骨关节炎中铁死亡的生物信息学分析与实验验证

doi:10.12307/2023.437

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (17): 2637-2643.doi: 10.12307/2023.437

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骨关节炎中铁死亡的生物信息学分析与实验验证

李哲1，袁长深2，官岩兵1，徐文飞2，廖书宁1，容伟明1，梅其杰2，段戡2

1广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530000；2广西中医药大学第一附属医院四肢骨伤科，广西壮族自治区南宁市 530023

收稿日期:2022-05-31 接受日期:2022-07-05 出版日期:2023-06-18 发布日期:2022-10-20
通讯作者: 袁长深，硕士，副主任医师，广西中医药大学第一附属医院四肢骨伤科，广西壮族自治区南宁市 530023
作者简介:李哲，男，1993年生，汉族，山东省滨州市人，广西中医药大学在读硕士，主要从事骨关节退变与缺血性疾病的防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82060875)，项目负责人：袁长深；国家自然科学基金(82160912)，项目负责人：段戡；广西中医药大学自然科学研究项目(2019QN022)，项目负责人：袁长深

Bioinformatic analysis and experimental validation of ferroptosis in osteoarthritis

Li Zhe1, Yuan Changshen2, Guan Yanbing1, Xu Wenfei2, Liao Shuning1, Rong Weiming1, Mei Qijie2, Duan Kan2

1Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Orthopedic Department of the Limbs, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2022-05-31 Accepted:2022-07-05 Online:2023-06-18 Published:2022-10-20
Contact: Yuan Changshen, Master, Associate chief physician, Orthopedic Department of the Limbs, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Li Zhe, Master candidate, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, Nos. 82060875 (to YCS) and 82160912 (to DK); Natural Science Research Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. 2019QN022 (to YCS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
铁死亡：在二价铁或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡，是一种铁依赖性的新型细胞程序性死亡方式。
骨关节炎：由多种因素引起关节软骨纤维化、皲裂、溃疡及脱失，以关节疼痛为主要症状的退行性关节疾病，严重影响患者生活质量，预计到2030年将有4亿骨关节炎患者，给家庭与社会造成巨大的经济负担。

背景：靶向铁过载基因调节铁死亡或许是一种较快且有效延缓骨关节炎退变的方法，但目前对骨关节炎铁死亡相关分子机制及基因靶点尚不清楚。
目的：通过生物信息学分析铁死亡在骨关节炎中的关键基因和途径，结合体外实验验证骨关节炎中铁死亡标记基因，探讨铁死亡在骨关节炎中的潜在作用。
方法：以“Osteoarthritis”为检索词，通过GEO数据库检索2010-01-01/2021-01-01的公开数据，筛选得到基因微阵列数据集GSE55235，对GSE55235数据集进行数据矫正后分析获得差异表达基因；利用FerrDb数据库检索得到铁死亡相关基因与GSE55235数据集差异表达基因作交集，对交集基因作基因本体(Gene Ontology，GO)与京都基因和基因组数据库富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)并绘制蛋白质-蛋白质相互作用网络，获得骨关节炎铁死亡HUB基因，筛选出铁死亡标记基因；将正常人软骨细胞设为对照组、人软骨细胞骨关节炎模型设为实验组，采用实时荧光定量PCR对两组铁死亡标记基因的mRNA表达进行验证。
结果与结论：①共获得36个骨关节炎铁死亡基因，GO富集分析表明其主要参与氧化应激反应、皮质类固醇反应、类固醇激素反应、对糖皮质激素的反应和活性氧的代谢等过程；②针对产生超氧化物的NAD(P)H氧化酶及氧化还原酶活性、血红素结合、四吡咯结合中发挥作用；③KEGG富集分析表明骨关节炎铁死亡基因主要参与NOD样受体、白细胞介素17、缺氧诱导因子1、肿瘤坏死因子及叉头盒O类(FoxO)等信号通路；④构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，进一步分析获得血管内皮生长因子A、白细胞介素6、JUN、PTGS2和DUSP1等5个骨关节炎铁死亡HUB基因，筛选出血管内皮生长因子A、白细胞介素6、PTGS2和DUSP1等4个铁死亡标记基因，体外实验证实其在对照组(正常人软骨细胞)与实验组(细胞骨关节炎模型)中有显著差异(P < 0.05)；⑤上述数据显示，铁死亡可能通过氧化应激、氧化还原及诱导炎症等作用于骨关节炎，机制上可能与缺氧诱导因子1等信号通路刺激NAD(P)H有关；血管内皮生长因子A、白细胞介素6、PTGS2和DUSP1可作为骨关节炎铁死亡的生物标志物。

https://orcid.org/0000-0002-0142-7933(李哲)；https://orcid.org/0000-0001-5749-9859(袁长深)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 铁死亡, 基因, 信号通路, 生物信息学, 软骨细胞, 细胞实验, 生物标志物, 氧化应激, 炎症

Abstract: BACKGROUND: Regulating ferroptosis by targeting iron overload genes may be a fast and effective way to delay the degeneration of osteoarthritis. However, the molecular mechanisms and gene targets related to ferroptosis in osteoarthritis are still unclear.
OBJECTIVE: To analyze the key genes and pathways of ferroptosis in osteoarthritis by bioinformatics analysis, verify the marker genes of ferroptosis in combination with in vitro experiments, and explore the potential role of ferroptosis in osteoarthritis.
METHODS: “Osteoarthritis” was used as a keyword. Relevant public data from the GEO database between January 1, 2010 and January 1, 2021 were retrieved. A gene microarray dataset GSE55235 was yielded and differentially expressed genes were identified after data correction analysis of the GSE55235 data set. Ferroptosis-related genes retrieved by the FerrDb database were intersected with differentially expressed genes in the GSE55235 dataset, and th intersected genes were used for Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis and the protein-protein interaction network was mapped. Ferroptosis-related HUB genes in osteoarthritis were obtained and ferroptosis marker genes were then selected. Human chondrocytes were divided into control group (normal human chondrocytes) and experimental group (cellular osteoarthritic model). The mRNA expression of ferroptosis marker genes in the two groups was detected by quantitative real-time fluorescence PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 36 ferroptosis-related genes in osteoarthritis were obtained. Gene Ontology enrichment analysis showed that these differentially expressed genes were mainly involved in oxidative stress, corticosteroids response, steroid hormone response, glucocorticoid response, and reactive oxygen metabolism, and play a role in NAD(P)H oxidase and oxidoreductase activity, heme binding, and tetrapyrrole binding that produce superoxides. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis showed that ferroptosis-related genes in osteoarthritis were mainly involved in NOD-like receptor, interleukin-17, hypoxia-inducible factor-1, tumor necrosis factor, forkhead box transcription factor class O. After constructing the protein-protein interaction network, ferroptosis-related HUB genes, including vascular endothelial growth factor A, interleukin-6, JUN, PTGS2, DUSP1, were identified. Four ferroptosis marker genes, including vascular endothelial growth factor A, interleukin-6, PTGS2, and DUSP1, were selected. In vitro experiments confirmed significant differences between the control and experimental groups (P < 0.05). The overall findings indicate that ferroptosis may act on osteoarthritis through oxidative stress, redox and induced inflammation, which may be related to NAD(P) H stimulation by signaling pathway such as hypoxia-inducible factor 1. Vascular endothelial growth factor A, interleukin-6, PTGS2, and DUSP1 can be used as biomarkers of ferroptosis in osteoarthritis.

Key words: osteoarthritis, ferroptosis, gene, signaling pathway, bioinformatics, chondrocyte, cellular experiment, biomarker, oxidative stress, inflammation

中图分类号:

李哲, 袁长深, 官岩兵, 徐文飞, 廖书宁, 容伟明, 梅其杰, 段戡. 骨关节炎中铁死亡的生物信息学分析与实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(17): 2637-2643.

Li Zhe, Yuan Changshen, Guan Yanbing, Xu Wenfei, Liao Shuning, Rong Weiming, Mei Qijie, Duan Kan. Bioinformatic analysis and experimental validation of ferroptosis in osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(17): 2637-2643.

图/表（结果） 9

2.1 差异表达基因的筛选对GSE55235数据集中的20例滑膜样本表达数据进行差异分析，筛选符合校正后的P < 0.05和|LogFC|>1的差异基因，共得到941个差异基因，包括346个上调基因和595个下调基因。基因表达火山图见图1，基因表达热图见图2。

2.2 骨关节炎与铁死亡相关基因通过FerrDb数据库获得铁死亡相关基因259个，与GSE55235数据集分析所得差异基因相交集共获得36个骨关节炎铁死亡基因，见图3。

2.3 GO和KEGG富集分析结果通过对筛选出的36个骨关节炎铁死亡基因进行功能注释得知，生物过程中主要参与氧化应激反应、皮质类固醇反应、类固醇激素反应、对糖皮质激素的反应及活性氧的代谢过程；细胞成分显示其主要存在于NADPH氧化酶复合物、顶端质膜、氧化还原酶复合物、细胞顶端及核周内质网；分子功能上，其在产生超氧化物的NAD(P)H氧化酶活性，氧作为受体时作用于NAD(P)H的氧化还原酶活性、血红素结合及四吡咯结合，作用于NAD(P)H的氧化还原酶活性中发挥作用，见图4。

KEGG富集分析表明骨关节炎铁死亡基因主要参与NOD样受体信号通路、白细胞介素17信号通路、缺氧诱导因子1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路及FoxO信号通路，同时也在卡波西肉瘤相关的疱疹病毒感染及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路中发挥作用，见图5。

2.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建利用STRING数据库构建交集基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络，通过Cytoscape将其优化并可视化，剔除孤立节点，网络由28个节点，有98条边组成，平均局部聚类系数0.531，PPI富集P < 0.01，见图6。

2.5 筛选铁死亡HUB基因文章根据“Degree”“MNC”“EPC”等3种方法筛选出PPI网络中前5个节点基因并作交集作为铁死亡HUB基因，结果表明3种方法计算所得前5个节点基因相同，为血管内皮生长因子A、白细胞介素6、JUN、PTGS2和DUSP1，使用“Degree”方法进行可视化，见
图7。

2.6 骨关节炎铁死亡标记基因的表达结果将铁死亡HUB基因与FerrDb数据库中铁死亡标记基因相交集，获得血管内皮生长因子A，白细胞介素6，PTGS2和DUSP1是骨关节炎铁死亡标记基因，见图8。

2.7 体外细胞基因表达验证结果实时荧光定量PCR结果表明，血管内皮生长因子A、白细胞介素6、PTGS2和DUSP1在对照组与实验组中具有显著差异(P < 0.05)，见图9。

参考文献

[1] STOCKWELL BR, JIANG X, GU W. Emerging mechanisms and disease relevance of ferroptosi. Trends Cell Biol. 2020;30(6):478-490.
[2] JIANG X, STOCKWELL BR, CONRAD M. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021;22(4):266-282.
[3] YAO X, SUN K, YU S, et al. Chondrocyte ferroptosis contribute to the progression of osteoarthritis. J Orthop Translat. 2020;27:33-43.
[4] TANG D, CHEN X, KANG R, et al. Ferroptosis: molecular mechanisms and health implications. Cell Res. 2021;31(2):107-125.
[5] GUO Z, LIN J, SUN K, et al. Deferoxamine alleviates osteoarthritis by inhibiting chondrocyte ferroptosis and activating the nrf2 pathway. Front Pharmacol. 2022;13:791376.
[6] ZHU H, YAN X, ZHANG M, et al. miR-21-5p protects IL-1β-induced human chondrocytes from degradation. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):118.
[7] 魏丽杰.降钙素对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞炎性反应的影响[D].唐山:河北联合大学,2014.
[8] MIAO Y, CHEN Y, XUE F, et al. Contribution of ferroptosis and GPX4’s dual functions to osteoarthritis progression. EBioMedicine. 2022;76: 103847.
[9] JI Q, ZHENG Y, ZHANG G, et al. Single-cell RNA-seq analysis reveals the progression of human osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2019;78(1):100-110.
[10] KUMAR S, ADJEI IM, BROWN SB, et al. Manganese dioxide nanoparticles protect cartilage from inflammation-induced oxidative stress. Biomaterials. 2019;224:119467.
[11] LEPETSOS P, PAPAVASSILIOU KA, PAPAVASSILIOU AG. Redox and NF-κB signaling in osteoarthritis. Free Radic Biol Med. 2019;132:90-100.
[12] ARRA M, SWARNKAR G, KE K, et al. LDHA-mediated ROS generation in chondrocytes is a potential therapeutic target for osteoarthritis. Nat Commun. 2020;11(1):3427.
[13] DEYLE GD, ALLEN CS, ALLISON SC, et al. Physical therapy versus glucocorticoid injection for osteoarthritis of the knee. N Engl J Med. 2020;382(15):1420-1429.
[14] KATZ JN, ARANT KR, LOESER RF. Diagnosis and treatment of hip and knee osteoarthritis: a review. JAMA. 2021;325(6):568-578.
[15] BENNELL KL, HUNTER DJ. Physical therapy before the needle for osteoarthritis of the knee. N Engl J Med. 2020;382(15):1470-1471.
[16] CHEN H, YU J, ZHANG J, et al. Monitoring metabolites using an NAD(P)H-sensitive polymer dot and a metabolite-specific enzyme. Angew Chem Int Ed Engl. 2021;60(35):19331-19336.
[17] FILAIRE E, TOUMI H. Reactive oxygen species and exercise on bone metabolism: friend or enemy? Joint Bone Spine. 2012;79(4):341-346.
[18] HOSSEINZADEH A, BAHRAMPOUR JUYBARI K, KAMARUL T, et al. Protective effects of atorvastatin on high glucose-induced oxidative stress and mitochondrial apoptotic signaling pathways in cultured chondrocytes. J Physiol Biochem. 2019;75(2):153-162.
[19] RAYEGAN S, DEHPOUR AR, SHARIFI AM. Studying neuroprotective effect of Atorvastatin as a small molecule drug on high glucose-induced neurotoxicity in undifferentiated PC12 cells: role of NADPH oxidase. Metab Brain Dis. 2017;32(1):41-49.
[20] KWOK SC, SAMUEL SP, HANDAL J. Atorvastatin activates heme oxygenase-1 at the stress response elements. J Cell Mol Med. 2012; 16(2):394-400.
[21] JAIKUMKAO K, PONGCHAIDECHA A, CHATTIPAKORN N, et al. Atorvastatin improves renal organic anion transporter 3 and renal function in gentamicin-induced nephrotoxicity in rats. Exp Physiol. 2016;101(6):743-753.
[22] HWANG HS, LEE MH, CHOI MH, et al. NOD2 signaling pathway is involved in fibronectin fragment-induced pro-catabolic factor expressions in human articular chondrocytes. BMB Rep. 2019;52(6): 373-378.
[23] YAN Z, QI W, ZHAN J, et al. Activating Nrf2 signalling alleviates osteoarthritis development by inhibiting inflammasome activation. J Cell Mol Med. 2020;24(22):13046-13057.
[24] MA D, ZHAO Y, SHE J, et al. NLRX1 alleviates lipopolysaccharide-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes by suppressing the activation of NF-κB signaling. Int Immunopharmacol. 2019;71:7-13.
[25] LIU Y, PENG H, MENG Z, et al. Correlation of IL-17 Level in Synovia and Severity of Knee Osteoarthritis. Med Sci Monit. 2015;21:1732-1736.
[26] BOUAZIZ W, SIGAUX J, MODROWSKI D, et al. Interaction of HIF1α and β-catenin inhibits matrix metalloproteinase 13 expression and prevents cartilage damage in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(19): 5453-5458.
[27] HU S, ZHANG C, NI L, et al. Stabilization of HIF-1α alleviates osteoarthritis via enhancing mitophagy. Cell Death Dis. 2020;11(6):481.
[28] WU Y, WANG J, ZHAO T, et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate exposure leads to ferroptosis via the HIF-1α/HO-1 signaling pathway in mouse testes. J Hazard Mater. 2022;426:127807.
[29] ANSARI MY, AHMAD N, HAQQI TM. Oxidative stress and inflammation in osteoarthritis pathogenesis: role of polyphenols. Biomed Pharmacother. 2020;129:110452.
[30] ZHANG J, FAN F, LIU A, et al. Icariin: a potential molecule for treatment of knee osteoarthritis. Front Pharmacol. 2022;13:811808.
[31] SHEN C, CAI GQ, PENG JP, et al. Autophagy protects chondrocytes from glucocorticoids-induced apoptosis via ROS/Akt/FOXO3 signaling. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(12):2279-2287.
[32] SERGI C, SHEN F, LIU SM. Insulin/IGF-1R, SIRT1, and FOXOs pathways-an intriguing interaction platform for bone and osteosarcoma. Front Endocrinol (Lausanne). 2019;10:93.
[33] HUANG Z, SHI X, LI X, et al. Network Pharmacology approach to uncover the mechanism governing the effect of simiao powder on knee osteoarthritis. Biomed Res Int. 2020;2020:6971503.
[34] MA L, ZHAO X, LIU Y, et al. Dihydroartemisinin attenuates osteoarthritis by inhibiting abnormal bone remodeling and angiogenesis in subchondral bone. Int J Mol Med. 2021;47(3):4855.
[35] HAMILTON JL, NAGAO M, LEVINE BR, et al. Targeting VEGF and its receptors for the treatment of osteoarthritis and associated pain. J Bone Miner Res. 2016;31(5):911-924.
[36] LIU Y, ZENG Y, SI HB, et al. Exosomes derived from human urine-derived stem cells overexpressing miR-140-5p alleviate knee osteoarthritis through downregulation of VEGFA in a rat model. Am J Sports Med. 2022;50(4):1088-1105.
[37] LATOURTE A, CHERIFI C, MAILLET J, et al. Systemic inhibition of IL-6/Stat3 signalling protects against experimental osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2017;76(4):748-755.
[38] MU Y, HAO W, LI S. Casticin protects against IL-1β-induced inflammation in human osteoarthritis chondrocytes. Eur J Pharmacol. 2019;842:314-320.
[39] WEN ZH, LIN YY, CHANG YC, et al. The COX-2 inhibitor etoricoxib reduces experimental osteoarthritis and nociception in rats: the roles of TGF-β1 and NGF expressions in chondrocytes. Eur J Pain. 2020; 24(1):209-222.
[40] NAKATA K, HANAI T, TAKE Y, et al. Disease-modifying effects of COX-2 selective inhibitors and non-selective NSAIDs in osteoarthritis: a systematic review . Osteoarthritis Cartilage. 2018;26(10):1263-1273.
[41] PENG HZ, YUN Z, WANG W, et al. Dual specificity phosphatase 1 has a protective role in osteoarthritis fibroblastlike synoviocytes via inhibition of the MAPK signaling pathway. Mol Med Rep. 2017;16(6):8441-8447.
[42] MAEKAWA A, SAWAJI Y, ENDO K, et al. Prostaglandin E2 induces dual-specificity phosphatase-1, thereby attenuating inflammatory genes expression in human osteoarthritic synovial fibroblasts. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2021;154:106550.
[43] JIANG W, JIN Y, ZHANG S, et al. PGE2 activates EP4 in subchondral bone osteoclasts to regulate osteoarthritis. Bone Res. 2022;10(1):27.

引言

骨关节炎是一种常见的退行性关节疾病。随着老龄化社会的到来，骨关节炎发病率不断上升，给人们的生活带来极大的不便，同时也不断加重社会经济负担。目前该病分子机制尚不清楚，尚无有效治疗手段。因此，深入探讨其发病机制，在骨关节炎早期进行预防和治疗至关重要。
细胞死亡是多细胞生物发育的基本特征，是退行性疾病的关键驱动因素[1]。铁死亡可能是最普遍、最古老的细胞死亡形式之一[2]，铁死亡参与骨关节炎进展，使用铁死亡抑制剂ferrostatin-1可调节Ⅱ型胶原的表达，缓解关节软骨退化，达到延缓骨关节炎进展的目的[3]。虽然铁死亡在骨关节炎中的作用机制不明确，但是使用靶向铁负荷基因或使用铁螯合剂却能有效抑制铁死亡[4]；GUO等[5]的也证实，使用铁螯合剂去铁胺可抑制软骨细胞铁死亡并促进核因子E2相关因子2
(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)抗氧化系统的激活，有效保护软骨细胞。靶向铁过载基因调节铁死亡或许是一种较快且有效延缓骨关节炎退变的方法，但目前对骨关节炎铁死亡相关分子机制及基因靶点尚不清楚。
生物信息学可多层次、多方面对疾病分子机制进行高效、直观地阐述，为基础医学研究提供大量的有效信息。对骨关节炎有关生物信息进行铁死亡相关分析及生物标志物的确立，可为骨关节炎提供有效的治疗潜力。文章通过对骨关节炎数据集进行生物信息学分析，筛选出骨关节炎铁死亡HUB基因(Ferroptosis Related Hub Gene，FRHG)及骨关节炎铁死亡标记基因，并采用实时荧光定量PCR进行基因表达验证，以期为从铁死亡方面治疗骨关节炎提供有效参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1   设计   生物信息学分析结合实验结果验证，独立样本t检验。
1.2   时间及地点   于2022-04-22/05-29在广西中医药大学及江西中洪博元生物技术有限公司完成。
1.3   资料   通过GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的GEO DataSets检索窗口进行检索，以“Osteoarthritis”为检索词，限制条目类型为DataSets，研究类型为Expression profiling by array，种属类型为homosapiens以及公开日期为2010-01-01/2021-01-01，得到GSE55235数据集。GSE55235数据集基于GPL96平台([HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array；Charité，Berlin，Germany)，包括10例健康关节的滑膜组织以及10例骨关节炎关节的滑膜组织，将其分别作为体外验证实验的对照组及实验组。
1.4   实验方法
1.4.1   筛选差异表达基因   使用R软件的Limma软件包(版本：3.40.2)对20例样本(对照组和实验组)的表达矩阵进行数据校正和分位数归一化，再利用高级的t检验分析并根据假设检验对P值进行校正，筛选出校正后P < 0.05和|logFC|>1的基因作为差异表达基因，并构建火山图。通过R软件pheatmap包构建热图。
1.4.2   骨关节炎与铁死亡相关基因   通过FerrDb(http://zhounan.org/ferrdb/)数据库检索获取铁死亡“Driver” “Suppressor”“Marker”等相关基因。将差异分析获得的差异表达基因与铁死亡相关基因进行交集，利用OmicStudio (https://www.omicstudio.cn/tool)作交集并绘制韦恩图，交集基因即为骨关节炎与铁死亡相关基因。
1.4.3   基因本体(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析设定过滤条件：P value Filter=0.05，Q value Filter=0.05，通过R软件“clusterProfiler”包对交集基因进行GO和KEGG富集分析，再利用ggplot2包对显著富集的结果分别进行可视化分析。
1.4.4   蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与模块分析   通过STRING (版本：11.5；https://cn.string-db.org/cgi/input.pl)数据库在线构建交集基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络，并设定筛选阈值为0.4，将孤立的节点剔除并对网络进行优化，获得交集基因蛋白质-蛋白质相互作用数据。使用Cytoscape 软件(3.8.2版本；www.cytoscape.org)对蛋白质-蛋白质相互作用数据进行可视化。
1.4.5   筛选铁死亡HUB基因   通过Cytoscape软件中的CytoHubba插件对PPI网络进行拓扑分析，使用“Degree” “MNC”“EPC”等3种方法筛选出前5个节点基因并作交集作为铁死亡HUB基因。
1.5   体外细胞实验和PCR检测   将人软骨细胞(CP-H107，普诺赛)分为对照组(正常人软骨细胞)、实验组(细胞骨关节炎模型)，对照组不作处理，实验组去细胞培养上清，用1×PBS洗2遍，加入体积分数0.25%胰酶(含积分数0.02% EDTA)消化，待细胞变圆加入培养基终止消化并收集细胞悬液至10 mL离心管中，1 000 r/min离心3 min，弃去上清液加入培养基重悬细胞，制备细胞悬液浓度为2×108 L-1，进行铺板处理。次日待细胞状态良好，加入白细胞介素1β(10 μg/L) 处理24 h模拟骨关节炎软骨细胞造模[6]，使用实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原蛋白的表达情况进行模型验证[7]，造模成功后实时荧光定量PCR检测血管内皮生长因子A、白细胞介素6、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)及双特异性磷酸酶1(DUSP1)的mRNA表达。
使用Trizon Reagent (CW0580S，CWBIO)从软骨细胞中提取总RNA，在50 ℃条件下保持15 min，然后转到85 ℃条件下保持5 s进行反转录反应，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Q711-02，Vazyme)在95 ℃ 10 min 1个循环，95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 40个循环反应程序下进行qPCR。使用β-actin作为内参，分别计算对照组及实验组ΔCt值，使用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。引物序列见表1。

1.6 主要观察指标基因信息学分结果及各组血管内皮生长因子A、白细胞介素6、PTGS2及DUSP1表达变化。
1.7 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计分析，所有实验重复3次，数据采用x±s表示，用独立样本t检验进行组间差异比较，P < 0.05则代表差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎是一种以软骨侵蚀、骨重塑异常和滑膜慢性低度炎症为特征的退行性关节疾病。目前该病发病机制尚不明确，药物治疗以缓解症状为主，不能有效截断疾病的进展。软骨细胞是关节软骨中惟一细胞类型，软骨细胞的存活对于维持关节软骨的完整性和关节内平衡至关重要[8]，明确软骨细胞在骨关节炎发病机制中的状态及探索新的特异性生物标志物仍是当前重要任务[9]。铁死亡是一种受调控的细胞死亡形式，系在二价铁或酯氧合酶的作用下催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡[4]。以往研究表明铁死亡参与骨关节炎进展[3]，但具体作用机制尚不清楚，靶向铁死亡或许能为骨关节炎提供新的有效治疗方法。文章从GEO数据库中获得骨关节炎表达基因，FerrDb数据库得到铁死亡相关基因，两者交集后获得骨关节炎的HUB基因，并进一步筛选其中的铁死亡标记基因进行实时荧光定量PCR验证，对铁死亡在骨关节炎中的作用机制进行初探，明确骨关节炎中铁死亡的特异性生物标志物。
FerrDb是世界上首个致力于铁死亡调节剂和铁死亡疾病的数据库，文章通过FerrDb数据库获得铁死亡相关基因259个，其中包括铁死亡驱动基因186个、抑制基因132个以及铁死亡标记基因113个。随后文章通过对GSE55235数据集20例滑膜样本数据进行差异分析，获得941个差异基因，包括346个上调基因和595个下调基因。将铁死亡相关基因与数据集分析所得差异基因相交集共获得36个骨关节炎铁死亡基因。
对筛选出的36个骨关节炎铁死亡基因进行功能注释，发现在生物过程中主要参与氧化应激反应、皮质类固醇反应、类固醇激素反应、对糖皮质激素的反应及活性氧的代谢等过程；氧化应激可导致细胞外基质降解、基质合成减少、关节炎症以及软骨细胞死亡和衰老，从而导致骨关节炎进展，已成为骨关节炎重要的治疗靶点[10]。活性氧在生理状态下发挥重要信号传导功能，但过度产生的活性氧是骨关节炎进展的重要介质[11]，被认为是骨关节炎致病因素之一[12]。关节内注射糖皮质激素[13]、皮质类固醇是治疗骨关节炎的常用方法[14]，在短期内疼痛缓解明显，但长期疗效却不尽人意[15]。因此，深入探讨骨关节炎铁死亡基因作用于骨关节炎的机制或许对提高骨关节炎临床疗效具有潜在帮助。
文章中细胞成分分析显示骨关节炎铁死亡基因主要存在于NADPH氧化酶复合物、顶端质膜、氧化还原酶复合物、细胞顶端及核周内质网中，这些基因所在细胞成分对从铁死亡方面来挖掘骨关节炎发病机制及干预治疗可能有帮助。分子功能上，其在产生超氧化物的NAD(P)H氧化酶活性、氧作为受体时作用于NAD(P)H的氧化还原酶活性、血红素结合、四吡咯结合及作用于NAD(P)H的氧化还原酶活性中发挥作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是能量代谢的核心酶辅助因子，其氧化和还原形式(NAD+和NADH)以及磷酸盐形式[NADP+和NAD(P)H]介导数百种酶催化的氧化还原反应[16]。过度刺激NAD(P)H导致氧化应激是活性氧过量产生的原因，而活性氧是细胞结构受损的重要介质[17]。软骨细胞的抗氧化防御能力可减少活性氧的有害影响，而当软骨细胞中抗氧化酶活性受损时，氧化应激诱导的软骨细胞死亡将会增加，导致软骨退化[18]。目前关于NAD(P)H对骨关节炎作用的认识相当有限，然而近期研究发现，阿托伐他汀可抑制NADPH氧化酶，导致氧化应激标志物的减少，还可增强抗氧化酶的活性及表达水平[19]，包括血红素加氧酶1及NAD(P)H氧化还原酶1等[20-21]；或许阿托伐他汀可通过靶向铁死亡作用于骨关节炎，这值得未来进一步研究。
KEGG富集分析表明骨关节炎铁死亡基因主要参与核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体信号通路、白细胞介素17信号通路、缺氧诱导因子1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、FoxO信号通路，同时也在卡波西肉瘤相关的疱疹病毒感染及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路中发挥作用。NOD是一种识别受体，可识别病原体和损伤相关的分子模式[22]。NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎性体是近年的研究热点，与骨关节炎滑膜炎症有关[23]。 NOD样受体X1(NLRX1)是炎症的关键调节因子，在骨关节炎中发挥抗炎作用，被认为是骨关节炎潜在治疗靶点[24]。白细胞介素17可能在骨关节炎发病机制中起关键作用，与疼痛密切相关，阻断白细胞介素17信号通路可能会缓解骨关节炎引起的疼痛[25]。低氧张力(缺氧)调节软骨细胞分化和代谢，而缺氧诱导因子1是发育过程中软骨细胞生长与存活的关键缺氧因子[26]。在缺氧条件下，缺氧诱导因子1可以通过线粒体自噬减轻软骨细胞的凋亡和衰老，延缓骨关节炎进展[27]。近期研究证实，可通过缺氧诱导因子1信号通路诱导铁死亡[28]。肿瘤坏死因子是一种强大的促炎因子，可与2种类型的受体结合，包括肿瘤坏死因子R1和肿瘤坏死因子R2，它们在软骨细胞和滑膜细胞的表面均有表达[29]，下调肿瘤坏死因子信号通路可减轻骨关节炎炎症[30]。叉头盒O类(FoxO)转录因子可通过调节自噬和防御氧化应激对软骨细胞具有保护作用[31]；在通路中，它们位于蛋白激酶B(AKT)的下游，对细胞存亡起着至关重要的作用[32]。有学者通过网络药理学等方法对骨关节炎治疗常用中药四妙散进行研究，发现四妙散可能通过调节糖尿病并发症中的AGE-RAGE、白细胞介素17、肿瘤坏死因子和缺氧诱导因子1信号通路发挥防治骨关节炎的作用[33]，
但其是否通过影响铁死亡作用于骨关节炎尚不得知。以上结果表明，骨关节炎铁死亡基因通过影响炎症及氧化应激等方面作用于骨关节炎，具体机制值得进一步研究。
利用STRING数据库构建骨关节炎铁死亡基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络，将网络优化后得到28个节点，98条边，平均局部聚类系数0.531，蛋白质-蛋白质相互作用富集P < 0.01，表明骨关节炎铁死亡基因之间相互作用关系密切且复杂，而后此次研究筛选出蛋白质-蛋白质相互作用网络中的HUB基因：血管内皮生长因子A、白细胞介素6、JUN、PTGS2及DUSP1作为铁死亡HUB基因，将铁死亡HUB基因与铁死亡标记基因相交集，得到血管内皮生长因子A、白细胞介素6、PTGS2及DUSP1基因，实时荧光定量PCR检测结果显示，血管内皮生长因子A、白细胞介素6、PTGS2及DUSP1在对照组、实验组中具有显著性差异。血管内皮生长因子A是血管生成的重要递质，通过调节血管内皮生长因子可影响血管生成作用于骨关节炎[34]，下调血管内皮生长因子信号则可抑制骨关节炎进展[35]。近期研究发现，过表达miR-140-5p的人脐带干细胞衍生的外泌体可以通过靶向血管内皮生长因子A来调节骨关节炎大鼠模型中的细胞外基质稳态和软骨下骨重塑，延缓骨关节炎进展[36]。白细胞介素6是一种多效性促炎细胞因子，作为骨关节炎发病机制中的重要细胞因子；虽可通过抑制白细胞介素6/Stat3通路延缓骨关节炎进展[37]，但其在骨关节炎中的机制知之甚少。PTGS2又名环氧合酶2，已被证实在骨关节炎中处于高表达状态[38]，环氧合酶2抑制剂能通过调节软骨细胞中转化生长因子β和神经生长因子表达来延缓骨关节炎进展[39]，是临床治疗骨关节炎的常用药物，甚至是指南推荐药物[40]。DUSP1作为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的负调节剂，具有抗炎特性，对骨关节炎滑膜细胞具有保护作用，低表达的DUSP1可能是诱导骨关节炎发生的原因之一[41]。前列腺素E2作为一种重要的脂质介质，也是环氧合酶2的产物，具有促进DUSP1表达的新生物活性[42]，对炎症及骨稳态等多种生物功能具有调节作用，在骨关节炎中发挥重要作用[43]。血管内皮生长因子A、白细胞介素6、PTGS2及DUSP1等铁死亡标记基因与骨关节炎关系密切，但他们之间的作用关系仍需进一步研究。
综上，文章利用生物信息学分析初探铁死亡作用于骨关节炎的机制，发现铁死亡可能通过氧化应激、氧化还原及诱导炎症等作用于骨关节炎，可能与缺氧诱导因子1等信号通路刺激NAD(P)H有关；通过实时荧光定量PCR验证证实血管内皮生长因子A、白细胞介素6、PTGS2及DUSP1可作为骨关节炎铁死亡的生物标志物。但文章仍存在局限之处，如生物信息学分析之数据较少，结果可能出现一定程度偏倚；此外，研究仅进行体外细胞实验，后期须行体内动物实验进行验证，结果将更具可信度。目前正迎来铁死亡和调节性细胞死亡研究的新时代，铁死亡生物学有着广阔的研究前景，通过干预与铁死亡相关的靶点基因及途径或许是治疗骨关节炎新的方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨关节炎中铁死亡的生物信息学分析与实验验证

Bioinformatic analysis and experimental validation of ferroptosis in osteoarthritis

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[1]	郭淑慧, 杨晔, 江杨洋, 许建文. 神经源性膀胱miRNA-mRNA调控网络的筛选与验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-8.
[2]	孙可欣, 曾今实, 李佳, 蒋海越, 刘霞. 力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.
[3]	方兴艳, 田侦丽, 赵哲仪, 文平, 谢婷婷. 亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞损伤及鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号轴的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.
[4]	农复香, 蒋志雄, 李英豪, 许文聪, 施智兰, 罗慧, 张晴朗, 钟爽, 唐梅文. 外泌体调控铁死亡在疾病诊断治疗中的应用与作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-10.
[5]	贺茜, 万瑀, 唐玉婷, 杨安宁, 吴凯, 焦运, 白志刚, 姜怡邓, 沈江涌. 铁死亡诱导剂抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-.
[6]	李晓敏, 田向东 , 谭冶彤 , 朱光宇 , 王荣田 , 王剑 , 薛志鹏, 马晟, 胡元一, 黄叶, 丁天送. 骨质疏松性内侧室膝骨关节炎胫骨高位截骨后下肢力线及膝关节功能的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1325-1329.
[7]	党祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹金, 熊山, 张顶梅, 王信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[8]	黄林科, 韦林华, 蒋捷, 刘倩, 陈蔚蔚. 雌激素与跑台运动干预卵巢切除模型小鼠骨量和关节软骨的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1166-1171.
[9]	阮凌, 王光华, 吴荣平, 晋战, 吕镇庆, 张楠, 李寿邦. 运动强度与高脂饮食模型大鼠脂代谢紊乱和氧化应激的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1149-1155.
[10]	张永强, 潘凤, 孙鹏, 谭明辉, 轩留明, 王勤章. Gja1基因重组慢病毒对糖尿病豚鼠膀胱病变模型中缝隙连接蛋白43蛋白及mRNA表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1161-1165.
[11]	赵璐, 赵逸菲, 高达, 刘艳芳, 付婷婷, 徐江雁. Zeste基因抑制子基因12在糖尿病肾脏病模型大鼠肾组织中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1179-1186.
[12]	聂晨晨, 苏凯奇, 高静, 凡勇福, 阮晓迪, 袁洁, 段昭远, 冯晓东. 环状RNA调控脑缺血发病的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1286-1291.
[13]	梁家琪, 刘恒旭, 阳金鑫, 杨椅, 邓旭辉, 谭明健, 罗炯. 运动与肠道菌健康效益的关系[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1292-1299.
[14]	高煜, 韩佳慧, 葛新. 脊髓缺血再灌注损伤后的免疫炎性微环境[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1300-1305.
[15]	田沁玉, 田兴贵, 田壮, 眭翔, 刘舒云, 鲁晓波, 郭全义. 四氧化三锰纳米颗粒抗氧化损伤保护骨髓间充质干细胞的伸展功能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 821-826.