椎间盘退变程度与髓核中miRNA-142-3p、混合谱系激酶3及白细胞介素1β的相关性

doi:10.12307/2023.966

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (2): 165-171.doi: 10.12307/2023.966

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 下一篇

椎间盘退变程度与髓核中miRNA-142-3p、混合谱系激酶3及白细胞介素1β的相关性

周树良，徐良，钱学峰，曾金才，朱立帆

苏州市第九人民医院，江苏省苏州市 215200

收稿日期:2022-10-19 接受日期:2023-01-04 出版日期:2024-01-18 发布日期:2023-06-29
通讯作者: 朱立帆，主任医师，苏州市第九人民医院骨科，江苏省苏州市 215200
作者简介:周树良，男，1987年生，江苏省吴江市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事脊柱外科、创伤骨科研究。
基金资助:
苏州市科技发展计划(民生科技)项目(SS202090)，项目负责人：朱立帆；苏州市吴江区“科教兴卫”项目(WWK202006)，项目负责人：朱立帆

Correlation between the expression of miRNA-142-3p, mixed lineage kinase 3 and interleukin-1beta in nucleus pulposus and the degree of lumbar intervertebral disc degeneration

Zhou Shuliang, Xu Liang, Qian Xuefeng, Zeng Jincai, Zhu Lifan

Suzhou Ninth People’s Hospital, Suzhou 215200, Jiangsu Province, China

Received:2022-10-19 Accepted:2023-01-04 Online:2024-01-18 Published:2023-06-29
Contact: Zhu Lifan, Chief physician, Suzhou Ninth People’s Hospital, Suzhou 215200, Jiangsu Province, China
About author:Zhou Shuliang, Master, Attending physician, Suzhou Ninth People’s Hospital, Suzhou 215200, Jiangsu Province, China
Supported by:
Suzhou Science and Technology Development Plan for People’s Wellbeing, No. SS202090 (to ZLF); Suzhou Wujiang District "Science and Education for Health" Project, No. WWK202006 (to ZLF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

椎间盘退变：是指因椎间盘的形态和生理功能发生重大变化，最终导致其承压和扭转负荷能力下降的疾病，该病发病因素复杂，与遗传、年龄、过度力学负载、外伤等密切相关。椎间盘退变是诱发成年人腰痛的重要原因之一，也是导致腰椎管狭窄症、腰椎间盘突出症等椎间盘退行性疾病的病理生理学基础，严重者甚至可以导致患者劳动能力的丧失。

miRNA：是一类具有生物活性的非编码短链RNA，它们能够通过与mRNA 3’UTR端的特异性互补序列相结合从而介导mRNA的降解或是抑制蛋白质的翻译。因此，miRNA是调控其他蛋白质编码基因的基因，在调节细胞稳态的机制中发挥重要作用。

背景：研究表明，miRNA水平与椎间盘细胞的凋亡和增殖、细胞外基质代谢和炎症反应密切相关，而miR-142-3p在椎间盘退变中的具体作用尚不清楚。
目的：探讨人腰椎间盘髓核组织中 miRNA-142-3p、混合谱系激酶3、白细胞介素1β表达与椎间盘退变程度的相关性。
方法：选择2020年1月至2022年3月在苏州市第九人民医院因腰椎间盘退行性疾病而行手术的患者82例，术前均行MRI 检查，根据Videman分级标准将患者分为轻度退变组(n=36)、中度退变组(n=26)和重度退变组(n=20)，获取82份髓核组织标本，检测各组髓核组织中 miRNA-142-3p、混合谱系激酶3、白细胞介素1β、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的基因表达，以及混合谱系激酶3、白细胞介素1β、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的蛋白表达，采用Spearman相关系数法评估miRNA-142-3p、混合谱系激酶3、白细胞介素β表达与腰椎间盘退变程度的相关性。采用随机数字表法将30只成年SD大鼠分为假手术组(仅穿刺皮肤与肌肉后处死)、轻度退变组(穿刺Co7/8椎间盘1周后处死)与重度退变组(穿刺Co7/8椎间盘2周后处死)，每组10只，检测各组髓核组织中混合谱系激酶3、白细胞介素1β的蛋白表达，以及miRNA-142-3p、混合谱系激酶3、白细胞介素1β的基因表达。

结果与结论：①人髓核组织：miRNA-142-3p的表达由高到低的顺序为轻度退变组>中度退变组>重度退变组(P < 0.05)，混合谱系激酶3、白细胞介素1β 基因与蛋白表达由低到高的顺序为：轻度退变组<中度退变组<重度退变组(P < 0.05)，Ⅰ型胶原基因与蛋白表达由低到高的顺序为：轻度退变组<中度退变组<重度退变组(P < 0.05)，Ⅱ型胶原基因与蛋白表达由高到低的顺序为：轻度退变组>中度退变组>重度退变组的趋势(P < 0.05)；Spearman相关分析显示，椎间盘退变程度与miRNA-142-3p表达呈负相关(P < 0.05)，与混合谱系激酶3、白细胞介素1β表达呈正相关(P < 0.05)；②大鼠髓核组织：与假手术组比较，轻度退变组髓核组织中混合谱系激酶3、白细胞介素1β 基因与蛋白表达升高(P < 0.05)，miRNA-142-3p表达降低(P < 0.05)；与轻度退变组比较，重度退变组髓核组织中混合谱系激酶3、白细胞介素1β 基因与蛋白表达升高(P < 0.05)，miRNA-142-3p表达降低(P < 0.05)；③结果表明，人腰椎间盘退变程度与髓核组织中 miRNA-142-3p表达呈负相关，与混合谱系激酶3和白细胞介素1β表达呈正相关。

https://orcid.org/0000-0003-1995-0076(周树良)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 腰椎间盘, 髓核组织, miRNA-142-3p, 混合谱系激酶3, 白细胞介素1β, 相关性

Abstract: BACKGROUND: MicroRNA (miRNA) levels are closely related to cell apoptosis and proliferation, extracellular matrix metabolism and inflammatory response in intervertebral disc cells. However, the specific role of miR-142-3p in lumbar intervertebral disc degeneration remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the correlation between the expression of miRNA-142-3p, mixed lineage kinase 3 and interleukin-1β in nucleus pulposus tissue and degree of human lumbar intervertebral disc degeneration.
METHODS: A total of 82 patients with lumbar intervertebral disc degenerative diseases in Suzhou Ninth People’s Hospital from January 2020 to March 2022 were collected as the study subjects, all of whom underwent MRI examination before operation. According to the Videman classification, the patients were divided into mild degeneration group (n=36), moderate degeneration group (n=26) and severe degeneration group (n=20). Eighty-two specimens of the nucleus pulposus were obtained. The mRNA expression of miRNA-142-3p as well as the mRNA and protein expression of mixed lineage kinase 3, interleukin-1β, type I collagen, type II collagen in nucleus pulposus tissue were detected by qPCR and western blot assay. The correlation between the degree of human lumbar intervertebral disc degeneration and the expression levels of miRNA-142-3p, mixed lineage kinase 3, and interleukin-1β was also assessed using the Spearman correlation coefficient method. Thirty adult Sprague-Dawley rats were divided into sham-operated group (executed after puncturing skin and muscle only), mild degeneration group (executed 1 week after puncturing Co7/8 segments) and severe degeneration group (executed 2 weeks after puncturing Co7/8 segments), with 10 rats in each group. After that, we detected the protein expression of mixed lineage kinase 3 and interleukin-1β as well as the gene expression of miRNA-142-3p, mixed lineage kinase 3 and interleukin-1β in the nucleus pulposus tissue.
RESULTS AND CONCLUSION: In human nucleus pulposus tissue, the miRNA-142-3p expression ranked from high to low as follows: mild degeneration group > moderate degeneration group > severe degeneration group (P < 0.05); the gene and protein expression of mixed lineage kinase 3 and interleukin-1β from low to high was as follows: mild degeneration group < moderate degeneration group < severe degeneration group (P < 0.05); the gene and protein expression of type I collagen from low to high was as follows: mild degeneration group < moderate degeneration group < severe degeneration group (P < 0.05), and the gene and protein expression of type I collagen from high to low was as follows: mild degeneration group > moderate degeneration group > severe degeneration group (P < 0.05). Spearman correlation analysis showed that the degree of disc degeneration was negatively correlated with miRNA-142-3p expression (P < 0.05) and positively correlated with mixed lineage kinase 3 and interleukin-1β expression (P < 0.05). In rat nucleus pulposus tissue, compared with the sham-operated group, the expression of mixed lineage kinase 3 and interleukin-1β gene and protein was elevated in the mild degeneration group (P < 0.05) while miRNA-142-3p expression was decreased (P < 0.05); compared with the mild degeneration group, the expression of mixed lineage kinase 3 and interleukin-1β gene and protein was increased in the severe degeneration group (P < 0.05) while miRNA-142-3p expression was decreased (P < 0.05). To conclude, the degree of human lumbar intervertebral disc degeneration is negatively correlated with miRNA-142-3p expression and positively correlated with mixed lineage kinase 3 and interleukin-1β expression in nucleus pulposus tissue.

Key words: lumbar intervertebral disc degeneration, nucleus pulposus tissue, miRNA-142-3p, mixed lineage kinase 3, interleukin-1β, correlation

中图分类号:

周树良, 徐良, 钱学峰, 曾金才, 朱立帆. 椎间盘退变程度与髓核中miRNA-142-3p、混合谱系激酶3及白细胞介素1β的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 165-171.

Zhou Shuliang, Xu Liang, Qian Xuefeng, Zeng Jincai, Zhu Lifan. Correlation between the expression of miRNA-142-3p, mixed lineage kinase 3 and interleukin-1beta in nucleus pulposus and the degree of lumbar intervertebral disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(2): 165-171.

图/表（结果） 7

2.1 各组患者一般资料比较 3组患者典型的MRI T2加权成像如图1所示。3组患者在性别、年龄、吸烟史、高血压病史及糖尿病病史方面比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，3组患者的体质量指数比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.2 各组人髓核组织中相关基因表达的比较 3组人髓核组织中miRNA-142-3p的基因表达由高到低的顺序为：轻度退变组>中度退变组>重度退变组(P < 0.05)；MLK3、白细胞介素1β基因表达由低到高的顺序为：轻度退变组<中度退变组<重度退变组(P < 0.05)，见图2。

2.3 各组人髓核组织中 MLK3、白细胞介素1β蛋白表达比较 3组人髓核组织中 MLK3、白细胞介素1β蛋白表达由低到高的顺序为：轻度退变组<中度退变组<重度退变组(P < 0.05)，见图3。

2.4 各组人髓核组织中Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原表达的比较各组人髓核组织Ⅰ型胶原基因与蛋白的表达由低到高的顺序为：轻度退变组<中度退变组<重度退变组(P < 0.05)，Ⅱ型胶原基因与蛋白的表达由高到低的顺序为：轻度退变组>中度退变组>重度退变组(P < 0.05)，见图4。

2.5 人腰椎间盘髓核组织中 miRNA-142-3p、MLK3、白细胞介素1β表达与退变程度的相关性 Spearman相关性分析结果显示，椎间盘退变程度与miRNA-142-3p表达呈负相关(r < 0，P < 0.05)，与MLK3基因、白细胞介素1β基因表达及MLK3、白细胞介素1β蛋白呈正相关(r > 0，P < 0.05)，见表3。

2.6 miRNA-142-3p、MLK3、白细胞介素1β在大鼠尾椎间盘退变中的表达情况为了进一步验证miRNA-142-3p、MLK3、白细胞介素1β与椎间盘退变的相关性，采用针刺诱导椎间盘退变模型。通过MRI检测发现，针刺1周后，髓核部分区域含水量消失，髓核区缩小，椎间盘表现出轻度退变；针刺2周后，髓核含水量基本消失，呈现重度退变，见图5A。qPCR和Western Blot检测结果显示，与假手术组比较，轻度退变组髓核组织中MLK3、白细胞介素1β 基因与蛋白表达升高(P < 0.05)，miRNA-142-3p表达降低(P < 0.05)；与轻度退变组比较，重度退变组髓核组织中MLK3、白细胞介素1β基因与蛋白表达升高(P < 0.05)，miRNA-142-3p表达降低(P < 0.05)，见图5B-D，这结果很好地佐证了临床标本结果。

参考文献

[1] MA H, XIE C, CHEN Z, et al. MFG-E8 alleviates intervertebral disc degeneration by suppressing pyroptosis and extracellular matrix degradation in nucleus pulposus cells via Nrf2/TXNIP/NLRP3 axis. Cell Death Discov. 2022;8(1):209-223.
[2] FRANCISCO V, PINO J, GONZÁLEZ-GAY MÁ, et al. A new immunometabolic perspective of intervertebral disc degeneration. Nat Rev Rheumatol. 2022;18(1):47-60.
[3] VOS T, ABAJOBIR AA, ABATE KH, et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 2017;390(10100):1211-1259.
[4] KAMALI A, ZIADLOU R, LANG G, et al. Small molecule-based treatment approaches for intervertebral disc degeneration: Current options and future directions. Theranostics. 2021;11(1):27-47.
[5] ASHINSKY B, SMITH HE, MAUCK RL, et al. Intervertebral disc degeneration and regeneration: a motion segment perspective. Eur Cell Mater. 2021;41:370-387.
[6] ZHANG X, HU Y, CHENG P, et al. Targeted therapy for intervertebral disc degeneration: inhibiting apoptosis is a promising treatment strategy, Int J Med Sci. 2021;18(13):2799-2813.
[7] KOS N, GRADISNIK L, VELNAR T. A Brief Review of the Degenerative Intervertebral Disc Disease. Med Arch. 2019;73(6):421-424.
[8] HUGHES SPF, FREEMONT AJ, HUKINS DWL, et al. The pathogenesis of degeneration of the intervertebral disc and emerging therapies in the management of back pain. J Bone Joint Surg Br. 2012;94(10):1298-304.
[9] KRUT Z, PELLED G, GAZIT D, et al. Stem Cells and Exosomes: New Therapies for Intervertebral Disc Degeneration. Cells. 2021;10(9):2241-2259.
[10] ATTWATERS M. Kindlin-2 reduces IVD inflammation. Nat Rev Rheumatol. 2022;18(3):125.
[11] COSAMALON-GAN I, COSAMALON-GAN T, MATTOS-PIAGGIO G, et al. Inflammation in the intervertebral disc herniation. Neurocirugia
(Astur : Engl Ed). 2021;32(1):21-35.
[12] WUERTZ K, VO N, KLETSAS D, et al. Inflammatory and catabolic signalling in intervertebral discs: the roles of NF-kappaB and MAP kinases. Eur Cell Mater. 2012;23:103-120.
[13] PHILLIPS KL, CULLEN K, CHIVERTON N, et al. Potential roles of cytokines and chemokines in human intervertebral disc degeneration: interleukin-1 is a master regulator of catabolic processes. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(7):1165-1177.
[14] MILLWARD-SADLER SJ, COSTELLO PW, FREEMONT AJ, et al. Regulation of catabolic gene expression in normal and degenerate human intervertebral disc cells: implications for the pathogenesis of intervertebral disc degeneration. Arthritis Res Ther. 2009;11(3):R65.
[15] YANG X, WANG L, YUAN ZQ, et al. Interleukin-1beta induces apoptosis in annulus fibrosus cells through the extracellular signal-regulated kinase pathway. Connect Tissue Res. 2018;59(6):593-600.
[16] KOBAYASHI S, MEIR A, KOKUBO Y, et al. Ultrastructural analysis on lumbar disc herniation using surgical specimens: role of neovascularization and macrophages in hernias. Spine (Phila Pa 1976). 2009;34(7):655-662.
[17] CRAWLEY O, GILES AC, DESBOIS M, et al. A MIG-15/JNK-1 MAP kinase cascade opposes RPM-1 signaling in synapse formation and learning. PLoS Genet. 2017;13(12):e1007095.
[18] KUMAR S, SINGH SK, RANA B, et al. The regulatory function of mixed lineage kinase 3 in tumor and host immunity. Pharmacol Ther. 2021; 219:107704.
[19] LIN XL, ZHENG ZY, ZHANG QS, et al. Expression of miR-195 and its target gene Bcl-2 in human intervertebral disc degeneration and their effects on nucleus pulposus cell apoptosis. J Orthop Surg Res. 2021;16(1):412.
[20] ZHANG HJ, LIAO HY, BAI DY, et al. MAPK /ERK signaling pathway: A potential target for the treatment of intervertebral disc degeneration. Biomed Pharmacother. 2021;143:112170.
[21] SEGUIN CA, BOJARSKI M, PILLIAR RM, et al. Differential regulation of matrix degrading enzymes in a TNFalpha-induced model of nucleus pulposus tissue degeneration. Matrix Biol. 2006;25(7):409-418.
[22] STUDER RK, GILBERTSON LG, GEORGESCU H, et al. p38 MAPK inhibition modulates rabbit nucleus pulposus cell response to IL-1. J Orthop Res. 2008;26(7):991-998.
[23] WANG J, DENG B, LIU Q, et al. Pyroptosis and ferroptosis induced by mixed lineage kinase 3 (MLK3) signaling in cardiomyocytes are essential for myocardial fibrosis in response to pressure overload. Cell Death Dis. 2020;11(7):574.
[24] RATTANASINCHAI C, GALLO KA. MLK3 Signaling in Cancer Invasion. Cancers (Basel). 2016;8(5):51-67.
[25] ZHU Y, SUN JM, SUN ZC, et al. MLK3 Is Associated With Poor Prognosis in Patients With Glioblastomas and Actin Cytoskeleton Remodeling in Glioblastoma Cells. Front Oncol. 2020;10:600762.
[26] DISTEFANO TJ, VASO K, DANIAS G, et al. Extracellular Vesicles as an Emerging Treatment Option for Intervertebral Disc Degeneration: Therapeutic Potential, Translational Pathways, and Regulatory Considerations. Adv Healthc Mater. 2022;11(5):e2100596.
[27] SAKAUE S, HIRATA J, MAEDA Y, et al. Integration of genetics and miRNA-target gene network identified disease biology implicated in tissue specificity. Nucleic Acids Res. 2018;46(22):11898-11909.
[28] CAI Y, XU L, XU C, et al. Hsa_circ_0001445 inhibits ox-LDL-induced HUVECs inflammation, oxidative stress and apoptosis by regulating miRNA-640. Perfusion. 2022;37(1):86-94.
[29] ZHU L, SHI Y, LIU L, et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes ameliorate nucleus pulposus cells apoptosis via delivering miR-142-3p: therapeutic potential for intervertebral disc degenerative diseases. Cell Cycle. 2020;19(14):1727-1739.
[30] TILOTTA V, VADALà G, AMBROSIO L, et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes: The New Frontier for the Treatment of Intervertebral Disc Degeneration. Appl Sci. 2021;11(23):11222-11240.
[31] COSTACHESCU B, NICULESCU AG, TELEANU RI, et al. Recent Advances in Managing Spinal Intervertebral Discs Degeneration. Int J Mol Sci. 2022;23(12):6460-6483.
[32] VERGROESEN PP, KINGMA I, EMANUEL KS, et al. Mechanics and biology in intervertebral disc degeneration: a vicious circle. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(7):1057-1070.
[33] SANDY JD. Proteoglycan core proteins and catabolic fragments present in tissues and fluids. Methods Mol Biol. 2001;171:335-345.
[34] TEIXEIRA GQ, PEREIRA CL, FERREIRA JR, et al. Immunomodulation of Human Mesenchymal Stem/Stromal Cells in Intervertebral Disc Degeneration: Insights From a Proinflammatory/Degenerative Ex Vivo Model. Spine (Phila Pa 1976). 2018;43(12):E673-E682.
[35] YANG W, YU XH, WANG C, et al. Interleukin-1beta in intervertebral disk degeneration. Clin Chim Acta. 2015;450:262-272.
[36] WANG Y, CHE M, XIN J, et al. The role of IL-1beta and TNF-alpha in intervertebral disc degeneration. Biomed Pharmacother. 2020;131: 110660.
[37] RISBUD MV, SHAPIRO IM. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nat Rev Rheumatol. 2014;10(1): 44-56.
[38] LI S, HUANG C, XIAO J, et al. The Potential Role of Cytokines in Diabetic Intervertebral Disc Degeneration. Aging Dis. 2022;13(5):1323-1335.
[39] CHEN ZH, JIN SH, WANG MY, et al. Enhanced NLRP3, caspase-1, and IL- 1beta levels in degenerate human intervertebral disc and their association with the grades of disc degeneration. Anat Rec (Hoboken). 2015;298(4):720-726.
[40] KANG H, DONG Y, PENG R, et al. Inhibition of IRE1 suppresses the catabolic effect of IL-1beta on nucleus pulposus cell and prevents intervertebral disc degeneration in vivo. Biochem Pharmacol. 2022; 197:114932.
[41] CANNATA F, VADALA G, AMBROSIO L, et al. Intervertebral disc degeneration: A focus on obesity and type 2 diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 2020;36(1):e3224.
[42] GRUBER HE, HOELSCHER GL, INGRAM JA, et al. Senescent vs. non-senescent cells in the human annulus in vivo: cell harvest with laser capture microdissection and gene expression studies with microarray analysis. BMC Biotechnol. 2010;10(1):1-10.
[43] HUMPHREY RK, YU SM, BELLARY A, et al. Lysine 63-linked ubiquitination modulates mixed lineage kinase-3 interaction with JIP1 scaffold protein in cytokine-induced pancreatic beta cell death. J Biol Chem. 2013;288(4):2428-2440.
[44] CAZZANELLI P, WUERTZ-KOZAK K. MicroRNAs in Intervertebral Disc Degeneration, Apoptosis, Inflammation, and Mechanobiology. Int J Mol Sci. 2020;21(10):3601.
[45] ZHU J, ZHANG X, GAO W, et al. lncRNA/circRNA‑miRNA‑mRNA ceRNA network in lumbar intervertebral disc degeneration. Mol Med Rep. 2019;20(4):3160-3174.
[46] LUAN X, ZHOU X, FALLAH P, et al. MicroRNAs: Harbingers and shapers of periodontal inflammation. Semin Cell Dev Biol. 2022;124:85-98.
[47] ZINGALE VD, GUGLIANDOLO A, MAZZON E. MiR-155: An Important Regulator of Neuroinflammation. Int J Mol Sci. 2021;23(1):90-113.
[48] KEOROCHANA G, JOHNSON JS, TAGHAVI CE, et al. The effect of needle size inducing degeneration in the rat caudal disc: evaluation using radiograph, magnetic resonance imaging, histology, and immunohistochemistry. Spine J. 2010;10(11):1014-1023.

引言

腰痛为临床常见病，据统计，全球范围内有80%-85%的人群有不同程度的腰痛表现，给社会带来了巨大的临床和社会经济负担[1-2]。腰痛与椎间盘退变密切相关，同时椎间盘退变也是导致腰椎管狭窄症、腰椎间盘突出症等椎间盘退行性疾病的病理生理学基础[3-4]。在健康的椎间盘内，髓核细胞具有良好的生物学功能，胞外基质合成能力强，可维持髓核的水化能力，是椎间盘维持力学支撑作用的关键[5-6]。然而在外界病理因素的作用下，髓核细胞生物学功能下降，细胞外基质合成能力明显降低，导致髓核含水量降低，引起髓核退变、椎间盘力学失稳、纤维环破裂等一系列病理事件，进而引发一系列相应的椎间盘退变临床症状[7]。椎间盘退变发病因素复杂，与遗传、年龄、过度力学负载、外伤等密切相关[8-9]。近年来，随着对椎间盘退变研究的不断深入，发现炎症反应是导致椎间盘退变的重要因素[10-11]。在病理椎间盘组织中，炎症因子水平升高，如白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8和肿瘤坏死因子α等[12]。先前研究已证实，白细胞介素1β是一种重要的促炎细胞因子，具有很强的促炎活性，可诱导多种促炎递质产生，在椎间盘退变的发病机制中发挥关键作用[13-14]。而且，抑制白细胞介素1β可以抑制细胞凋亡和阻止椎间盘退变[15]。也有研究发现，在椎间盘突出组织周围的炎症反应有助于椎间盘突出的消退[16]。因此，在开发成功的椎间盘突出治疗方法之前，需要对参与椎间盘退变炎症反应的调节介质有更深入的了解。
混合谱系激酶3(mixed lineage kinase 3，MLK3)是一个分子质量为97 kD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是丝裂原活化蛋白激酶(MAP3K)[17-18]。MAPK家族由ERK1/2、JNK和 p38 MAPK 蛋白组成。ERK介导细胞的炎症反应和增殖，p38 MAPK作为促炎递质调节细胞凋亡和炎症反应，JNK则是一种介导细胞凋亡的神经营养因子[19]。研究表明，MAPK信号通路能够通过改变椎间盘中合成和分解基因的表达，影响蛋白多糖的降解[20]。特别是，p38和ERK信号通路已被证明在蛋白多糖代谢中发挥重要作用[21]，使用p38或ERK的化学抑制剂可以显著抵消促炎因子诱导的蛋白多糖含量、合成和释放的减少[22]，这表明MAPK信号通路在调节椎间盘基质稳态中起着至关重要的作用。MLK3是MAP2Ks和MAPKs的上游调控因子，能够激活下游JNK、p38 MAPK和ERK1/2活性，导致各种生物功能，包括蛋白质运输、细胞骨架重排、离子运输和内噬作用等[23-25]。然而，MLK3在椎间盘退变这一过程中的作用尚不清楚。
越来越多的证据表明，微小核糖核酸(micro RNAs，miRNAs)在椎间盘退变进程中的作用，可能介导了髓核细胞凋亡和增生、细胞外基质合成、炎症反应以及软骨终板退变等。miRNAs是一类非编码RNA分子，通过与互补的靶mRNA结合导致mRNA的翻译抑制或降解，在细胞分化、增殖和存活中起核心作用[26]。在发育过程中，miRNA的表达是组织特异性的，这表明miRNA可能有助于维持组织的特性[27]。有研究发现，腰椎间盘退行性疾病患者的髓核样本中miRNA92表达水平增强，并通过靶向ARID2促进退化髓核细胞的增殖。另有报道显示，退变髓核细胞中miRNA154升高，临床上可通过抑制miRNA154表达增加Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖而延缓腰椎退变性疾病的进展。此外，CAI等[28]提出，检测特异性表达的miRNA可能对腰椎退行性病变的治疗进展有监测作用。前期研究工作发现，miRNA-142-3p可以靶向MLK3抑制MAPK信号通路的活化，减缓白细胞介素1β介导的髓核细胞炎症反应[29]。但是miRNA-142-3p是否具有监测或防治椎间盘退变的作用仍需进一步探讨。因此，此次研究探讨了miRNA-142-3p、MLK3和白细胞介素1β在人退变椎间盘中的表达水平，并分析了其与椎间盘退变分级的相关性，以期能为腰椎退行性病变的诊断及治疗提供一定的参考依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计人和大鼠椎间盘组织退变标本数据分析，采用方差分析行多组间比较，Spearman相关系数法行相关性分析。
1.2 时间及地点试验于2020年1月至2022年3月在苏州市第九人民医院完成。
1.3 对象选择2020年1月至2022年3月在苏州市第九人民医院因腰椎间盘退变性疾病而行手术的患者82例，其中男44例，女38例，年龄47-63岁，获取髓核组织标本82份，对髓核组织标本进行研究。研究获得苏州市第九人民医院临床医学研究伦理委员会批准[院2020伦研批(23)号]。
术前均行 MRI 检查，在 T2加权成像上进行腰椎间盘Videman分级：0分，髓核显示为高强度信号，未见退变征象；1分，信号强度出现轻度降低；2分，信号强度有中等降低；3分，信号缺失。根据髓核前、中、后3部分之和评估椎间盘退变程度，总分1-3分者为轻度退变组(n=36)；4-6分者为中度退变组(n=26)；7-9分者为重度退变组(n=20)。
纳入标准：①经影像学检查证实为腰椎退行性病变；②术前至少接受3个月正规保守治疗，且治疗效果不明显；③研究对象对试验内容知情同意。
排除标准：①拟分析相关资料不全者；②椎间盘感染、肿瘤、结核的患者；③既往有腰椎手术史的患者；④其他代谢性、消耗性疾病患者。
1.4 材料
1.4.1 试剂与仪器 RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜(上海碧云天生物技术有限公司)；HRP山羊抗兔二抗(中国BBI生命科学有限公司)；引物(上海生工生物工程股份有限公司)；MagMAX™ mirVana™ 总 RNA分离试剂盒(美国Thermo Fisher公司)；反转录试剂盒、qPCR试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)；兔抗MLK3(Cell Signaling Technology)；兔抗白细胞介素1β、β-actin(Abclonal)；兔抗Ⅰ型胶原、兔抗Ⅱ型胶原(Abcam)。超速离心机、PCR仪、NanoDrop 2000C超微量分光光度计(美国Thermo Fisher公司)；实时荧光定量PCR仪、ChemiDoc™ Touch化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司)；全波长自动酶标仪(美国Bio-Tek公司)。
1.4.2 实验动物 10周龄雄性SD大鼠30只，体质量约350 g，购自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司，许可证号：SCXK(苏)2018-0006。采用随机数字表法将30只SD大鼠分为假手术组、轻度退变组、重度退变组，每组10只。实验方案通过苏州大学伦理委员会审查批准，伦理号：SUDA20220830A01。
1.5 方法

1.5.1 qPCR检测各组髓核组织中相关基因的表达取3组人髓核组织标本，检测miRNA-142-3p、MLK3、白细胞介素1β、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的基因表达。简而言之，应用MagMAX™ mirVana™总RNA分离试剂盒提取总RNA和miRNA，取RNA 2 μg反转录合成cDNA，取 cDNA 1 μL 进行qPCR。反应条件：95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复 3 次。引物序列见表1。

1.5.2 Western Blot检测髓核组织中相关蛋白的表达取3组人髓核组织标本，检测MLK3、白细胞介素1β、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的蛋白表达。取冻存组织标本加入蛋白裂解液，匀浆器研磨，冰上裂解，12 000×g离心15 min后收集上清液，采用BCA法测定蛋白样品浓度。每组取等质量蛋白上样，将蛋白于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，室温5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入适当浓度一抗(MLK3、白细胞介素1β、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原，稀释比例均为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，漂洗，加入HRP山羊抗兔二抗(1∶1 000)室温孵育1 h 后，洗膜，ECL发光。利用Image J 软件分析条带灰度值。
1.5.3 动物实验验证
实验造模：禁食24 h后，腹腔注射2%戊巴比妥(40 mg/kg，苏州市第九人民医院中心实验室提供)麻醉3组大鼠，轻度退变组、重度退变组采用21 G针头行SD大鼠尾椎针刺法建造椎间盘退变模型。假手术组采用21G针穿刺皮肤和肌肉(深度约为2 mm)，不损伤椎间盘，随后处死。轻度退变组、重度退变组定位大鼠7/8尾椎间盘(Co7/8)，穿刺Co7/8椎间盘，以平行终板方向刺入，刺入后缓慢旋转360°并维持30 s，轻度退变组针刺1周后处死，重度退变组针刺2周后麻醉状态下处死，进行MRI 检查以确定椎间盘退变程度。

检测指标：处死后取Co7/8椎间盘，检测各组髓核组织中MLK3、白细胞介素1β的蛋白表达，以及miRNA-142-3p、MLK3、白细胞介素1β的基因表达。检测方法同上。

1.6 主要观察指标人髓核组织中miRNA-142-3p、MLK3、白细胞介素1β、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的基因表达，以及MLK3、白细胞介素1β、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的蛋白表达，采用Spearman相关系数法评估miRNA-142-3p、MLK3、白细胞介素1β表达与腰椎间盘退变程度的相关性；大鼠髓核组织中MLK3、白细胞介素1β的蛋白表达，以及miRNA-142-3p、MLK3、白细胞介素1β的基因表达。
1.7 统计学分析采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，在单因素分析中，计数资料以n/%表示并行χ2 检验，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多个均数之间两两比较行LSD-t检验，相关性分析采用Spearman相关系数法，均以P < 0.05认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经苏州市第九人民医院生物统计学专家审核。

讨论

目前关于椎间盘退变的机制尚未完全明确，髓核细胞的退化、凋亡及炎症状态均在椎间盘退变中发挥着重要的作用[30-31]。在椎间盘退变的病理变化中，细胞外基质的合成代谢和分解代谢发生紊乱后引起细胞外基质结构的重建，主要表现为蛋白多糖含量减少和Ⅱ型胶原向Ⅰ型胶原转变，导致髓核组织的水结合能力丧失，最终诱发椎间盘退变[32]。近年来的研究表明，细胞外基质成分的降解可以触发炎症反应，而且炎症反应不仅可以直接抑制细胞外基质的合成，还能上调基质分解酶的表达，如基质金属酶和血小板反应蛋白去整合素和金属蛋白酶[33-34]，导致基质持续降解和慢性炎症反应。
炎症反应和炎症细胞因子的释放是导致椎间盘源性疼痛的关键因素之一，是椎间盘退变的标志之一。白细胞介素1β是白细胞介素1家族中一种重要的炎症细胞因子，参与椎间盘退变的发生发展[35]。研究发现，白细胞介素1β能够诱导多种炎症因子的产生，从而发挥其强大的促炎作用，最终导致炎症的持续存在与扩大[36]，因此，有研究指出由白细胞介素1β加剧的炎症过程是椎间盘退变的关键事件[37]。大量研究表明，在退行性椎间盘中白细胞介素1β水平显著升高，而且参与了椎间盘退变的多种病理过程[38-39]。前期也发现，白细胞介素1β可以降低髓核细胞活性，诱导细胞凋亡[29]。此外，已有研究证实，拮抗白细胞介素1β的作用可以保护椎间盘细胞，缓解椎间盘退变[40]。此次研究首先从基因和蛋白水平检测了白细胞介素1β表达，结果发现白细胞介素1β表达水平的增加与椎间盘退变严重程度有关，与CHEN等[39]报道相似。椎间盘严重退变患者的体质量指数高于轻度退变患者，这可能与过重的体质量增加了腰椎的力学负荷有关。此外，肥胖被是认为是一种系统性的炎症疾病，可导致椎间盘细胞凋亡、自噬和基质分解的增强[41]，因此，肥胖也被认为是椎间盘退变的危险因素之一，这提示有效控制体质量有助于延缓椎间盘退变。
炎症因子和基质金属蛋白酶的表达和合成的增加是由特定的信号通路介导的。由MAPK介导的炎症信号通路已被确定是参与调节骨关节软骨炎症反应和分解代谢的主要因子。最近越来越多的证据支持，MAPK信号通路在椎间盘退行性疾病中的重要性[12]。GRUBER等[42]研究发现，与非衰老细胞相比，p38 MAPK基因在衰老的椎间盘细胞中表达上调，并且p38的激活可导致白细胞介素1β表达增加。此外，白细胞介素1β水平的升高能够诱导牛、兔和人的椎间盘细胞中ERK、p38和JNK通路的激活[12]。MLK3作为MAPK信号通路的上游，对这些下游信号通路激活至关重要。研究表明，白细胞介素1β能够使MLK3泛素化，促进MLK3随后的二聚化、自磷酸化和催化活化[43]，因此，研究进一步检测了MLK3在各程度退变椎间盘中的表达。结果表明，MLK3在各组中表达水平呈轻度退变组<中度退变组<重度退变组的趋势。此外还发现，Ⅱ型胶原的含量随着椎间盘退变程度的增加而减少，相反地，Ⅰ型胶原的含量逐渐升高。Ⅱ型胶原是髓核组织重要的细胞外基质成分之一，对维持髓核生理功能具有重要意义，其含量的下降反映出髓核功能的破坏、基质的降解，与白细胞介素1β和MLK3表达升高密切相关。Ⅰ型胶原虽然也是椎间盘组织的基质成分之一，但是Ⅰ型胶原持续升高可能提示椎间盘纤维化[32]。
已有文献报道，miRNA的失调与多种病理状况有关，包括癌症、心血管疾病、骨关节炎和椎间盘退变[44]。ZHU等[45]指出，miRNA与其他内源性RNA(如长非编码RNA、环状RNA和mRNA)相互作用，在椎间盘细胞中形成广泛的基因调控网络，并且miRNA与炎症反应之间具有密切联系，无论是作为细胞对炎症环境的反应的一部分，还是通过调节异常的细胞因子导致炎症反应，在许多疾病中都有描述[46-47]。前期研究发现，MLK3是miR-142-3p的靶标，而且miR-142-3p能够通过靶向MLK3抑制白细胞介素1β诱导的MAPK信号激活及髓核细胞的凋亡[29]，这提示miR-142-3p在椎间盘退变防治中具有重要作用。进一步的检测结果发现，miR-142-3p的表达水平随着椎间盘退变程度的增加而降低，随后的相关性分析也表明，椎间盘退变程度与miRNA-142-3p表达呈负相关，与MLK3、白细胞介素1β含量呈正相关。
为了进一步验证临床标本结果，通过大鼠尾椎针刺损伤制作不同程度的椎间盘退变模型。针刺穿伤因其可重复性和短期退行性改变而成为最常用的损伤建立模型[48]。通过核磁共振检测发现，针刺后1周和2周时就表现出不同程度的退变；进一步的实验结果显示，随着椎间盘退变程度的加重，白细胞介素1β和MLK3的表达逐渐上升，然而miR-142-3p表达水平呈现出相反的趋势。虽然这些结果很好地佐证了之前的研究结果，但是仍需延长观察时间，同时结合其他的危险因素比如力学负荷、衰老等，深入探究miR-142-3p、MLK3、白细胞介素1β三者的作用机制以及在椎间盘退变中发挥的作用。
综上所述，人退变腰椎间盘中miRNA-142-3p表达随着退变程度的加重而减少，并呈负相关；MLK3和白细胞介素1β表达随着椎间盘退变程度的加重而增加，呈正相关。这些发现加深了人们对腰椎退变性疾病的分子病理的理解，对椎间盘退变的临床诊治具有一定的指导意义。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

椎间盘退变程度与髓核中miRNA-142-3p、混合谱系激酶3及白细胞介素1β的相关性

Correlation between the expression of miRNA-142-3p, mixed lineage kinase 3 and interleukin-1beta in nucleus pulposus and the degree of lumbar intervertebral disc degeneration

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 7

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王倩, 卢子昂, 李利和, 吕超亮, 王盟, 张存鑫. 青藤碱可有效抑制白细胞介素1β介导的髓核细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 224-230.
[2]	何心愉, 周红海, 姜宏, 马智佳, 苏少亭, 林泽宏, 田君明, 陈龙豪, 刘柏杰. L5/S1椎间盘突出重吸收的腰骶矢状面参数改变[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-6.
[3]	游正秋, 张中卒, 王群波. MRI检查发现椎间盘切除后的早期症状性椎间盘假性囊肿[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1403-1409.
[4]	陈国栋, 郑美妍, 张鹏, 王振超, 金利新. 脊神经后根切断大鼠脊髓后角神经元和星形胶质细胞变化及白细胞介素1β和胶质纤维酸性蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 726-731.
[5]	刘清, 宋浩, 都承斐, 孙艳芳, 李琨, 张春秋. 准静态压缩下腰椎间盘破裂的力学行为[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(4): 493-499.
[6]	李丽, 李骁, 李杜晨晖, 张洁, 肖天骄, 康佳兵, 田艾. 骨替代材料引导骨组织再生过程中白细胞介素4对破骨细胞分化的调控[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(34): 5455-5461.
[7]	龙调玉, 包伦敏, 万秀方, 李红红, 张云东, 蒋红梅. 耐受性树突状细胞可抑制胶原诱导性关节炎大鼠脾脏细胞的焦亡[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5363-5369.
[8]	袁海波, 李东亚, 潘彬, 管凯, 陈风, 袁峰, 吴继彬. 高位腰椎间盘突出症矢状面相关因素分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(31): 4984-4989.
[9]	陈建超, 宋会平. 绝经后膝骨关节炎患者不同部位的骨量分布特征[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(31): 5035-5039.
[10]	张金鹏, 陈畅, 潘秋予, 麦陈耀, 李印龙, 郝玉玺, 胡军. 中老年人群血小板计数与腰椎骨密度的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(31): 5046-5051.
[11]	许光明, 梁梓扬, 王宏波, 张震, 肖庆华, 杨吉勇, 林晓生. 斜扳手法对人体腰椎间盘退变后三关节复合体的力学效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(27): 4277-4282.
[12]	陈超, 耿丰勤, 沈素红. 实时剪切波弹性成像量化评估健康人正中神经弹性特征的信度[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(23): 3742-3746.
[13]	牛策号, 张春霖, 严旭, 付苏, 冯阳, 朱安迪. 椎体后方结构及对突出椎间盘体积测量的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(18): 2897-2902.
[14]	李世超, 解光越, 孙振, 韩鹏, 侯晓华, 孙晓威, 张启栋. 应力位X射线片与单髁置换后膝关节对位对线的关系[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(18): 2910-2914.
[15]	王春宇, 陈志刚, 张建利. 甲钴胺干预腰椎间盘突出症模型大鼠神经性疼痛及酸敏感离子通道的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(17): 2658-2663.