2.1   正常ATDC5细胞及转染后ATDC5细胞的观察   ATDC5细胞贴壁7 d后呈梭形、三角形、椭圆形或类圆形，细胞核呈圆形或椭圆形，见图1。当ATDC5细胞中转染不携载或携载SIRT1基因的慢病毒后表达绿色荧光，见图2。







2.2   ATDC5细胞中基因芯片检测前总RNA质检    按照Thermo NanoDrop 2000 1.7< A260 nm/A280 nm <2.2及Agilent 2100 Bioanalyzer RIN≥7.0和28S/18S>0.7的标准进行质检，6张芯片(3张对照组、3张实验组)的总RNA均质检合格，见表1，2及图3。扫描后的芯片原始数据图见图4。















2.3    ATDC5细胞基因芯片探针分布情况   通过观察ATDC5细胞转染不携载或携载SIRT1基因的慢病毒后信号值分布曲线，可以看到所有芯片探针的表达值分布统计情况，信号值分布曲线的重合度越好表示芯片实验的可靠性越高，此次实验中对照组及实验组6张基因芯片结果都非常可靠，见图5。



2.4   ATDC5细胞中SIRT1基因敲减后被显著激活的信号通路   通过生物信息学分析发现，当ATDC5细胞中SIRT1基因敲减后，共有42条信号通路被显著激活，见表3。



2.5   ATDC5细胞中SIRT1基因敲减后导致细胞退变的信号通路中相关因子变化情况   通过基因芯片检测后的生物信息学分析结合前人研究文献，选择了42条信号通路中与软骨细胞退变相关并且前人研究较少的5条信号通路中部分相关因子的表达情况进行分析，这5条通路分别为肝细胞生长因子信号通路、神经调节因子信号通路、胰岛素受体信号通路、趋化因子受体4信号通路及肌动蛋白细胞骨架信号通路，通路中部分差异变化因子的表达情况见表4-8。

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软骨细胞是软骨组织中的主要细胞[1]，单个分布，呈椭圆形，可以分泌软骨特异性的基质如Ⅱ型胶原等[2]，成熟的软骨细胞多2-8个为一群，分布于软骨组织的软骨陷窝中，构成同一个母细胞分裂而成的同源软骨细胞群。软骨组织的退行性变化多由于软骨细胞及其中基质退变引起，软骨细胞的衰老、肥大、炎症、凋亡等退变均可导致软骨组织退变[3-6]，进而出现骨关节炎、椎间盘退变、半月板退变等相关的疾病[7-9]。作者所在课题组前期对软骨细胞及软骨组织的退变进行了深入研究，发现Wnt/β-catenin、血管内皮生长因子/AKT、核因子κB等信号通路参与其中[10-12]，并对其退变机制进行了初步探讨；国内外其他研究者也发现MAPK、JAK/STAT、mTOR等信号通路也参与了软骨细胞及软骨组织的退变[13-15]。只有对软骨细胞退变的机制了解清楚后，才能更好地干预软骨细胞退变相关疾病，而这个机制研究是目前国内外研究的热点及焦点[16-18]，也是骨科领域亟待解决的问题。ATDC5细胞系是来源于小鼠胚胎瘤细胞AT805的一种可以表达软骨细胞特性的小鼠软骨细胞系，与原代软骨细胞相比，在实验中应用ATDC5细胞的优势在于其可以多次传代、培养条件简单，能够满足研究软骨细胞退变相关疾病的功能及机制[19-20]。在此细胞系的基础上，作者所在课题组成功建立了沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)基因表达降低的ATDC5细胞模型[21]，并发现当SIRT1基因敲减后ATDC5细胞的成软骨增殖分化降低，凋亡加速[10]，为相关研究奠定了基础。

SIRT1基因是一个与机体衰老、能量代谢、细胞周期调控关系密切的Ⅲ型去乙酰化酶基因[22-24]，在哺乳动物中研究深入[25]，主要位于细胞核中，在翻译后水平调控各种靶蛋白的表达进而影响机体的功能，该基因位于人类10号染色体，编码500个氨基酸残基构成的蛋白质。该基因可以被白藜芦醇、漆树黄酮等物质激活[26-27]，从而引起SIRT1蛋白上调，在DNA损伤修复、维持线粒体功能、调控炎症中起到重要作用[28-30]。在前期研究中作者发现，SIRT1基因敲除可以通过SREBP2介导的PI3K/AKT信号通路加重软骨细胞退变相关疾病骨关节炎的发生发展[31]；而使用携载白藜芦醇的聚乳酸-明胶纳米支架修复软骨损伤过程中SIRT1蛋白的表达量明显升高[32]。由此可知，SIRT1基因在软骨细胞退变相关疾病中起重要的作用。

基因芯片又称为DNA微阵列，是一种专门用于机体核酸检测的生物芯片，能够通过高度集成化的方法高通量分析机体核酸的变化情况，属于早期并且比较成熟的测序方法[33]。通过基因芯片可以大规模筛选出某个因素影响下与正常情况中所有差异编码RNA的变化情况，进而发现新颖的因子或通路，为相关疾病的研究提供线索[34]。

在此次研究中，通过携载SIRT1基因的慢病毒转染ATDC5小鼠软骨细胞系，造成ATDC5细胞中SIRT1基因表达降低，之后通过小鼠来源的基因芯片高通量筛选SIRT1基因敲减后ATDC5细胞中与软骨细胞退变相关的信号通路及因子变化情况，从中选择了被激活的42条信号通路进行描述，并总结前人研究较少的与软骨退变相关的5条信号通路中相关因子的基因表达情况，从而为相关研究提供靶通路及靶因子。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   体外细胞学实验，样本之间采用独立样本t检验分析。
1.2   时间及地点   实验于2015年1月至2021年5月在上海吉凯基因科技有限公司及北京大学深圳医院完成。
1.3   材料
1.3.1   实验细胞   ATDC5小鼠软骨细胞系购自南京科佰生物科技有限公司；293T细胞购自上海细胞所；Top10 感受态细胞购自Genechem公司。实验过程遵循了本地及国家法规。
1.3.2   主要试剂   Aligent RNA 6000 Nanokit 购自Aligent公司；GeneChip 3’ IVT Express Kit、GeneChip Hybridization Wash and Stain Kit 购自Affymetrix公司； 胰酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司；D-Hanks由上海吉凯基因技术有限公司提供；DMEM购自Coning公司；Puromycin购自Clontech公司；胎牛血清购自Ausbian公司。
1.3.3   主要仪器   Nanodrop 2000购自Thremo公司；Aligent 2100购自Aligent公司；GeneChip Hybridization Oven 645、GeneChip Fluidics Station 450、GeneChip Scanner 3000 购自Affymetrix公司；离心机购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；倒置显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司；荧光显微镜购自奥林巴斯公司；生物安全柜购自上海振样创空空气净化设备有限公司；CO2培养箱购自日本SANYO公司。
1.4   实验方法   
1.4.1   携载SIRT1基因的慢病毒转染ATDC5细胞及分组   取复苏后计数为(3-5)×107 L-1 ATDC5细胞悬液2 mL接种于6孔板，待细胞浓度达20%时进行转染；细胞分为2组，即对照组(转染携载阴性对照慢病毒的ATDC5细胞组)和实验组(转染携载SIRT1基因慢病毒的ATDC5细胞组)；感染复数(MOI)为50，感染条件为Normal+Polybrene，具体转染方式及SIRT1基因表达情况检测可参照作者所在课题组前期文章[10]。
1.4.2   ATDC5细胞中基因芯片检测前总RNA质检   提取样品总RNA，Nanodrop 2000测浓度及A260 nm、A280 nm值；Aligent 2100仪器分析总RNA的完整性：试剂室温30 min，样品及RNA ladder冰敷；550 μL RNA 6000 Nano gel matrix 于离心管中1 500×g室温离心10 min准备胶；1 μL dye加入65 μL胶中混匀13 000×g室温离心10 min；芯片中加9 μL gel-dye mix；样品孔及RNA Lddder孔加入5 μL RNA 6000 Nano maker；Ladder孔加入1 μL变性ladder，2100仪器检测；2011 Expert分析数据。
1.4.3   ATDC5细胞中基因芯片检测   

(1)3’IVT反应：稀释的poly-A RNA与总RNA混合；配制一链合成反应液后加入poly-A RNA/总RNA mix，按照扩增程序进行一链cDNA合成；配制二链合成反应液后加入一链合成产物，按照扩增程序进行二链cDNA合成；配制IVT(体外反转)反应液，加入二链合成产物，按照扩增程序进行IVT获得带有生物素标签的aRNA；用GeneChip 3’ IVT Express Kit内的纯化试剂纯化上一步的aRNA，并用Nanodrop 2000测定浓度；将配制好的aRNA片段化反应液加入纯化的aRNA，按照扩增程序进行片段化；配制杂交反应液，按照扩增程序进行杂交，加入130 μL预杂交液于45 ℃杂交炉杂交10 min，除掉预杂交液后加入130 μL杂交液于45 ℃、60 r/min杂交16 h，用GeneChip Fluidics Station 450仪器自动洗染，扫描后获得数据并进行生物信息学分析。

(2)扩增程序：2 h、42℃，后4℃维持，进行第一链cDNA合成；1 h、16 ℃，后10 min、65 ℃，后4 ℃维持，进行第二链cDNA合成；16 h、40 ℃，后4 ℃维持，进行IVT；35 min、94 ℃，后4 ℃维持，进行片段化；10 min、98 ℃，后3 min、45 ℃，后45 ℃维持，进行杂交。 
1.5   主要观察指标   ATDC5细胞中SIRT1基因敲减后与未敲减组相比，显著激活的软骨细胞退变相关信号通路情况及通路中产生差异因子的核酸表达情况。
1.6   统计学分析   文章统计学方法已经北京大学深圳医院生物统计学专家审核。全部计量资料采用x±s表示，样本之间采用独立样本t检验分析，采用SPSS 21.0进行数据分析，P < 0.05为差异有显著性意义，Z-score>2为通路被显著激活。

软骨细胞退变可以引起多个骨科常见疾病，如骨关节炎、椎间盘退变、半月板退变等[7-9]，SIRT1基因是一个与衰老、炎症关系密切的基因[22，30]。在软骨细胞中，当SIRT1基因敲减后，可以通过靶信号通路和靶因子的作用导致软骨细胞退变，应用基因芯片这种高通量的测序方法，结合生物信息学分析，可以筛选出多条新颖的信号通路，从而为相关研究提供实验基础。在此次实验中，通过慢病毒转染小鼠软骨细胞系ATDC5，将该细胞中SIRT1基因敲减，在此基础上通过基因芯片检测导致ATDC5细胞退变的信号通路，并对其中显著激活的信号通路进行总结，并结合前人研究，分析了其中部分被激活通路中靶因子的表达情况，从而为研究软骨细胞退变相关疾病提供靶点。

此次研究发现，当ATDC5细胞中SIRT1基因敲减后，共有42条信号通路被显著激活，具体见表3，选择了其中研究比较少的与软骨细胞退变相关的5条信号通路进行深入讨论，包括肝细胞生长因子信号通路、神经调节因子信号通路、胰岛素受体信号通路、趋化因子受体4信号通路、肌动蛋白细胞骨架信号通路，并对其中产生变化的部分因子进行了核酸层面的检测，具体见表4-8。TONOMURA等[35]总结前人研究发现，肝细胞生长因子是一种多功能的生长因子，广泛表达于骨和关节组织中，对于细胞的增殖存活、神经营养、基质代谢、炎症有重要作用，并与骨关节炎、椎间盘退行性变的病理生理相关。而在骨关节炎中，应用干细胞治疗骨关节炎时，可以通过分泌肝细胞生长因子等诱导软骨的内源性再生[36]。SHI等[37]研究证实，神经调节因子4缺乏可以加重软骨破坏及软骨炎症，并导致体内软骨细胞凋亡，而恢复神经调节因子4可以逆转这些变化，在体外使用小鼠重组神经调节因子4抑制软骨细胞的炎症和凋亡，减少细胞外基质的降解。CINQUE等[38]则证实，胰岛素受体底物1在成纤维细胞生长因子信号诱导下可在软骨细胞中起到作用，从而影响软骨生长和骨矿化。也有学者证实，胰岛素样生长因子1在软骨细胞肥大中起到重要的作用[39]。KUMAR 等[40]发现，趋化因子受体4属于特异性药理学抑制剂可抑制软骨细胞受体，从而减轻骨关节炎。而在一些罕见的疾病中，如碱性腺嘌呤尿症患者的软骨细胞中细胞骨架蛋白发生退化，从而与这类罕见病的发生相联系[41]。LEE等[42]也通过研究猪骨关节炎发现，钙离子作用于F-肌动蛋白细胞骨架，从而影响到骨关节炎的进展。由此可知，肝细胞生长因子信号通路、神经调节因子信号通路、胰岛素受体信号通路、趋化因子受体4 信号通路、肌动蛋白细胞骨架信号通路 5条信号通路均可以通过软骨细胞退变参与骨科疾病的发生发展中。与此同时，5条信号通路均能受到SIRT1基因的影响。DING等[43]发现，肝细胞生长因子可以通过激活SIRT1/FOXO1信号通路改善自然衰老期间的卵巢功能；GU等[44]证实，重组人神经调节蛋白1β可以通过ErbB2-ERK-SIRT1信号通路保护心肌免受辐射损伤；CHEN等[45]实验观察到Corylin可以通过激活SIRT-1和β3-AR降低肥胖和胰岛素抵抗，促进脂肪组织褐变；也有学者认为，Ghrelin能够通过SIRT1/AMPK轴诱导淋巴细胞白血病细胞系自噬和趋化因子受体4表达[46]；而且SIRT1可以通过损伤足细胞中Cortactin的去乙酰化维持肌动蛋白细胞骨架[47]。但是软骨细胞中，SIRT1基因通过肝细胞生长因子 信号通路、神经调节因子信号通路、胰岛素受体信号通路、趋化因子受体4 信号通路、肌动蛋白细胞骨架信号通路影响骨科疾病的研究却鲜有报道，作者通过基因芯片发现SIRT1基因敲减后，ATDC5细胞中这5条信号通路相关的部分因子的差异变化情况，如肝细胞生长因子信号通路中ETS1、PIK3CA、NRAS、PIK3C2A、FGFR2、ELF1、FGFR3、CDKN1A、AKT3、FRS2、PRKD3、MAP3K2因子的变化，神经调节因子信号通路中RPS6KB1、STAT5A、MTOR、BTC、HBEGF、RNF41因子的变化，胰岛素受体信号通路中TSC1、EIF4EBP1、PRKAR2B、PPP1R12A、TSC2因子的变化，趋化因子受体4信号通路中PAK4、EGR1、RHOJ、RHOB、PLCB1、GNG5因子的变化，肌动蛋白细胞骨架信号通路中ABI2、BRK1、PIP4K2B、MYLK、IQGAP1、ARPC1A、ACTA2、EZR、SSH2、ACTG1、IQGAP3因子的变化，这些通路及因子可能会通过前述相关疾病中对软骨细胞的增殖存活、分化凋亡、基质代谢、炎症、物质矿化、细胞表型改变或细胞骨架的变化影响到软骨相关疾病的进展，当然具体机制需要进一步研究进行证实，作者的研究初步发现了SIRT1基因敲减后这些信号通路及因子的变化情况，从而可以为后人研究提供便利。

当然，此次研究也有一定的局限性：首先，缺乏qRCR及Western blot检测，从而无法在mRNA和蛋白层面说明相关因子的变化是否与基因芯片检测结果相同；其次，所用的细胞为细胞系，与原代细胞有所区别；而且细胞中的研究也与动物中的研究有区别，这些都是需要进一步进行实验验证的地方。

综上所述，通过携载SIRT1基因的慢病毒转染ATDC5小鼠软骨细胞系，造成ATDC5细胞中SIRT1基因表达降低后，采用基因芯片检测发现了ATDC5软骨细胞中被显著激活的42条信号通路，并发现了其中与软骨细胞退变关系密切且研究较少的5条信号通路中部分差异因子的变化情况，这为进一步研究软骨细胞退变相关疾病奠定了基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
沉默信息调节因子1基因：是一个具有高度保守核心序列的Ⅲ型去乙酰化酶基因，位于人类10号染色体，编码500个氨基酸残基构成的蛋白质，在机体衰老、能量代谢、细胞周期调控中起到重要作用。
基因芯片：又称为DNA微阵列，是一种专门用于机体核酸检测的生物芯片，能够通过高度集成化的方法高通量分析机体核酸的变化情况。
ATDC5小鼠软骨细胞系：是由小鼠胚胎瘤细胞AT805衍生而来的一种与原代软骨细胞性状相似的小鼠软骨细胞系。
软骨细胞退变相关疾病：是由于软骨细胞发生衰老、肥大、炎症、凋亡等一系列变化而引起的相关疾病，如骨关节炎、椎间盘退变等。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

基因芯片又称为DNA微阵列，是一种专门用于机体核酸检测的生物芯片，能够通过高度集成化的方法高通量分析机体核酸的变化情况，属于早期并且比较成熟的测序方法。通过基因芯片可以大规模的筛选出某个因素影响下与正常情况中所有差异的编码RNA的变化情况，进而发现新颖的因子或通路，为相关疾病的研究提供线索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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