牛磺熊去氧胆酸干预缺糖缺氧条件下脊髓神经元的凋亡

doi:10.12307/2024.216

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (4): 528-534.doi: 10.12307/2024.216

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牛磺熊去氧胆酸干预缺糖缺氧条件下脊髓神经元的凋亡

陈泽鹏1，2，侯永辉2，3，陈树东3，侯宇3，林定坤3

1广州中医药大学第二临床医学院，广东省广州市 510405；2广州中医药大学岭南医学研究中心，广东省广州市 510405；3广东省中医院骨一科，广东省广州市 510120

收稿日期:2023-01-17 接受日期:2023-02-24 出版日期:2024-02-08 发布日期:2023-07-13
通讯作者: 林定坤，主任医师，广东省中医院骨一科，广东省广州市 510120
作者简介:陈泽鹏，男，1990年生，广东省汕头市人，汉族，博士，主治医师，主要从事脊髓损伤修复研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82074451)，项目负责人：林定坤；广东省自然科学基金项目(2019A1515010323)，项目负责人：林定坤；广州市科技计划项目(2023A03J0239)，项目负责人：侯永辉；广州市科技计划项目(202102020542)，项目负责人：陈树东

Tauroursodeoxycholic acid treats spinal cord injury by reducing apoptosis of spinal cord neurons under glucose and oxygen deprivation

Chen Zepeng1, 2, Hou Yonghui2, 3, Chen Shudong3, Hou Yu3, Lin Dingkun3

1The Second Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2Lingnan Medical Research Center, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 3Department of Spinal Surgery, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Received:2023-01-17 Accepted:2023-02-24 Online:2024-02-08 Published:2023-07-13
Contact: Lin Dingkun, Chief physician, Department of Spinal Surgery, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
About author:Chen Zepeng, MD, Attending physician, The Second Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; Lingnan Medical Research Center, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82074451(to LDK); Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2019A1515010323 (to LDK); Guangzhou Science and Technology Projects, Nos. 2023A03J0239 (to HYH) and 202102020542 (to CSD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

牛磺熊去氧胆酸：是一种亲水性胆汁酸，是牛磺酸与熊去氧胆酸结合的氨基酸，已被FDA批准用于治疗肝脏疾病，如胆汁淤积、肝硬化和肝炎。牛磺熊去氧胆酸可穿透血脑屏障而无任何神经和细胞毒性，在帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统疾病模型中显示出减少细胞凋亡、减轻炎症和保护线粒体功能的作用。
脊髓损伤：脊髓或椎管末端神经(马尾神经)的任何部位受伤，导致损伤平面以下的力量、感觉和其他身体功能发生的暂时性或永久性变化，包括运动和感觉丧失或改变、温度觉和触觉改变、肠道或膀胱失控、异常反射活动或痉挛及性功能、性敏感性和生育能力的变化、脊髓神经纤维受损引起的疼痛或强烈的刺痛感、呼吸困难等。

背景：牛磺熊去氧胆酸是一种亲水性胆汁酸衍生物，在多种神经系统疾病模型中均有神经保护作用，但目前鲜有报道研究牛磺熊去氧胆酸对脊髓损伤的作用。

目的：观察缺糖缺氧条件下牛磺熊去氧胆酸对脊髓神经元凋亡的作用，以及对脊髓损伤后小鼠运动功能恢复的影响。
方法：①体外实验：从孕13.5 d的C57 BL/6小鼠胚胎中分离提取原代脊髓神经元，培养72 h后，分3组处理：正常组加入Neurobasal完全培养基，置于CO2培养箱(体积分数5%CO2+95%空气)内培养24 h；氧糖剥夺组加入无糖的Neurobasal培养基，置于三气培养箱(体积分数94%N2+5%CO2+1%O2)培养12 h，更换为Neurobasal完全培养基后置于CO2培养箱内培养12 h；实验组处理过程大致同氧糖剥夺组，其中在加入无糖Neurobasal培养基的同时加入牛磺熊去氧胆酸。采用TUNEL染色检测细胞凋亡，CCK-8法检测细胞活性，免疫荧光染色检测细胞βⅢ微管蛋白表达。②动物实验：采用随机数字表法将60只C57 BL/6小鼠分为假手术组、脊髓损伤组与实验组，每组20只，脊髓损伤组与实验组采用Allen打击法建立T9-T10脊髓损伤模型，造模后第1天开始，实验组灌胃给予牛磺熊去氧胆酸溶液，假手术组与脊髓损伤组灌胃给予生理盐水，1次/d。连续给药14 d后，采用行为学和组织学方法评估脊髓组织修复情况。
结果与结论：①体外实验：TUNEL染色、CCK-8与免疫荧光染色检测显示，氧糖剥夺组细胞凋亡数量高于正常组(P < 0.01)，细胞活性与βⅢ微管蛋白表达低于正常组(P < 0.01)；实验组细胞凋亡数量低于氧糖剥夺组(P < 0.01)，细胞活性与βⅢ微管蛋白表达高于氧糖剥夺组(P < 0.01)。②动物实验：旷场实验BBB评分与后肢足迹实验显示，实验组小鼠行走与运动功能恢复程度好于脊髓损伤组。苏木精-伊红染色显示，脊髓损伤组小鼠脊髓损伤部位可见明显畸形和空洞，神经细胞数量明显减少；与脊髓损伤组比较，实验组脊髓损伤病变面积显著减小，脊髓畸形程度更小、空洞更少，神经细胞数量增加。免疫荧光染色显示，脊髓损伤组神经元胞核标记神经元细胞数量少于假手术组

(P < 0.01)，实验组神经元胞核标记神经元细胞数量高于脊髓损伤组(P < 0.01)。③结果表明：牛磺熊去氧胆酸能减少缺糖缺氧引起的脊髓神经元凋亡、轴突的丢失，促进脊髓损伤小鼠运动功能的恢复。

https://orcid.org/0000-0003-0253-4746(陈泽鹏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 牛磺熊去氧胆酸, 脊髓损伤, 缺糖缺氧, 脊髓神经元, 行为学, 细胞凋亡

Abstract: BACKGROUND: Tauroursodeoxycholic acid is a hydrophilic bile acid derivative that has neuroprotective effects in a variety of neurological disease models. However, there are few reports on the effects of tauroursodeoxycholic acid on spinal cord injury.
OBJECTIVE: To investigate the effect of tauroursodeoxycholic acid on apoptosis of spinal cord neurons under hypoglycemic and hypoxic conditions, as well as the effect on recovery of motor function in mice after spinal cord injury.
METHODS: (1) In vitro experiment: Primary spinal cord neurons were isolated from C57 BL/6 mouse embryos at 13.5 days of gestation. After 72 hours of culture, the cells were divided into three groups. In the normal group, cells were cultured in Neurobasal complete medium that was incubated in a CO2 incubator (5% CO2 + 95% air) for 24 hours. In the oxyglucose-deprived group, sugar-free Neurobasal medium was added and incubated in a triple-gas incubator (94% N2+5% CO2+1% O2) for 12 hours, and then the medium was replaced with Neurobasal complete medium and incubated in a CO2 incubator for 12 hours. In the experimental group, the treatment procedure was approximately the same as that in the oxyglucose-deprived group, except that taurodeoxycholic acid was added along with the sugar-free Neurobasal medium. TUNEL staining was used to detect apoptosis, cell counting kit-8 assay was applied to detect cell activity, and immunofluorescence staining was performed to detect cellular β-microtubule protein expression. (2) Animal experiment: Sixty C57 BL/6 mice were randomly divided into sham-operated group, spinal cord injury group and experimental group, with 20 mice in each group. Animal models of T9-T10 spinal cord injury were established using Allen’s percussion method in the spinal cord injury group and the experimental group. Starting from the 1st day after modeling, taurodeoxycholic acid solution was given by gavage in the experimental group and normal saline was given by gavage in the sham-operated and spinal cord injury groups once a day for 14 consecutive days. Spinal cord tissue repair was assessed using behavioral and histological methods.
RESULTS AND CONCLUSION: In vitro experiment: TUNEL staining, cell counting kit-8 and immunofluorescence staining showed that compared with the normal group, the number of apoptotic cells was higher (P < 0.01), while cell activity and β-microtubule protein expression were lower in the oxyglucose-deprived group (P < 0.01); compared with the oxyglucose-deprived group, the number of apoptotic cells was lower (P < 0.01), while cell activity and β-microtubule protein expression were higher in the experimental group (P < 0.01). Animal experiment: The Basso-Beattie-Bresnahan scores in the open field test and hind limb footprint experiments showed that the mice in the experimental group had better recovery of walking and motor functions than those in the spinal cord injury group. Hematoxylin-eosin staining showed that significant deformities and cavities were observed at the site of spinal cord injury and the number of nerve cells was significantly reduced in the spinal cord injury group. Compared with the spinal cord injury group, the experimental group showed a significant reduction in the area of spinal cord injury, less spinal cord deformity, fewer cavities, and an increase in the number of nerve cells. Immunofluorescence staining showed that the number of neuronal nucleus-labeled neuronal cells in the spinal cord injury group was less than that in the sham-operated group (P < 0.01), and the number of neuronal nucleus-labeled neuronal cells in the experimental group was higher than that in the spinal cord injury group (P < 0.01). To conclude, tauroursodeoxycholic acid could effectively reduce glucose/oxygen deprivation-induced apoptosis of spinal cord neurons and axonal loss, and promote the recovery of motor function in mice with spinal cord injury.

Key words: tauroursodeoxycholic acid, spinal cord injury, glucose/oxygen deprivation, spinal cord neuron, behavioristics, cell apoptosis

中图分类号:

陈泽鹏, 侯永辉, 陈树东, 侯宇, 林定坤. 牛磺熊去氧胆酸干预缺糖缺氧条件下脊髓神经元的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 528-534.

Chen Zepeng, Hou Yonghui, Chen Shudong, Hou Yu, Lin Dingkun. Tauroursodeoxycholic acid treats spinal cord injury by reducing apoptosis of spinal cord neurons under glucose and oxygen deprivation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(4): 528-534.

图/表（结果） 8

2.1 体外实验结果
2.1.1 脊髓神经元的培养和鉴定脊髓神经细胞接种后4 h内，大部分细胞贴壁生长，细胞核呈椭圆形，直径约为10 μm；大约接种后24 h，神经细胞开始长出突起，多数为具备多个突起的神经元，突起细长，可见末端的生长锥，大部分神经元呈聚集状，向四周发出枝样的神经突起；培养3-5 d后，已形成较为稀疏的神经网络；培养7 d可看到突起的主干和分支，网络更加稠密，胞体增大，见图2。通过βⅢ微管蛋白、神经元胞核免疫荧光确认为分离培养的细胞为脊髓神经元，见图3[22-23]。

2.1.2 各组脊髓神经元的凋亡与活性 TUNEL染色结果见图4，正常组仅观察到少量TUNEL(+)细胞(箭头指示)，氧糖剥夺组可观察到大量TUNEL(+)细胞，实验组TUNEL(+)细胞数量少于氧糖剥夺组。CCK-8检测检测，氧糖剥夺组细胞活性明显低于其他两组(P < 0.01)，实验组的细胞活性虽然弱于正常组(P < 0.01)，但高于氧糖剥夺组(P < 0.01)，见图5。TUNEL染色和CCK-8检测结果说明，牛磺熊去氧胆酸的干预可明显减少缺氧缺糖环境下脊髓神经元的凋亡。

2.1.3 各组脊髓神经元的轴突变性轴突变性是一种常见的神经病理改变，可由营养代谢障碍等因素引起。从3组轴突的免疫荧光染色可见，正常组的轴突生长最好(箭头指示)，粗细均匀，与另一神经元的表面形成突触；氧糖剥夺组可见明显的神经细胞凋亡，轴突自远端向近端的的变性、破坏和消失，胞核数量下降，轴突交叉节点消失；实验组虽然也出现神经细胞数量减少，但是对比氧糖剥夺组，其轴突形态仍然较好，细胞的萎缩和轴突的断裂受到抑制，见图6，说明牛磺熊去氧胆酸干预能减少脊髓神经元的凋亡。

2.2 动物实验结果
2.2.1 实验动物数量分析 60只小鼠全部进入结果分析。
2.2.2 各组小鼠运动功能足印迹实验显示，假手术组小鼠足印迹是最清晰；实验组小鼠足印迹虽有拖曳但仍然相对清晰，能够辨别前后足印；脊髓损伤组小鼠足印迹呈明显拖曳条带状，无法清晰辨别前后足印，见图7，结果表明，经牛磺熊去氧胆酸干预治疗的就损伤小鼠行走功能恢复更好。旷场实验显示，与假手术组比较，脊髓损伤组和实验组小鼠BBB评分均降低；造模后第7，10，14天，实验组小鼠BBB评分高于脊髓损伤组(P < 0.05)，见图7。

2.2.3 各组小鼠脊髓组织苏木精-伊红染色脊髓损伤后14 d的苏木精-伊红染色显示，与假手术组相比，脊髓损伤小鼠脊髓损伤部位可见明显畸形和空洞，神经细胞数量明显减少；相较于脊髓损伤组，实验组小鼠脊髓损伤的病变面积显著减小，脊髓的整体连贯性更好、畸形程度更小、空洞更少，保留了更多的神经细胞，组织修复程度更好，见图8。

2.2.4 各组小鼠脊髓组织神经元胞核免疫荧光染色与假手术组相比，脊髓损伤组和实验组小鼠脊髓损伤区域神经细胞凋亡数量多；脊髓损伤组脊髓形态延续性差，可见少量神经元胞核标记的神经元细胞；相较于脊髓损伤组，实验组小鼠形态较完整和连续，保留了更多神经元胞核标记的神经元细胞，见图9。

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引言

脊髓血管供应中断和灌注不足是原发性损伤的早期后果之一，由于过度出血和神经源性休克，脊髓损伤患者出现低血容量和血液动力学休克，导致脊髓灌注受损和缺血[1]。较大的血管如脊髓前动脉通常保持完整[2-3]，而较小的髓内血管和易受创伤损伤的毛细血管破裂，导致白细胞和红细胞外渗[1]；水肿引起受伤脊髓的组织压力增加和出血引起的完整血管痉挛，进一步破坏了脊髓的血流[1-2]。血管损伤、出血和缺血最终通过缺氧、兴奋性毒性、离子不平衡等机制导致细胞死亡[1，4]。缺氧导致的神经细胞死亡是脊髓损伤后影响神经元二次伤害机制中的一个主要事件[5-8]，其中，细胞凋亡是被研究最多的细胞死亡机制。据报道，在癫痫发作、缺血和低血糖的情况下，坏死的神经元表现为细胞核的萎缩、蛋白核和凝结、线粒体和质膜肿胀和不可逆的损伤[9]。细胞凋亡是一种程序化的、依赖能量的细胞死亡模式，在原发性损伤后数小时内开始[10]，这一过程发生在原发性损伤后存活的细胞中，需要强有力的损伤以激活它们的凋亡途径[8]，因此，减少神经细胞的凋亡是促进脊髓损伤修复的有效途径。
熊胆作为中药在中医治疗中具有重要的地位，在熊胆中发现一种酸——牛磺熊去氧胆酸是一种亲水性的胆汁酸，在肝脏中通过牛磺酸与熊去氧胆酸的共轭而自然产生，其可以渗透到血脑屏障，并且具有低毒性[11-12]。此外，其前体牛磺熊去氧胆酸已被美国食品和药物管理局(FDA)批准作为治疗胆汁淤积性肝病的药物[13-16]。研究表明，牛磺熊去氧胆酸在神经退行性疾病模型中具有神经保护作用，包括阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病[17-20]，基于其在这些疾病的不同实验模型中抑制细胞凋亡、削弱氧化应激和减少内质网压力的强大能力[11]，此次实验旨在研究缺氧低糖条件下牛磺熊去氧胆酸对脊髓神经细胞凋亡的影响，以及对脊髓损伤后小鼠运动功能恢复的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，随机对照动物实验，所得实验数据中符合正态分布、方差齐性的计量资料比较采用单因素方差分析；若样本总体不均为正态分布或方差不齐，则采用独立样本Kruskal-Wallis H检验进行统计分析。
1.2 时间及地点实验于2021-2022年在广州中医药大学岭南医学研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性C57 BL/6小鼠60只，SPF级，8周龄，体质量20-25 g；孕13.5 d的C57 BL/6小鼠3只，均购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2022-0002。小鼠饲养于广州中医药大学实验动物中心，并提供标准啮齿动物饲料和水，环境温度24-26 ℃，相对湿度55%，干燥通风，每隔3 d更换垫料以确保清洁。小鼠按5只/笼饲养，自由活动，摄水饮食。所有动物实验均经广州中医药大学伦理委员会批准(批准号：20210430006)，并按照中国卫生研究院的指导原则(中国广州，证书编号：44005800012426)进行。
1.3.2 药物与试剂牛磺熊去氧胆酸(纯度>总质量的98%，溶于生理盐水，上海源叶)；木瓜蛋白酶、多聚-D-赖氨酸(Sigma)；DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、胎牛血清、B27、谷氨酰胺(Gibco)；CCK-8试剂盒(KeyGEN)；荧光二抗(1∶300，Thermo)；神经元胞核一抗(1∶200，Boster)；βⅢ微管蛋白一抗(1∶200，Abcam)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(翌圣)；柠檬酸缓冲液(巴赣)。
1.3.3 主要仪器 CO2细胞培养箱(Thermo公司)；倒置荧光显微镜(Olympus公司)；PCI-3000精密大小鼠脊髓损伤撞击器(Hatteras Instruments公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 体外实验

脊髓神经元的获取及原代培养[21]：无菌条件下取孕13.5 d的C57 BL/6小鼠胚胎，提取脊髓，用眼科镊轻轻剥离脊膜，在DMEM/F12培养基中切成约1 mm的碎片，用200 µg/mL木瓜蛋白酶在37 ℃下消化组织25 min；消化完毕后，800 r/min离心5 min，倾倒上清液，将细胞沉淀重悬于DMEM/F12培养基中；然后，将细胞接种到聚-D-赖氨酸预包被的6孔板、24孔板或96孔板，并在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。4 h后，更换为Neurobasal完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、2%B27、0.5 mmol/L谷氨酰胺)。每3 d更换一半培养基。原代培养的脊髓神经元纯度达90%以上。脊髓神经元获取过程见图1。

脊髓神经元的鉴定：培养1，3，7 d后，用40 g/L多聚甲醛在盖玻片上固定脊髓神经元2 h，在4 ℃下与含体积分数10%正常马血清的一抗(βⅢ微管蛋白、神经元胞核，稀释比例均为1∶200)孵育过夜，以PBS轻轻清洗2次，每次5 min；将含荧光染料的二抗(稀释比例1∶300)检测相应的一抗，荧光显微镜下观察βⅢ微管蛋白、神经元胞核的表达。
脊髓神经元分组处理：培养72 h后，将脊髓神经元分3组处理。正常组加入Neurobasal完全培养基，置于CO2培养箱(体积分数5%CO2+95%空气)内培养24 h；氧糖剥夺组加入无糖的Neurobasal培养基，置于三气培养箱(体积分数94%N2+5%CO2+1%O2)培养12 h，更换为Neurobasal完全培养基后置于CO2培养箱内培养12 h[13-14]；实验组处理过程大致同氧糖剥夺组，其中在加入无糖Neurobasal培养基的同时加入200 μmol/L牛磺熊去氧胆酸。
TUNEL染色检测细胞凋亡：将培养72 h的脊髓神经元，以细胞浓度0.5×109 L-1接种于24孔板内，每孔400 µL，按照分组处理。处理结束后，使用细胞凋亡检测试剂盒，按照制造商的方案通过TUNEL染色鉴定凋亡细胞。在荧光显微镜下捕获免疫荧光图像。TUNEL标记后，对各组的凋亡细胞数(TUNEL阳性细胞)和细胞总数(DAPI阳性细胞)进行计数并分析统计。
CCK-8法检测细胞活性：将脊髓神经细胞按1×104/孔的密度接种于96孔板，培养72 h后进行分组处理，每组5复孔。处理结束后，每孔加入10 μL CCK-8工作液在37 ℃继续培养 2 h，在酶标仪波长450 nm处测定吸光度值，并计算细胞活性。
免疫荧光染色：将脊髓神经细胞按1×106/孔的密度接种于6孔板，培养72 h后进行分组处理。处理结束后，免疫荧光染色检测βⅢ微管蛋白的表达，检测步骤同脊髓神经元的鉴定。
1.4.2 动物实验

实验动物分组及干预：采用随机数字表法将60只C57 BL/6小鼠分假手术组、脊髓损伤组与实验组，每组20只。腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉小鼠，通过椎板切除术在T9-T10水平暴露脊髓，假手术组小鼠仅接受外科手术，不损伤脊髓；脊髓损伤组与实验组小鼠在无菌条件下采用Allen打击方法行脊髓损伤造模[15]：通过气动冲击装置打击，打击力设定为0.5 m/s，持续时间为80 ms。造模后，每天手动排空膀胱2次，直到小鼠能够正常排尿。造模后第1天(造模当天设为第0天)，实验组灌胃给予牛磺熊去氧胆酸溶液200 mg(kg·d)[13-14]，假手术组和脊髓损伤组小鼠灌胃给予等量生理盐水，1次/d，直到造模后第14天。

功能行为学评价：造模前1 d和造模后3，7，10，14 d，将小鼠置于旷场中自由活动5 min，采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分表进行行为学评分[16]，评价各组小鼠后肢运动功能恢复情况。该量表评分范围0-21分，分数越高后肢运动功能恢复越好。造模后第14天，通过用黑色染料浸渍小鼠后肢进行足迹实验：引导小鼠径直走过一条狭窄的通道，并记录脚印，将足迹扫描成数字化图像以分析其步态。
脊髓组织苏木精-伊红染色：造模后第14天，完成行为学测试后，麻醉状态下处死小鼠，予以PBS心脏灌注(左心室)，直到小鼠全身血液排出后(肝脏转呈灰白色)，予以40 g/L多聚甲醛固定液在统一进针处缓慢灌注，当出现小鼠躯干及尾巴僵直，确认灌注完全。解剖显露造模的脊髓部位，截取脊髓的造模部位(T9-T10水平，上下端各保留约1 cm)，将损伤区脊髓组织固定于40 g/L多聚甲醛 24 h。梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片、摊片，常规脱蜡复水后进行苏木精-伊红染色，光镜下观察并拍照。
脊髓组织免疫荧光染色：脊髓标本取材同上，将损伤区脊髓组织固定于40 g/L多聚甲醛中24 h；梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片、摊片，将玻片放入49 ℃烤箱加热20 min，玻片干燥后，常规脱蜡复水后，用柠檬酸缓冲液(pH=6.0)在微波炉中进行抗原修复20 min；待冷却至室温，将制备的组织切片和细胞在含体积分数10%正常马血清的PBS中室温封闭1 h，然后在4 ℃下与含体积分数10%正常马血清的一抗(神经元胞核抗体，稀释比例1∶200)孵育过夜；将含荧光染料的二抗(1∶300)检测相应的一抗，荧光显微镜下观察神经元胞核的表达。
1.5 主要观察指标缺糖缺氧条件下牛磺熊去氧胆酸对脊髓神经元凋亡的作用，以及牛磺熊去氧胆酸对脊髓损伤后小鼠脊髓损伤恢复的影响。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism软件进行数据处理，结果以x±s表示，其中符合正态分布、方差齐性的计量资料比较采用单因素方差分析；若样本总体不均为正态分布或方差不齐，则采用独立样本 Kruskal-Wallis H 检验进行统计分析，P < 0.05或P < 0.01为差异有显著性意义。所有实验均重复3次。文章的统计学方法已经广州中医药大学统计学专家审核。

讨论

脊髓损伤会造成感觉-运动功能障碍，严重时可能导致死亡[24]。世界上大约有300万人患有脊髓损伤，每年有12 000个新病例被报道，脊髓损伤多发生于年龄14.6-67.6岁之间，男性发病率是女性的4倍[25-26]。脊髓损伤的病理生理学包括一级和二级2个阶段，原发性损伤属于一级阶段，包括缺血、组织水肿等微环境变化，而缺血会引起组织供氧和供能不足，又会再次作用于组织和细胞，引发二次损伤，包括氧化应激、炎症、细胞凋亡等，其中细胞凋亡是脊髓损伤发生后的关键信号变化[27-28]，所以，及时有效减少缺血发生时神经细胞的凋亡，对于促进神经功能的恢复具有重要意义[29-30]。此次实验通过建立细胞氧糖剥夺模型，模拟脊髓神经元在损伤后出现的供氧和供能不足的情况，来观察脊髓神经元的凋亡情况。牛磺熊去氧胆酸是熊去氧胆酸的牛磺酸结合形式，并且能够穿透中枢神经系统[31]，在退行性神经系统疾病中具有降低神经元损伤的作用[32-34]。牛磺熊去氧胆酸一般通过以下方式发挥其作用：产生抗神经炎作用；减少氧化应激；调节和抑制细胞凋亡级联；保护线粒体；维持蛋白质的稳定性和正确折叠。然而，目前牛磺熊去氧胆酸在神经学方面的研究领域主要集中于脑科学领域，如阿尔茨海默病[16]、帕金森病[35]、亨廷顿病[31]，鲜有脊髓损伤相关领域的研究。脊髓损伤目前的治疗仍然以手术治疗为主[36]，对于保守治疗或者术后脊髓康复的成熟药物研究较少，特别是中药类。牛磺熊去氧胆酸作为一种成熟的药物(商品名：滔罗特)已被广泛应用于治疗肝胆疾病[37]，具备临床安全性和有效性，同时牛磺熊去氧胆酸也是一种内质网应激抑制剂[38]，可以显著降低凋亡分子的表达。此次实验探讨牛磺熊去氧胆酸对脊髓损伤的作用，对未来脊髓损伤药物治疗发展具有一定的意义。
在脊髓损伤发生后，细胞的氧气消耗量与血管灌注量失衡形成低氧状态，在此条件下有限的氧分子可用于充当电子传递链中的最终电子受体，导致活性氧的增加[39]，引起细胞凋亡。βⅢ微管蛋白是神经元细胞类型特异性分化的微管蛋白，在有丝分裂、减数分裂、细胞内的运输等方面发挥作用，免疫组化染色发现，神经元胞核存在于未成熟的神经元胞体、树突、轴突和轴突末端[23]。神经元胞核是一种前体mRNA选择性剪切调节分子，最先在哺乳动物中因可生成一种成功靶向神经元胞核内抗原的单克隆抗体，这种蛋白的抗体常被用于标记脊椎动物大多数神经元中的胞核[40]。通过脊髓神经元氧糖剥夺模型的免疫荧光检测发现，在缺少营养和氧气的环境下，脊髓神经元出现细胞核萎缩、轴突断裂缩短、轴突分叉点数量减少的神经细胞坏死表现；同时，对细胞氧糖剥夺模型进行牛磺熊去氧胆酸处理后发现，脊髓神经元凋亡减少，轴突分叉节点和长度退化受到抑制；TUNEL染色和CCK-8检测结果也显示，牛磺熊去氧胆酸干预能够显著缓解脊髓神经元的凋亡。课题组在前期研究中发现，牛磺熊去氧胆酸通过减少活性氧的生成、乳酸脱氢酶的释放和恢复超氧化物歧化酶活性来提高神经细胞的存活率[41]，而缺氧会促使线粒体产生活性氧[42]，与脊髓神经元凋亡具有关联意义，有待进一步研究。
发生脊髓损伤后会出现大范围的神经元死亡、轴突变性和脱髓鞘[43]，临床上，患者会出现损伤平面以下的感觉和功能障碍的症状。牛磺熊去氧胆酸在不同的神经疾病动物模型中都具有神经保护的特性，其中之一就是抗凋亡[31-32，44-45]，因此，此次实验进一步研究牛磺熊去氧胆酸对脊髓损伤模型动物的作用。免疫荧光染色结果显示，经牛磺熊去氧胆酸干预的脊髓组织比未干预的损伤脊髓组织有更多神经元胞核标记的脊髓神经元；苏木精-伊红染色结果也表明，牛磺熊去氧胆酸治疗显著减少了脊髓损伤小鼠脊髓损伤面积，增加了正常形态的神经元。造模后第1天进行的旷场实验结果显示，脊髓损伤小鼠后肢的运动是受限的，采用前肢支撑身躯，脊髓损伤组和牛磺熊去氧胆酸干预组在前6 d的BBB评分测试并没有明显统计学意义，但从第7天开始，牛磺熊去氧胆酸干预组小鼠运动功能恢复速度明显要快于脊髓损伤组。第14天的足印迹实验结果显示，牛磺熊去氧胆酸组小鼠的足印迹更清晰，而脊髓损伤组小鼠的足印迹呈拖曳条带状，无法辨认，说明牛磺熊去氧胆酸对于恢复脊髓损伤小鼠后肢运动具有明显效果。行为学测试结果均表明，牛磺熊去氧胆酸能够促进小鼠脊髓损伤的修复。有研究指出，牛磺熊去氧胆酸独特的胆汁酸可以影响线粒体的调节功能，可以防止小鼠神经干细胞在早期分化诱导过程中的线粒体改变，增加神经干细胞数量[46-47]，因此，将进一步研究缺糖缺氧环境下牛磺熊去氧胆酸对脊髓神经元线粒体状态的影响及能量的代谢情况，以明确线粒体和脊髓神经元凋亡的关系。
综上所述，此次实验结果表明，牛磺熊去氧胆酸能减少缺糖缺氧引起的脊髓神经元凋亡与轴突丢失，促进小鼠脊髓损伤小鼠运动功能的恢复。然而，牛磺熊去氧胆酸抗脊髓神经元凋亡的能量代谢机制尚不清楚，仍有待下一步的研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

牛磺熊去氧胆酸干预缺糖缺氧条件下脊髓神经元的凋亡

Tauroursodeoxycholic acid treats spinal cord injury by reducing apoptosis of spinal cord neurons under glucose and oxygen deprivation

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