸畸形中的作用，最早由MACHIDA和DUBOUSSET发现，他们发现切除孵化不久小鸡的松果体后会出现类似人类脊柱侧凸的畸形，而将松果体植入松果体切除的小鸡体内则可以阻断脊柱侧凸畸形的发生发展，提示褪黑素在青少年特发性脊柱侧凸的发生发展中发挥了重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

首次提出在青少年特发性脊柱侧凸研究中使用小鼠软骨细胞ATDC5代替人软骨细胞的可能性，并进一步探究了褪黑素促进软骨细胞增殖可能的信号通路。

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