骨替代材料引导骨组织再生过程中白细胞介素4对破骨细胞分化的调控

doi:10.12307/2023.840

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (34): 5455-5461.doi: 10.12307/2023.840

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

骨替代材料引导骨组织再生过程中白细胞介素4对破骨细胞分化的调控

李丽1，李骁2，李杜晨晖1，张洁1，3，肖天骄1，康佳兵1，田艾1

1贵州医科大学口腔医学院/附属口腔医院，贵州省贵阳市 550004；2贵阳市口腔医院，贵州省贵阳市 550002；3贵州中医药大学第一附属医院，贵州省贵阳市 550001

收稿日期:2022-10-21 接受日期:2022-12-12 出版日期:2023-12-08 发布日期:2023-04-20
通讯作者: 田艾，副教授，副主任医师，硕士生导师，贵州医科大学口腔医学院/附属口腔医院，贵州省贵阳市 550004
作者简介:李丽，女，1997年生，贵州省遵义市人，苗族，贵州医科大学在读硕士，主要从事口腔种植与骨组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81760192，82260193)；项目负责人：田艾

Regulation of interleukin-4 on osteoclast differentiation during bone regeneration guided by bone replacement materials

Li Li1, Li Xiao2, Li Duchenhui1, Zhang Jie1, 3, Xiao Tianjiao1, Kang Jiabing1, Tian Ai1

1School of Stomatology, Guizhou Medical University/Affiliated Stomatological Hospital, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Guiyang Stomatological Hospital, Guiyang 550002, Guizhou Province, China; 3The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, Guizhou Province, China

Received:2022-10-21 Accepted:2022-12-12 Online:2023-12-08 Published:2023-04-20
Contact: Tian Ai, Associate professor, Associate chief physician, Master’s supervisor, School of Stomatology, Guizhou Medical University/Affiliated Stomatological Hospital, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Li Li, Master candidate, School of Stomatology, Guizhou Medical University/Affiliated Stomatological Hospital, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81760192, 82260193 (to TA)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

极限骨缺损：是指在特定骨骼上造成的终生不能自行修复的最小缺损。
NLRP3炎性小体：是由多种蛋白质组成的复合体，在天然免疫防御的过程中，通过活化caspase-1诱导细胞因子白细胞介素1β和白细胞介素18的成熟和分泌，参与局部炎性微环境的调控，与多种宿主免疫和炎症反应性疾病相关。

背景：研究显示，一定剂量的白细胞介素4干预可以得到适宜比例的M1/M2巨噬细胞谱，产生利于骨愈合的微环境，促进骨再生。
目的：探讨在骨替代材料引导骨组织再生的过程中，白细胞介素4对NLRP3炎性小体及破骨细胞分化的影响。
方法：选取6-8周龄雄性SD大鼠48只，在左侧颅骨制备直径5 mm的骨缺损并同期植入Bio-Oss骨替代材料，缝合骨膜。术后第3天，采用随机数字表法分为实验组与对照组，每组24只，实验组、对照组分别于骨缺损区局部注射白细胞介素4或PBS，1次/d，连续注射5 d。注射后1，2周，取颅骨样本，免疫组织化学染色检测裂解caspase-1和白细胞介素1β蛋白的表达，免疫荧光染色观察M1表面标志物(诱导型一氧化氮合酶)、NLRP3指标(裂解caspase-1)的表达，RT-qPCR检测caspase-1、白细胞介素1β及组织蛋白酶K基因的表达，抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞分化及数量。注射后6，12周，取颅骨样本，行Micro-CT检测及苏木精-伊红染色。

结果与结论：①免疫荧光染色显示，实验组注射后1，2 周的诱导型一氧化氮合酶、裂解caspase-1双染细胞数量显著少于对照组(P < 0.05)；②免疫组织化学染色显示，实验组注射后1周的裂解caspase-1和白细胞介素1β蛋白的表达低于对照组(P < 0.05)；③RT-qPCR检测显示，实验组注射后1周的caspase-1 mRNA表达低于对照组(P < 0.05)，注射后1，2周的白细胞介素1β及组织蛋白酶K mRNA均低于对照组(P < 0.05)；④抗酒石酸酸性磷酸酶染色，实验组注射后1，2周的破骨细胞数量均明显少于对照组(P < 0.05)；⑤Micro-CT检测显示，实验组注射后6，12周的骨缺损部位骨体积分数、骨密度值均高于对照组(P < 0.05)；苏木精-伊红染色显示，注射后12周，实验组缺损中央形成多个骨化中心，散在成熟骨细胞及陷窝分布其中，可见材料周边成骨细胞大量排列成单层参与骨基质形成；⑥结果显示，白细胞介素4可能参与下调NLRP3炎性小体表达、抑制caspase-1的活化进而减少白细胞介素1β的分泌，减轻局部微环境炎性状态，同时抑制破骨细胞分化，发挥促进骨替代材料引导骨组织再生过程中新骨生成的作用。

https://orcid.org/0000-0002-0712-540X(李丽)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 巨噬细胞极化, 白细胞介素4, NLRP3炎性小体, 白细胞介素1β, 骨再生, 骨免疫, 骨缺损

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that a certain dose of interleukin-4 intervention can yield the appropriate ratio of M1/M2 macrophage profile to generate a microenvironment conducive to bone healing and promoting bone regeneration.
OBJECTIVE: To investigate the effect of interleukin-4 on NLRP3 inflammasome activation and osteoclast differentiation during bone tissue regeneration guided by bone replacement materials.
METHODS: Forty-eight 6-8-week-old male SD rats were selected to establish a 5-mm diameter cranial bone defect model on the left and implanted with Bio-Oss bone replacement material at the same time, and the periosteum was sutured. Rat models were randomly divided into control and experimental groups (n=24) at postoperative 3 days. Interleukin-4 and PBS were injected locally into the cranial bone defect area for the experimental and control groups, once a day, for 5 consecutive days. SD rats were executed at 1 and 2 weeks after surgery and skull samples were taken. Immunohistochemical staining was performed to detect the expression of cleaved caspase-1 and interleukin-1β protein. Immunofluorescence staining was performed to observe the expression of inducible nitric oxide synthase (M1 surface marker) and cleaved caspase-1 (NLRP3 indicator). Real-time fluorescence quantitative PCR was performed to detect the expression of related inflammatory factors caspase-1, interleukin-1β and osteoclast factor histone K gene. The differentiation and number of osteoclasts were observed by anti-tartrate acid phosphatase staining. At 6 and 12 weeks after surgery, micro-CT and hematoxylin-eosin staining were performed to observe the osteogenesis of the skull.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Immunofluorescence staining showed that the number of inducible nitric oxide synthase and cleaved caspase-1 double-stained cells in the experimental group was significantly lower than that in the control group at 1 and 2 weeks (P < 0.05). (2) Immunohistochemical staining showed that the expression of cleaved caspase-1 and interleukin-1β in the experimental group was significantly lower than that in the control group at 1 week (P < 0.05). (3) RT-qPCR suggested that the expression of caspase-1 mRNA in the experimental group was lower than that in the control group at 1 week (P < 0.05). The expression intensity of interleukin-1β and osteoclast factor histone K mRNA was significantly lower in the experimental group than that in the control group at postoperative 1 and 2 weeks (P < 0.05). (4) Anti-tartrate acid phosphatase staining showed that the number of osteoclasts was significantly lower in the experimental group at 1 and 2 weeks than that in the control group (P < 0.05). (5) Micro-CT results showed that the bone volume fraction and bone mineral density in the bone defect area were significantly higher in the experimental group than those in the control group at 6 and 12 weeks after injection (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining showed that 12 weeks after injection, multiple ossification centers were formed in the center of the defect in the experimental group, with scattered mature bone cells and lacunae, and a large number of osteoblasts around the material arranged into a single layer to participate in the formation of bone matrix. (6) The results suggest that interleukin-4 may be involved in downregulating NLRP3 inflammasome expression, inhibiting the activation of caspase-1 and thus reducing the secretion of interleukin-1β, reducing the inflammatory state of the local microenvironment, as well as inhibiting osteoclast differentiation and playing a role in promoting new bone production during bone tissue regeneration guided by bone replacement materials.

Key words: macrophage polarization, interleukin-4, NLRP3 inflammasome, interleukin-1β, bone regeneration, bone immunity, bone defect

中图分类号:

李丽, 李骁, 李杜晨晖, 张洁, 肖天骄, 康佳兵, 田艾. 骨替代材料引导骨组织再生过程中白细胞介素4对破骨细胞分化的调控[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(34): 5455-5461.

Li Li, Li Xiao, Li Duchenhui, Zhang Jie, Xiao Tianjiao, Kang Jiabing, Tian Ai. Regulation of interleukin-4 on osteoclast differentiation during bone regeneration guided by bone replacement materials[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(34): 5455-5461.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析 48只大鼠全部进入结果分析。
2.2 两组大鼠颅骨标本免疫荧光染色结果利用免疫荧光检测M1表面标记物(诱导型一氧化氮合酶)与NLRP3指标(裂解caspase-1)，见图1。注射后1，2周，实验组大鼠颅骨标本诱导型一氧化氮合酶、裂解caspase-1的荧光染色强度低于对照组，并且诱导型一氧化氮合酶和裂解caspase-1阳性细胞表达部位重合度高，随着观察时间延长，第2周荧光染色阳性细胞数量少于第1周。统计分析结果显示，实验组注射后1，2周的荧光双阳细胞数量明显低于对照组(P < 0.05，P < 0.01)。

2.3 两组大鼠颅骨标本RT-qPCR检测结果见图2。

随着时间的延长，两组骨缺损区白细胞介素1β mRNA表达量下降，实验组注射后1，2周的白细胞介素1β mRNA表达量明显低于对照组(P < 0.05)。实验组注射后1周的caspase-1 mRNA表达量显著低于对照组(P < 0.05)，两组注射后2周的caspase-1 mRNA表达量比较差异无显著性意义(P > 0.05)。实验组注射后1，2周的组织蛋白酶K mRNA表达量明显低于对照组(P < 0.05)。
2.4 两组大鼠颅骨标本免疫组织化学染色结果见图3，4。

实验组注射后1周的白细胞介素1β和裂解caspase-1免疫标记平均光吸光度值均低于对照组(P < 0.05)，注射后2周的裂解caspase-1免疫标记平均光吸光度值低于对照组(P < 0.05)，两组注射后2周的白细胞介素1β免疫标记平均光吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.5 两组大鼠颅骨标本抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果见图5。

破骨细胞为红染多核细胞，主要分布于宿主骨与骨替代材料间及新生骨基质活跃处。实验组注射后1，2周的破骨细胞数量少于对照组(P < 0.05)。
2.6 两组颅骨标本Micro-CT与苏木精-伊红染色结果见图6，7。

利用 Micro-CT检测及苏木精-伊红染色观察两组大鼠颅骨成骨情况。Micro-CT检测显示，注射后6周，两组均可见大面积骨粉颗粒，骨缺损区边缘部可见少量成骨，实验组边缘新生骨量较对照组明显。注射后12周，两组中央缺损区仍然见骨粉颗粒影，边缘成骨较6周明显，实验组边缘成骨较对照组明显，骨质与正常骨质接近。分析参数结果显示，实验组注射后6，12周的骨体积分数、骨密度值均显著高于对照组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)。
苏木精-伊红染色结果显示，注射后6周，两组可见较多的边缘性成骨及骨替代材料中央少量的炎性细胞浸润；注射后12周，实验组缺损中央形成多个骨化中心，散在成熟骨细胞及陷窝分布其中，可见材料周边成骨细胞大量排列成单层参与骨基质形成。

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引言

种植义齿常因其舒适、美观、咀嚼效率高等优点成为牙列缺损的首选治疗方案，而足够的牙槽骨骨量是保证种植体获得良好初期稳定性及骨结合的关键。骨量不足时常需进行骨增量技术，自体骨移植因其没有排异反应，具有良好的骨引导性和骨诱导性，被誉为骨移植手术的“金标准”[1-2]，但自体骨移植存在需要开辟第二术区、取骨量少等缺点[3]，不能被多数患者接受。近年来，引导骨组织再生技术在临床广泛应用，它是将骨替代材料植入骨缺损区，维持稳定的成骨空间，同时使用屏障膜阻止结缔组织细胞和上皮细胞进入植骨区，以达到促进骨组织再生与增加骨量的目的，拓宽了种植治疗适应证。人工合成骨替代材料是一种自体骨替代品，植入机体后会引起自身免疫系统将其识别为异物，发生异物反应，影响成骨效果[4-6]，因此，如何提高骨替代材料的成骨能力具有重要意义。以往的研究主要从改善材料的理化结构、骨材料内结合活性分子、骨材料内结合细胞成分3个方面来促进其成骨能力[7-9]，近年有学者开始关注免疫细胞和骨细胞之间的相互作用，提出“骨免疫学”的概论[10]，强调免疫系统在骨缺损修复过程中发挥了重要作用。准确的免疫调节可以促进生物材料介导的血管形成和成骨，改善植入物治疗结果，对骨替代材料的成骨具有重要意义[11-12]。
巨噬细胞是重要的免疫细胞，几乎存在于所有组织中，可随炎症微环境变化调节为促炎M1或抗炎M2表型参与调控下游骨缺损修复[13]。在感染组织中，巨噬细胞首先极化为促炎M1表型，产生促炎反应并释放促炎相关因子，以帮助宿主对抗病原体；随后，巨噬细胞极化为M2表型产生抗炎反应，修复受损组织[14]。合适的M1/M2巨噬细胞比例可以产生有利于组织修复的微环境，有利于骨组织再生[11]。炎性小体是一种重要的调控促炎细胞因子分泌的多聚蛋白复合物，存在于多种细胞中，其中的NLRP3炎性小体参与了多种炎症性疾病的发生发展，包括参与骨质疏松等骨代谢疾病[15]。NLRP3炎性小体由受体蛋白NLRP3、接头蛋白ASC和效应蛋白caspase-1 3部分组成，炎症诱导NLRP3炎性小体合成，促进caspase-1活化，进而促进白细胞介素1β和白细胞介素18成熟和分泌，引发炎症或者引起促炎性细胞死亡[16]。研究显示，主动抑制NLRP3炎性小体可以减少及预防骨量丢失[17-18]，抑制破骨细胞吸收[19]。因此，研究巨噬细胞/NLRP3炎性小体/caspase-1/白细胞介素1β调控机制，可能为促进引导骨组织再生中成骨修复提供新的靶点。
白细胞介素4是Ⅱ型辅助T细胞分泌的细胞因子，在巨噬细胞表面有白细胞介素4受体，是巨噬细胞极化的关键调节因子。动物实验发现，植骨术后给予白细胞介素4干预可抑制M1极化、促进M2巨噬细胞极化，通过分泌细胞因子调控成骨局部微环境，增加骨缺损区域的新骨生成[11]。体外实验也发现，白细胞介素4能够激活贴壁巨噬细胞进入M2表型并减少促炎细胞因子的释放[20]，可能优化慢性炎症状态下的成骨分化[21]。因此，为了探讨在引导骨组织再生骨愈合过程中，白细胞介素4对NLRP3炎性小体及对破骨细胞分化的影响，实验拟利用大鼠颅骨极限骨缺损修复动物模型，植入Bio-oss骨粉后进行观察，探索白细胞介素4是否可以通过调控M1巨噬细胞/NLRP3炎性小体/caspase-1/白细胞介素1β轴与破骨细胞分化发挥促进骨组织再生的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用两独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2021年6月至2022年3月在贵州医科大学科研平台完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 48只SPF级雄性SD大鼠，6-8周龄，体质量(300±30) g，动物统一由贵州医科大学动物实验中心提供并由其统一管理。按4只/笼分笼饲养，室温21-24 ℃、湿度50%-60%、换气次数≥14次/h、每日12 h光照，每日标准大鼠饲料自由进食、饮水。实验已通过贵州医科大学动物实验伦理学委员会审查批准(编号：1901087)。
1.3.2 主要试剂及仪器戊巴比妥钠(上海恩化化学技术有限公司)；Bio-Oss骨粉(Geistlich，Switzerland)；Anti Cl-caspase1、Anti 白细胞介素1β(Affinity)；二抗(HRP标记山羊抗兔通用二抗)、组化试剂盒DAB显色剂(DAKO)；Recombinant Murine 白细胞介素4(PeproTech，美国)；SYBR绿色荧光染料(TaKaRa，日本)；RNA wait(北京索莱宝科技有限公司，北京)；PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)；Trizol试(Thermo Fermentas，美国)；抗酒石酸酸性磷酸酶染液套装(武汉谷歌生物科技有限公司)；核酸定量仪(贵州医科大学分子生物学实验室)；CFX96 Real-tine PCR仪、PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司)；酶标检测仪(BioTeK，美国)；LONYPAS HB51 型光学显微镜(奥林巴斯，日本)。

1.3.3 Bio-Oss骨粉材料介绍见表1。

1.4 方法
1.4.1 建立实验动物模型与分组干预取48只6-8周龄SD大鼠，给予2%戊巴比妥钠(3 mL/kg)腹腔注射，麻醉后常规备皮、消毒、铺巾，暴露左侧术区颅骨，使用慢速涡轮机+直径5 mm环形钻于SD大鼠左侧颅骨制备标准直径5 mm的圆形临界骨缺损[22-23]，生理盐水冲洗创口后于缺损处植入Bio-Oss骨粉，严密充填，分层缝合骨膜、肌肉及皮肤。术后3 d肌肉注射青霉素10万单位预防感染。
术后第3天，将大鼠按随机数字表法分为对照组及实验组，每组24只，实验组通过头部皮肤直接将10 ng白细胞介素4(溶于20 μL PBS中)注射于骨缺损区，对照组按同样方法注射同等体积的无菌PBS，1次/d，连续注射5 d。
1.4.2 标本获取和处理注射后1，2周，每组麻醉状态下处死6只大鼠，将其中2个标本放入RNA保存液中，于4 ℃条件下过夜后，放置在-80 ℃冰箱冻存，用于RT-qPCR检测；将另外4个标本放入40 g/L多聚甲醛中固定，于10%EDTA脱钙液中脱钙三四周，脱钙后切片行免疫组化染色、免疫荧光染色以及破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色。注射后6，12周，每组麻醉状态下处死6只大鼠，取颅骨标本，置入体积分数10%中性甲醛溶液保存，行Micro-CT检测，后于10%EDTA脱钙液中脱钙，再行苏木精-伊红染色。
1.4.3 Micro-CT检测使用Nemo Micro-CT(NMC-100)设备扫描，在Avatar软件(版本1.6.2，PINGSENG Healthcare Inc.)上采用FDK法逆向重建三维图像，取植骨区直径5 mm、厚1 mm的圆柱范围为感兴趣区域，计算和分析骨密度、骨体积分数。
1.4.4 苏木精-伊红染色大鼠颅骨骨缺损区组织脱钙后，包埋切取5 μm厚度切片，脱蜡后于不同浓度的乙醇中水化，行苏木精液和伊红液染色，脱水封固，观察骨缺损区成骨情况。

1.4.5 RT-qPCR检测无菌条件下将冰冻大鼠颅骨组织研磨至粉状，使用Trizol试剂提取总RNA，核酸定量仪检测浓度和纯度(纯度范围1.8-2.2)。使用PrimeScript™ RT reagent Kit反转录cDNA，使用TB Green Premix Ex Taq在CFX96 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)进行扩增和检测，反应条件：95 ℃预变性30 s；PCR反应95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循环40次，检测骨缺损区内新生骨组织中caspase-1、白细胞介素1β、组织蛋白酶K基因表达情况。每个样品至少重复3次，使用相对定量2-ΔΔCt法检测标本中目的基因相对内参基因的表达情况。引物序列见表2。

1.4.6 免疫组织化学染色烘烤组织切片后脱蜡水化，枸橼酸钠缓冲液(pH=6.0，1∶19)行抗原修复，体积分数3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，用5%BSA封闭，加入一抗白细胞介素4(1∶100)、裂解caspase-1(1∶100)过夜，加入HRP标记山羊抗兔通用二抗，加入DAB显色液，苏木精液复染细胞核，脱水后封固，观察白细胞介素1β、裂解caspase-1表达部位及表达强度。
1.4.7 抗酒石酸酸性磷酸酶染色石蜡切片脱蜡至水，滴加抗酒石酸酸性磷酸酶工作液孵育染色，苏木精染细胞核，脱水封固，观察破骨细胞表达部位和数量。
1.4.8 免疫荧光染色石蜡切片脱蜡下水，枸橼酸钠缓冲液(pH=6.0，1∶19)行抗原修复，加入Ⅰ抗诱导型一氧化氮合酶(1∶200)、裂解caspase-1(1∶200)，加入HRP标记山羊抗兔鼠通用二抗，用DAPI染液复染细胞核，封固后镜检，观察诱导型一氧化氮合酶、裂解caspase-1荧光双染细胞表达部位、双染重合度，使用Image J软件进行细胞计数。
1.5 主要观察指标两组大鼠颅骨标本免疫组织化学染色、免疫荧光染色、RT-qPCR检测、抗酒石酸酸性磷酸酶染色、Micro-CT检测及苏木精-伊红染色结果。
1.6 统计学分析每组实验重复3次，采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，GraphPad Prism 9.0绘制统计图，若数据服从正态分布用x±s表示，采用两独立样本t检验；数据不服从正态分布的，用中位数表示，采用Mann-Whit-ney U 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经贵州医科大学统计学专家审核。

讨论

近年来有学者发现，微环境中免疫细胞和骨细胞可以通过细胞因子自分泌或旁分泌的形式相互影响、相互作用，因而提出了“骨免疫学”的概论[10]，强调在骨再生过程中宿主对移植物的免疫反应，也强调了免疫细胞对免疫微环境的调节作用。巨噬细胞是骨免疫调节的主要参与者[24]，是具有高度可塑性的免疫细胞，在清除坏死/凋亡细胞和入侵的病原体方面起着关键作用。巨噬细胞常根据其环境极化成不同的巨噬细胞亚型[25]，比如脂多糖可促使巨噬细胞极化为M1表型，而白细胞介素4可诱导巨噬细胞极化为M2表型[26]。M1巨噬细胞能够产生促炎反应并释放促炎相关因子，如白细胞介素6、白细胞介素12和肿瘤坏死因子，而M2巨噬细胞具有抗炎和修复受损组织的能力[27]。在感染组织中，巨噬细胞首先极化为促炎M1表型，以帮助宿主对抗病原体，随后巨噬细胞极化为M2表型形成抗炎反应，修复受损组织[14]。
M1/M2极化不平衡时，过度的M2型极化会引起慢性炎症反应，甚至使缺损区被纤维组织包裹[28]；而过度的M1向极化也会延长炎症反应，造成骨缺损迁延不愈，因此合适的M1/M2巨噬细胞谱与时序性极化能产生利于组织愈合的微环境，促进组织愈合[11]。引导骨组织再生中植入的骨替代材料作为外来人工合成物质，会刺激机体产生免疫排斥反应，致使M1巨噬细胞激活，炎性反应程度决定了骨缺损修复结果[29]。因此，部分研究报道可以通过递送生物活性物质来主动调节巨噬细胞状态，控制炎性状态，改善局部微环境，以达到促进成骨的目的[30]。骨修复是成骨和破骨过程紧密联系的动态偶联反应，减少骨愈合微环境中相关炎性细胞因子(白细胞介素1β、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α)的表达，及时调控炎性反应向组织修复阶段转换，有利于骨缺损区骨组织的再生。
白细胞介素4可发挥骨免疫调控功能，促进骨再生。ZHENG等[11]使用不同剂量的白细胞介素4来观察免疫调节对骨替代材料在骨愈合微环境中的影响，结果显示10 ng的白细胞介素4可以得到有利于骨愈合微环境的M1/M2巨噬细胞比例，促进骨再生。在ZHAO等[31]的研究中，将钛植入物植入大鼠股骨缺损修复模型中，术后第3-7天每日注射白细胞介素4于手术部位，可以诱导M2极化来减少炎症损伤。创伤后急性炎症是组织愈合的第一阶段[32]，M1巨噬细胞在协调下游炎症级联反应方面发挥广泛的作用[31]，术后3 d是正常骨愈合的时间，炎症细胞因子水平开始下降[11]，因此，此次实验选择在大鼠颅骨缺损术后第3-7天局部注射10 ng剂量白细胞介素4，以期得到最佳愈合微环境。苏木精-伊红染色显示，经白细胞介素4调节后，骨缺损区炎症细胞和纤维细胞减少，新生骨量明显增多。Micro-CT结果同样也显示，在6，12周实验组颅骨骨缺损区骨体积分数、骨密度值均高于对照组，说明经早期白细胞介素4主动调控后促进了大鼠颅骨骨缺损植骨区的骨再生，与以往研究结果一致[31-34]。
NOD样受体是先天免疫系统的模式识别受体中关键的受体，其中NLRP3炎性小体是NOD样受体家族中的核心成员。在免疫调节中，NLRP3炎性小体控制蛋白水解酶caspase-1的活化，活化后的caspase-1调控炎性因子白细胞介素1β和白细胞介素18的成熟和分泌，诱导炎症[35]。巨噬细胞中的NLRP3主要表达在胞浆中，但激活的NLRP3炎性小体一般存在于M1巨噬细胞[36-37]。研究表明，主动抑制NLRP3炎性小体的产生可以减少骨量的丢失，其机制可能是巨噬细胞中NLRP3炎性小体缺乏进而减少白细胞介素1β的分泌，从而抑制破骨细胞分化，减轻牙槽骨丢失[38]。此外，有学者在大鼠牙根吸收模型中发现，人牙周膜环膜细胞可以激活M1巨噬细胞中的NLRP3炎症小体来促进M1巨噬细胞极化并增加白细胞介素1β的产生，从而引发牙根的吸收，提示NLPR3/caspase-1/白细胞介素1β信号参与破骨细胞分化促进牙根吸收[39]。用NLRP3抑制剂CY-09干预高脂肪饮食小鼠，显著下调了NLRP3炎性小体途径分子NLRP3、caspase-1和白细胞介素1β的表达，NLRP3活性的抑制降低了M1/M2巨噬细胞的比例，阻止了巨噬细胞向M1表型的转变[40]。探寻巨噬细胞主动极化对NLRP3炎性小体的影响，可能为治疗骨缺损新骨形成提供新的治疗靶点。
NLRP3炎性小体可存在于骨愈合微环境的巨噬细胞、多形核细胞和中性粒细胞等多种细胞中，此次实验通过免疫荧光染色法检测裂解caspase-1和M1巨噬细胞特异性抗原诱导性一氧化氮合酶的表达，结果显示，实验组中诱导性一氧化氮合酶和裂解caspase-1表达量显著低于对照组，绝大多数细胞为裂解caspase-1和诱导性一氧化氮合酶的共表达，说明M1巨噬细胞是表达裂解caspase-1的主要细胞类型。免疫组织化学染色及RT-qPCR结果均显示，实验组中裂解caspase-1、白细胞介素1β蛋白和mRNA的表达均较对照组低，提示经白细胞介素4主动调控后巨噬细胞内NLRP3炎性小体活性抑制，白细胞介素1β分泌减少，局部微环境中炎性反应减弱。
研究发现，在NLRP3敲除小鼠中NLRP3炎性小体激活受阻，破骨细胞因子组织蛋白酶K低表达，而成骨细胞分泌骨钙蛋白表达无异常，提示NLRP3炎症小体可能通过影响骨吸收过程而不是骨形成过程参与骨修复[41]。同时，白细胞介素1β与糖尿病双膦酸盐相关性骨坏死的发生呈正相关，但是可通过阻断NLRP3炎性小体活性的形式抑制白细胞介素1β，进而逆向性改善炎症性骨吸收[37，42]。NLRP3可通过介导破骨细胞分化来调节牙周炎中的骨吸收[19，38]。因此，NLRP3炎性小体可能通过促进促炎细胞因子白细胞介素1β的分泌增强破骨效应，从而抑制骨再生。此次实验在对缺损区内破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶染色及行RT-qPCR破骨细胞因子组织蛋白酶K检测时发现，实验组中破骨细胞数量明显低于对照组，其分布多位于骨改建活跃部位或骨材料周缘，提示白细胞介素4减轻局部炎性状况后可能通过抑制破骨细胞分化来促进骨再生，与以往研究结果一致。
此外，此次实验观察到两组第2周时炎性小体标志物caspase-1在基因水平和蛋白水平均无统计学差异，而在诱导性一氧化氮合酶巨噬细胞免疫荧光染色及破骨细胞检测中有统计学差异。HACHIM等[43]的一项研究中发现，植入含白细胞介素4缓释涂层的植入物(涂层在14 d内释放约90%的白细胞介素4)在14 d时，其诱导的M1巨噬细胞的百分比下降，M2巨噬细胞百分比下降至与对照组相似的水平，提示白细胞介素4主要在骨缺损修复早期炎症反应阶段发挥调控作用，随着时间延长，在14 d对巨噬细胞的影响可能下降。在此次实验中，仅在植骨术后第3-7天给予白细胞介素4干预，第2周时可能对骨缺损区巨噬细胞极化及相关因子表达的影响减弱。
实验不足之处：①白细胞介素4早期调控微环境对后期(6周和12周)成骨效果以及相关成骨蛋白和mRNA水平缺少深入探讨；②在建立动物模型时，未采用局部植入缓释剂药物的方式以保证药物作用浓度，实现精准调控。
综上所述，白细胞介素4可促进骨替代材料修复骨缺损区新骨形成，其可能的机制是：白细胞介素4在早期抑制巨噬细胞M1向极化，减弱NLRP3炎性小体相关因子表达，减少白细胞介素1β的释放，同时抑制破骨细胞分化，从而促进骨组织再生。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

骨替代材料引导骨组织再生过程中白细胞介素4对破骨细胞分化的调控

Regulation of interleukin-4 on osteoclast differentiation during bone regeneration guided by bone replacement materials

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