目前研究认为，circRNA具有以下几种功能[9]：①miRNA海绵吸附作用；②通过与碱基配对的方式改变RNA性质顺式调控亲本基因的表达；③与蛋白之间的相互作用从而调节细胞的各种功能；④编码蛋白质并发挥各种生物学功能，见图3。近年来研究发现，circRNA因其独特的闭环结构在脑组织中具有高度稳定性和进化保守性[10]，它们作为竞争性内源性RNA，在细胞基因表达中扮演miRNA分子海绵的角色，大部分可在转录和转录后参与基因调控，少部分可编码为多肽，具有调节功能，在神经系统中高度富集[11]，其基因的外显子通过替代mRNA剪接产生，并通过调节神经炎症参与缺血性脑卒中发病机制的生理病理过程。  



2.2   circRNA参与调控缺血性脑卒中的发病机制   缺血性脑卒中后的主要病理生理机制是脑缺血再灌注损伤[12]，这是脑组织恢复血流后其组织结构和功能未能减轻反而加重的一种现象。脑缺血再灌注损伤的病理过程主要涉及细胞凋亡、细胞自噬、氧化应激、炎症反应、血管新生、血脑屏障等，并最终引起大脑神经元死亡和中枢神经系统功能障碍[13]。文章通过阐述参与缺血性脑卒中后不同病理生理过程的circRNA，来进一步探讨circRNA在缺血性脑卒中的调控作用。见图4。



2.2.1   细胞凋亡   细胞凋亡是一种程序性细胞死亡形式。随着脑缺血后神经元坏死，细胞凋亡是缺血性脑卒中后迟发性神经元死亡的一种重要形式[14]，也是脑缺血半暗带内细胞的主要死亡方式。一方面，由于缺血缺氧刺激凋亡相关基因的表达；另一方面，细胞内钙超载、氧自由基的过量和兴奋性毒性等也会通过不同的机制诱导神经细胞凋亡。近年来相关研究表明，一些circRNA参与缺血性脑卒中后的细胞凋亡[15]。这些研究提示circRNA在细胞凋亡过程中具有十分重要的作用。 

部分circRNA可抑制脑缺血后细胞凋亡。先前已有研究证实Smad3信号通路与细胞凋亡密切相关[16-17]，生长分化因子11(GDF11)作为TGF-β超家族的成员在脑卒中中具有神经保护作用。CHEN等[18]在氧-葡萄糖剥夺/再灌注HT-22细胞模型中发现，circRNA尿苷-胞苷激酶2 (circUCK2)一方面可以通过调节TGF-β/Smad3信号通路，减少氧-葡萄糖剥夺诱导的细胞凋亡，另一方面也可作为内源性miR-125b-5p的海绵，通过抑制其活性促进生长分化因子11的表达，从而抑制细胞凋亡。随后该团队通过建立体内外氧-葡萄糖剥夺缺血模型，发现星形细胞源性外泌体(IPAS-EXOs)中circSHOC2的表达显著上调，其作为miR-7670-3p的海绵，可通过调节自噬促进去乙酰化酶1 (Sirtuin 1，SIRT1)的表达来抑制细胞凋亡，改善神经元损伤[19]。因此，缺血性脑卒中后，circRNA不仅能够通过调节信号通路来减少细胞凋亡，而且也能够通过调节miRNA参与细胞的凋亡。

然而，另一部分circRNA也可促进脑缺血后的细胞凋亡。Dai等[20]在大脑中动脉闭塞模型和氧-葡萄糖剥夺处理的HT22细胞中发现，circRNA HECTD1 (circHECTD1)和肿瘤坏死因子受体相关因子3 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 3，TRAF3)的表达明显上调，circHECTD1可以通过海绵miR-133b抑制其活性，进一步促进TRAF3的表达，从而起到促进细胞凋亡的作用。JIANG等[21]在体外实验中发现，通过沉默circANRIL，miR-622的表达上调，抑制了NF-κB通路激活，从而抑制细胞凋亡。上述结果表明，circRNA在脑缺血后调控细胞凋亡时，部分circRNA有抑制细胞凋亡改善神经元损伤的作用，此外，也有另一部分circRNA有促进细胞凋亡进而加重神经元损伤的作用。对于其具体调控方式而言，除了通过调节下游靶点的细胞凋亡之外，也可通过调节miRNA参与细胞凋亡。
2.2.2   细胞自噬   自噬也称Ⅱ型程序性细胞死亡，是细胞死亡的一种形式，已被证明参与脑缺血损伤的发生发展过程[22]，在维持细胞质稳态中起着重要作用。自噬在脑缺血损伤过程中是一把双刃剑，一方面适度激活自噬可在一定程度上防止缺血性神经元损伤，而另一方面过度激活自噬则可致正常细胞凋亡，并致使神经元损伤[23]。近年来，circRNA在调控细胞自噬中的作用逐渐受到重视。

部分circRNA可促进脑缺血后的细胞自噬。HAN等[24]在短暂性大脑中动脉阻塞小鼠及缺血性脑卒中患者血浆样本中发现circHECTD1显著增加，其可作为miR-142的海绵，通过抑制TCDD诱导的多聚[ADP-核糖]聚合酶(TIPARP)的表达，促进细胞自噬，而致神经元损伤加重。YANG等[25]在缺血性脑卒中患者的脑微血管内皮细胞(HBMECs)和缺血再灌注损伤小鼠模型中检测到circRNA FOXO3(circFOXO3)和自噬通量的上调，同时体内和体外研究均已证明circFOXO3通过抑制雷帕霉素靶基因1
(mammalian target of rapamycin 1，mTORC1)的活性以促进自噬来清除细胞毒性聚集。由上可知，circRNA调控自噬的功能既可通过miRNA的海绵起作用，也可通过抑制mTORC1的活性来调节。另有研究显示，由缺血预处理诱导的星形细胞通过外泌体将circSHOC2转移至神经元，并对其产生保护作用，而自噬抑制剂可以消除circSHOC2对神经元的保护[19]，这表明circSHOC2的作用可以通过促进自噬来实现。
2.2.3   氧化应激   氧化应激(OxS)是指生物体活性氧(ROS)过度产生和/或抗氧化能力减弱的病理过程，导致活性氧产生与清除之间的失衡。神经组织对氧化应激较为敏感，因此氧化应激是急性缺血性脑卒中后神经元损伤和死亡的主要机制之一[26-27]。核因子红系2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是一种调节抗氧化反应的转录因子，其通过Nrf2相关通路驱动多种解毒和抗氧化因子的表达[28-29]，从而在与神经元损伤及其相关的氧化应激中发挥神经保护作用。

越来越多的证据表明，circRNA参与氧化应激的过程，并且可能是将氧化应激诱导的病理因素与神经系统疾病相关病理状况联系起来的重要机制[30]。一项高通量circRNA微阵列研究显示，circAKAP7在大脑中动脉闭塞小鼠中受到了抑制[31]。随后XU等[32]在体内实验中发现，exo-circAKAP7可以逆转大脑中动脉闭塞组中活性氧和丙二醛的高表达，在细胞实验中用exo-circAKAP7治疗后，氧化应激相关基因Nrf2可通过海绵miR-155-5p来减弱氧-葡萄糖剥夺诱导的细胞损伤，并抑制Nrf2介导的氧化应激。此外，另有临床研究表明，缺血性卒中患者血液中circMEMO1 的表达增加，沉默circMEMO1使细胞活力增强，并抑制ERK/NF-κB信号通路的激活，从而减少氧化应激和炎症反应[33]。circSLC8A1是由钠钙交换基因SLC8A1产生的circRNA[34]，在氧化应激中，氧化本身可能增加神经元中circSLC8A1的表达，减少circRNA的降解，最终降低SLC8A1蛋白的表达。相反，在使用他汀类药物治疗的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞(具有抗氧化潜力的药物)中，circSLC8A1和SLC8A1蛋白均被还原[35]。CHENG等[36]通过实验发现，过氧化氢(H2O2)下调circPRKCI(蛋白激酶Ciota)的表达，并通过circPRKCI-miR-545/589-E2F2轴诱导神经元损伤，circPRKCI的过表达缓解了H2O2诱导的细胞毒性。因此，保护神经元免受氧化应激可从靶向这种新型级联反应考虑，但目前对于circRNA在神经系统氧化应激中的作用机制仍需进一步阐明。
2.2.4   炎症反应   炎症反应是脑缺血的关键致病机制之一，其在脑缺血损伤的各个阶段发挥重要作用，脑缺血时可能会激活小胶质细胞、趋化白细胞、释放炎症因子，从而加重大脑神经功能损伤。而circRNA可以通过调控基因表达或信号通路参与缺血性脑卒中相关的炎性反应。

有研究发现在氧-葡萄糖剥夺/再灌注处理的脑微血管内皮细胞中circANRIL的表达显著上调，circANRIL的过表达进一步增加了脑微血管内皮细胞中炎性细胞因子(白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)和单核细胞化学抑制剂蛋白1的分泌[21]。此外，circANRIL对miR-622的表达进行负调节，沉默circANRIL可发挥抗凋亡和抗炎作用。此外，脑缺血再灌注所致的炎性损伤加重部分归因于NF-κB的激活[37]。据报道沉默circANRIL通过抑制NF-κB和C-JUM N-末端激酶(JNK)/P38途径的活化来保护细胞免受脂多糖诱导的炎症损伤[38]。SIRT1基因外显子2-7可共价闭合形成circSIRT1，体外研究发现circSIRT1的表达与SIRT1蛋白的表达成正相关，其可吸附miR-132/212发挥分子海绵效应，从而部分解除miR-132/212与SIRT1 mRNA 3’非翻译区(UTR)的结合，上调SIRT1的表达，后者可通过使p65脱乙酰化失活，进而抑制炎症相关因子表达[39]。此外，过表达的circSIRT1通过与NF-κB p65结合，阻止了T肿瘤坏死因子α诱导的NF-κB核转位，进而抑制炎症相关因子表达。总之，circSIRT1通过两种不同的机制来抑制NF-κB的激活和血管炎症应答：一方面通过抑制胞浆p65核转位激活来抑制炎症因子表达；另一方面，通过上调SIRT1的表达，促进核p65脱乙酰化失活，进而抑制炎性因子表达和血管炎症。这些结果进一步表明，circRNA通过调节炎症因子的表达参与缺血性脑卒中的进展。
2.2.5   血管新生   血管新生是从现有的毛细血管中通过发芽和重塑的方式形成新生血管的生理过程。当缺血性脑卒中后，血流通过新生血管侧支循环的方式改善受损脑组织的缺血缺氧状态，进而改善神经功能障碍[40]。据报道，circRNA是血管新生重要的调控因子，可参与缺血性脑卒中血管生成的病理恢复过程。 

研究表明，一些circRNAs参与脑缺血后血管新生的过程。体外实验证明，circ_0006768在氧-葡萄糖剥夺/再灌注诱导的脑微血管内皮细胞中表达下调，circ_0006768过表达可有效恢复脑微血管内皮细胞的血管生成和迁移能力[41]。HANG等[42]通过构建脑微血管内皮细胞损伤模型，发现circ_0003423可通过调节miR-589-5p/TET2轴来缓解脑微血管内皮细胞损伤。另有研究发现，缺血性脑卒中患者外周血中circFUNDC1的表达增加，敲低circFUNDC1减轻了氧-葡萄糖剥夺诱导的细胞凋亡，并促进血管生成[43]。大部分circRNA可以作为miRNA的海绵，并通过竞争性RNA网络调节内源性基因的表达。Li等[3]通过构建circRNA-miRNA-mRNA网络发现circRNA具有miR-122-5p的结合位点，而miR-122-5p作为血管生成因子的上游调节剂，在大脑中动脉闭塞大鼠的血浆和脑脊液中显著下调。此外还发现circRNA-miRNA-mRNA网络中的一些靶基因(如EphB2，Wnt3和Twist1)可参与炎症和血管生成，从而减少神经元损伤。因此，这些circRNA可能是治疗实验性缺血性卒中的靶血管生成因子。
2.2.6   血脑屏障   血脑屏障是由紧密连接结构的大脑血管内皮细胞构成，其具有维持大脑生化环境稳态的重要作用[44]。缺血性脑卒中时，血脑屏障的紧密连接完整性遭到破坏，进而导致细胞旁通透性增加、离子失衡、信号稳态改变和大量的炎症因子进入缺血损伤区，从而使大脑神经元功能障碍甚至细胞凋亡。

circRNA 也参与了缺血性脑卒中后血脑屏障的调控。BAI等[45]通过临床与基础研究发现，circDLGAP4可以充当miR-143的海绵，通过抑制miR-143的活性来调节脑缺血区紧密连接蛋白(Claudin-5、Occludin和ZO-1)和间充质转化标志物(collagenI、collagenIII、α-SMA)的水平，以改善血脑屏障损伤。此外，WU等[46]发现，过表达的circCCDC9可抑制Notch1信号通路，而敲减circCCDC9能够使脑组织亚硝酸盐含量下降、含水量升高，这为circCCDC9保护血脑屏障提供了有力的证据。体内和体外研究表明，circFOXO3主要通过抑制mTORC1促进自噬的作用来改善缺血再灌注下血脑屏障的完整性[47]。后有研究发现，脑膜炎大肠杆菌诱导的脑微血管内皮细胞中 circ_2858 的上调，并证明这种 circRNA 可以通过竞争性海绵 miR-93-5p 促进血管内皮生长因子A(VEGFA)的表达，从而导致紧密连接中断和血脑屏障功能障碍[48]。综上可知，靶向circRNA或利用circRNA分子可能是一种潜在的治疗中枢神经系统血脑屏障损伤的有效策略。

circRNA调控脑缺血发病的作用与机制汇总，见表1。

缺血性脑卒中又名脑梗死或脑栓塞，是一种多由于颅内动脉狭窄和大脑中动脉阻塞导致脑局部缺血缺氧，而出现相应的神经功能缺损的脑血管疾病[1]，约占全部脑卒中的87%[2]，给全球性医疗问题和公共卫生带来了严重的挑战。尽管目前对于缺血性脑卒中新的诊断和预后方法不断发展，但早期诊断和结果预测依然具有很大困难，因此迫切需要为缺血性脑卒中探索更灵敏、可靠的生物标志物和治疗靶点。 

近年来随着基因测序的发展及人们对全基因转录组学的深入研究，发现包括环状RNA(circular RNA，circRNA)在内的非编码RNA(ncRNA)可通过介导细胞凋亡、细胞自噬、氧化应激、炎症反应、血管新生和血脑屏障破坏等途径参与缺血性脑卒中的进展与转归。已有学者在大脑中动脉闭塞(MCAO)大、小鼠模型的脑组织中发现circRNA表达谱的变化[3-4]。另有临床研究发现，与健康对照组相比，缺血性脑卒中患者血中circRNA表达谱存在着显著差异[5-7]，表明circRNA可能参与缺血性脑卒中的发生发展过程，但详细的作用机制仍需进一步深入研究。该文主要以缺血性脑卒中相关的circRNA为重点，对circRNA参与缺血性脑卒中的发病机制及调控方式展开综述，旨在为缺血性脑卒中发病机制的研究、诊断及治疗提供新思路。
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1.1.7   文献检索策略   中英文数据库检索策略见图1。

1.2   入组标准
1.2.1   纳入标准   circRNA与缺血性脑卒中后发病机制相关的文章。
1.2.2   排除标准   ①与研究目的无关的文献；②重复、过时的文献；③数据不完整的文献。
1.3   质量评估   由第一作者对检索结果进行人工筛选，删除新闻、会议征稿、通知等非学术性文章，通过认真研读摘要之后对符合标准的文献进行逐一纳入，并排除中英文重复、与研究目的无关且内容重复、逻辑性差的文献，得出998篇检索结果，其中36篇中文、962篇英文；计算机检索973篇，手动检索25篇。随后由第一作者及其他作者再次筛选，并进行精细化阅读，提取关键信息并对比分析，最终纳入观点新颖、语言逻辑性缜密、设计合理的48篇文献进行综述，检索流程见图2。

缺血性脑卒中的早期诊断和治疗是临床实践中的首要挑战。该文主要从影响缺血性脑卒中患者预后的病理生理机制：神经细胞凋亡、细胞自噬、氧化应激、炎症反应、血管新生与血脑屏障等方面探讨，鉴定参与这些过程的circRNA可能有助于它进一步用作该疾病的药物靶标或生物标志物。

目前对于缺血性脑卒中的相关治疗多以静脉溶栓、血管内治疗和药物治疗为主。但因其本身具有较窄的治疗窗口和细胞信号通路之间的复杂相互作用等特点，使得研究人员致力于寻求更灵敏、可靠的生物标志物和治疗靶点。近年来随着基因测序技术的发展，非编码RNA的相关研究成果逐渐为缺血性脑卒中的治疗提供了更多的可能性，但大部分多在微小RNA和长链非编码RNA方面，对于circRNA与缺血性脑卒中的相关研究相对较少。

近年来，部分circRNA在缺血性脑卒中中的作用机制研究已有相关报道，说明circRNA可能成为缺血性脑卒中未来研究的新方向，虽然测序结果显示缺血性脑卒中后有众多差异表达的circRNA，但目前只有少量的研究探讨了部分circRNA的作用机制，而且由于其表达差异性、时间和空间上的多态性以及物种之间的保守性等方面的因素，circRNA的治疗尚未应用于临床，且circRNA替代剂的研发仍面临诸多挑战。由于目前circRNA和脑缺血疾病的相关基础和临床研究开展较少，所以该综述总结归纳的相对有限，尚需进一步的深入研究。

该文详细阐述了circRNA与缺血性脑卒中相关研究进展，并着重探讨了circRNA调控脑缺血发病的作用与机制，期望引起科研人员的重视，从而深入了解circRNA在不同生物学过程中的功能，以期为开发更有效的基于circRNA治疗缺血性脑卒中后继发性损伤的策略提供思考。未来研究可继续深入了解circRNA的功能及其它非编码RNA的相互作用和转录/翻译机制，并探究其在缺血性脑卒中时病理生理中的分解机制有重要意义，因此针对 circRNA 的靶向分子药物可能是一种有前景的新型脑卒中治疗策略，可为缺血性脑卒中精准诊疗发展巩固理论基础。  
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文题释义：
缺血性脑卒中：是人类世界范围内发病和死亡的重要原因之一，其病理损伤机制主要包括细胞凋亡、细胞自噬、氧化应激、炎症反应、血管新生及血脑屏障等。
环状RNA(circular RNA，circRNA)：是一类新型保守的内源性非编码RNA，其特征在于通过反向剪接的特殊类型产生的共价闭环结构，是目前非编码RNA领域的最新研究热点。

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先前对于缺血性脑卒中与非编码RNA相关性的研究多停留在微小RNA与长链非编码RNA方面，对环状RNA与缺血性脑卒中相关研究相对较少，深入探究脑缺血后的发病机制对更精准的靶向治疗至关重要。较以往研究而言，本文主要从脑缺血后的发病机制如：细胞凋亡、细胞自噬、氧化应激、炎症反应、血管新生、血脑屏障等方面着手，探究环状RNA如何对其进行调控，以期为临床药物的研发及基因靶向精准治疗提供思考。

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