1.1 设计 分组设计细胞学实验。数据符合正态分布，则组间比较采用单因素方差分析，方差齐则用LSD分析，方差不齐则用Game’s-Howell分析；数据不符合正态分布则进行秩和检验。
1.2 时间及地点 实验于2022-09-01/10-31在济宁市第一人民医院肿瘤转化实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 健康8周龄SD大鼠4只，雌雄不限，体质量200 g左右，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK(鲁)20190003。
动物实验符合济宁市第一人民医院动物实验伦理审查标准(伦理编号：JNRM-2022-DW-023)。
1.3.2 实验试剂 青藤碱购自美国MedChemExpress公司，锌原卟啉(Zinc Protoporphyrin，HO-1抑制剂，货号：HY-101193，规格：1 mg，品牌：MCE)购自MedChemExpress公司。胰蛋白酶购自汉强生物技术有限公司，Ⅱ型胶原蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，南美胎牛血清购自澳大利亚AusGeneX公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所，Annexin V PE Apoptosis Detection Kit购自美国Biogems公司，Fast Pure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2试剂盒、HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)试剂盒、BCA Protein Quantification Kit购自南京诺唯赞公司，HO-1 Antibody、Beta Actin Antibody、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) HRP购自美国Affinity Biosciences 公司。
1.3.3 实验仪器 细胞计数仪(型号：AMQA2000，生产企业：赛默飞世尔，S/N：2187A20090034)。流式细胞仪(型号：CytoFLEX，生产企业：贝克曼(中国)，S/N：BE39397)。细胞培养箱(型号：3111，生产企业：赛默飞世尔，批号：S/N：300209779)。Multiskan™ FC酶标仪(型号：51119180，生产企业：赛默飞世尔，S/N：357-705277)。全自动化学发光图像分析系统(型号：Tanon-4600，生产企业：天能，S/N：20T12NP64-12138)。Applied Biosystems PCR热循环仪(型号：EN61326-1，生产企业：赛默飞世尔，SN：2721220120892)。
1.4 方法
1.4.1 髓核细胞体外培养 采取脱颈法处死大鼠后，浸泡于体积分数75%乙醇溶液中2 min后，转移至生物安全柜，剪开大鼠背部及尾部皮肤，无菌获得大鼠腰椎、骶椎及尾椎，小心切开椎间盘并收集髓核组织。将髓核组织用无菌眼科剪剪碎后，转移至15 mL离心管，加入适量0.25%胰蛋白酶37 ℃消化30 min，期间每5 min摇匀一次，加入含有血清的培养液终止消化。离心去上清后，加入适量Ⅱ型胶原蛋白酶消化37 ℃消化30 min后，期间每5 min摇匀一次，加入血清终止消化。离心去上清后，加入培养液并调整细胞浓度至(3-5)×108 L-1，接种至25 cm2培养瓶中，每瓶接种5 mL，置于CO2培养箱中培养。第3天时进行半量换液，之后每3 d进行全量换液。约2周后，当细胞汇合至90%以上时，即可消化进行传代培养。
1.4.2 绘制细胞生长曲线 取第1-5代髓核细胞，调整细胞浓度至5.0×108 L-1，等量接种至24孔板，每孔1 mL。接种后第1-8天，每天取3孔细胞进行计数，并计算细胞数量平均值，连续8 d。以时间(d)为横坐标，细胞数量平均值(个)为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.4.3 青藤碱浓度筛选 将第3代髓核细胞接种至96孔板，每孔100 μL，待细胞汇合至85%时，弃掉原培养液，加入含有不同浓度青藤碱的培养液。培养液中青藤碱的浓度分别为0，10，20，40，80和160 μmol/L，每组设8孔，置于二氧化碳培养箱中孵育24 h后，采用CCK-8试剂盒检测每组细胞的增殖活性。
1.4.4 实验分组 将第3代髓核细胞分为以下8组，各组培养液分别5 mL：①对照组：不做处理；②青藤碱组：培养液中含有40 μmol/L青藤碱；③IL-1β组：培养液中含有10 ng/mL IL-1β；④青藤碱+IL-1β组：培养液中含有40 μmol/L青藤碱和10 ng/mL IL-1β；⑤锌原卟啉组：培养液中含有5 μmol/L 锌原卟啉；⑥锌原卟啉+青藤碱组：培养液中含有5 μmol/L锌原卟啉和40 μmol/L 青藤碱；⑦锌原卟啉+IL-1β组：培养液中含有5 μmol/L 锌原卟啉和10 ng/mL IL-1β；⑧青藤碱+锌原卟啉+IL-1β组：培养液中含有40 μmol/L 青藤碱、5 μmol/L锌原卟啉和10 ng/mL IL-1β。在二氧化碳培养箱内孵育8 h后，检测各组细胞的增殖活性、凋亡率、活性氧含量、HO-1的mRNA和蛋白水平。
1.4.5 细胞增殖活性检测 96孔板内的髓核细胞处理结束后，弃掉原培养液。更换不含血清的培养液后，再每孔加入10 µL CCK-8溶液，继续培养2-4 h，酶标仪检测各组细胞在450 nm处的吸光度值。细胞增殖活力计算公式如下：
细胞增殖活力(%)=[A(实验)-A(空白)]/[A(对照)－A(空白)]×100%
式中A(实验)为含有不同药物和CCK-8 溶液孔的吸光度值，A(空白)为含有CCK-8 溶液而没有细胞孔的吸光度值，A(对照)为含有正常培养细胞和CCK-8 溶液孔的吸光度值。
1.4.6 流式细胞术检测髓核细胞凋亡率 各组细胞处理结束后消化收集并用预冷的PBS洗涤2遍。4 ℃离心后弃上清并加入100 µL Binding Buffer重悬细胞。对照组和实验组分别加入5 µL Annexin V-FITC和5 µL PI Staining Solution；Annexin-V组(单阳性组)加入5 µL Annexin V-FITC，PI组(单阳性组)加入5 µL PI Staining Solution，空白组细胞(双阴性组)不做处理，轻轻吹打均匀后，避光、25 ℃孵育10 min；加入400 µL Binding Buffer轻轻吹打混匀后上机检测。
1.4.7 荧光探针DCFH-DA标记法检测髓核细胞内总活性氧含量 96孔荧光酶标板内的髓核细胞处理结束后，弃掉原培养液，加入预先采用DMEM/F12培养液稀释好的10 μmol/L DCFH-DA溶液，每孔100 µL，阳性对照组内加入Rosup作为对照。置于细胞培养箱中20-30 min后，DMEM/F12培养液洗涤3遍后荧光酶标仪检测各种荧光强度(酶标仪设置参数：488 nm激发波长，525 nm发射波长)。
1.4.8 RT-PCR检测HO-1 mRNA转录 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列见表1。
使用Fast Pure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2试剂盒提取细胞总RNA，应用HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)试剂盒进行反转录。应用LightCycler®480 System
Real Time PCR扩增仪分析目的基因表达。
1.4.9 Western blot技术检测HO-1的蛋白表达 各组细胞处理结束后采用4 ℃预冷的PBS洗涤3遍，置于冰上加入裂解液，细胞刮刮取细胞后，转入1.5 mL离心管。4 ℃、15 000 r/min离心15 min，取上清采用BCA Protein Quantification Kit检测蛋白样品浓度，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)后，金属浴加热至100 ℃，煮沸5 min。等量上样后进行电泳、转膜。取出PVDF膜加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST溶液清洗3遍后，加入二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h后，TBST溶液清洗3遍。滴加适量ECL工作液，使ECL工作液覆盖PVDF 膜，室温孵育两三分钟后，采用全自动化学发光图像分析系统进行显影并采集图像。
1.5 主要观察指标 细胞分组处理结束后，分别检测各组髓核细胞的增殖活性、凋亡率、细胞内活性氧含量以及HO-1的表达量。
1.6 统计学分析 实验结果采用SPSS 18.0(美国IBM公司)进行数据分析，应用GraphPad Prism 8(美国GraphPad Software公司)进行统计绘图。计量资料以x±s表示，两组数据之间采用独立样本t检验进行分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经济宁市第一人民医院生物统计学专家审核。
