全血及不同方式制备富血小板血浆对髓核细胞的干预效应

doi:10.12307/2023.061

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (8): 1199-1204.doi: 10.12307/2023.061

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全血及不同方式制备富血小板血浆对髓核细胞的干预效应

练诗林1，2，张燕2，蒋强2，张晗硕2，李土胜2，丁宇1，2

1华南理工大学医学院，广东省广州市 510006；2解放军总医院第六医学中心中医医学部骨伤科，北京市 100048

收稿日期:2022-02-07 接受日期:2022-03-17 出版日期:2023-03-18 发布日期:2022-07-28
通讯作者: 丁宇，教授，主任医师，博士生导师，解放军总医院第六医学中心中医医学部骨伤科，北京市 100048；华南理工大学医学院，广东省广州市 510006
作者简介:练诗林，男，1995年生，四川省宜宾市人，汉族，华南理工大学医学院在读硕士，主要从事脊柱外科方面的研究。
基金资助:
首都临床诊疗技术研究及示范应用项目“富血小板血浆椎间盘注射联合椎间孔镜技术治疗腰椎间盘突出症及术后康复的临床研究”(Z191100006619028)，项目负责人：丁宇

Interventional effects of whole blood and platelet-rich plasma with different preparation methods on nucleus pulposus cells

Lian Shilin1, 2, Zhang Yan2, Jiang Qiang2, Zhang Hanshuo2, Li Tusheng2, Ding Yu1, 2

1School of Medicine, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; 2Orthopedics of TCM Senior Department, the Sixth Medical Center of PLA General Hospital, Beijing 100048, China

Received:2022-02-07 Accepted:2022-03-17 Online:2023-03-18 Published:2022-07-28
Contact: Ding Yu, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, School of Medicine, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; Orthopedics of TCM Senior Department, the Sixth Medical Center of PLA General Hospital, Beijing 100048, China
About author:Lian Shilin, Master candidate, School of Medicine, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; Orthopedics of TCM Senior Department, the Sixth Medical Center of PLA General Hospital, Beijing 100048, China
Supported by:
Capital Clinical Diagnosis and Treatment Technology Research and Demonstration Application Project, No. Z191100006619028 (to DY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
富血小板血浆：是利用全血中各组分的沉降系数不同，而通过离心纯化得到的血小板富集的血浆。因其高浓度血小板能够释放多种生物活性因子，加快细胞增殖和组织修复再生，当前已经被应用于多领域的组织再生治疗中。
髓核细胞：是由脊索细胞演变而来的类软骨细胞，具有类似于软骨细胞的表型。髓核细胞分泌的Ⅱ型胶原和聚蛋白聚糖是髓核组织的重要细胞外基质，在椎间盘退变过程中，细胞外基质成分的含量失衡是影响椎间盘稳定的重要因素。

背景：目前椎间盘退变的富血小板血浆修复疗法受到越来越多的关注，临床应用中椎间盘修复的富血小板血浆常用的制备方法包括手工制备一次离心和套装制备二次离心法，不同制备方法的优劣证据不足。
目的：通过手工制备、套装制备富血小板血浆以及全血干预猪的原代髓核细胞，对比其效应差异，探讨更适合椎间盘退变修复的富血小板血浆制备方式。
方法：提取分离猪的静脉血，按照手工制备一次离心法及OSP套装制备二次离心法分别制备富血小板血浆，同时留取全血对比，并设立空白对照组PBS。检测制备富血小板血浆的血小板浓度、白细胞浓度，计算富集倍数。富血小板血浆激活后获得激活物并利用ELISA法检测其中转化生长因子β1、血小板源性生长因子BB、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β浓度。培养猪的髓核细胞至P3代，利用制备的富血小板血浆以及全血进行干预，CCK-8法检测富血小板血浆对髓核细胞的促增殖作用，Western-blot法检测富血小板血浆对髓核细胞Ⅱ型胶原、聚蛋白聚糖的促合成代谢作用。
结果与结论：①OSP组的富血小板血浆在制备耗时、血小板浓度、白细胞浓度方面均显著高于手工组，OSP组与手工组血小板富集倍数分别为5.6倍、3.0倍，白细胞富集倍数分别为2.21倍、1.36倍；②转化生长因子β1浓度、血小板源性生长因子BB浓度、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平OSP组均高于手工组，差异有显著性意义(P < 0.05)；③CCK-8检测细胞增殖情况中，OSP组的A450 nm值高于其余各组，差异有显著性意义(P < 0.000 1)；手工组的A450 nm值与全血组和对照组相比，差异无显著性意义(P=0.192 7)；④Western-blot检测Ⅱ型胶原合成情况，OSP组的相对表达量显著高于其他组(P < 0.000 1)；聚蛋白聚糖的合成情况，手工组的相对表达量低于其余各组(P=0.040 5)；⑤结果说明，相对于手工制备方式，以OSP为代表的套装制备法制备耗时更长，所得富血小板血浆的白细胞浓度显著高于手工组，并且促炎因子浓度更高；但同时套装制备法能够获得更高浓度的血小板和生长因子，并且有更好的促细胞增殖效果和促细胞外基质合成效果。为取得更好的套装制备富血小板血浆疗效，应在套装制备操作中加强对白细胞的分离。
缩略语：血小板源性生长因子：platelet-derived growth factor，PDGF

https://orcid.org/0000-0002-6978-0872(练诗林)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 髓核细胞, 富血小板血浆, 手工制备, 套装制备, 椎间盘退变, 组织修复

Abstract: BACKGROUND: Platelet-rich plasma therapy for disc degeneration has received increasing attention. Platelet-rich plasma preparation methods for intervertebral disc repair include manual preparation using one-spin centrifugation and kit preparation using two-spin centrifugation. There was insufficient evidence of which preparation method is better.
OBJECTIVE: To compare the effects of intervention of porine nucleus pulposus cells with manually prepared platelet-rich plasma, kit-prepared platelet-rich plasma and whole blood and to explore the better preparation method of platelet-rich plasma for intervertebral disc repair.
METHODS: The porcine venous blood was extracted to prepare platelet-rich plasma using the manual preparation method of one-spin centrifugation and OSP kit preparation method of two-spin centrifugation. Some whole blood was reserved as control. And PBS was used to be blank control. The concentration of platelets and leukocytes in platelet-rich plasma was detected to calculate fold enrichment. ELISA was used to detect the concentration of transforming growth factor-β1, platelet-derived growth factor-BB, tumor necrosis factor-α and interleukin-1β in platelet-rich plasma lysate. Porcine nucleus pulposus cells were cultivated to P3 and intervened with prepared platelet-rich plasma and whole blood lysate. Cell counting kit-8 was used to detect the proliferation of nucleus pulposus cells after intervention with platelet-rich plasma and whole blood lysate. Western blot was used to detect the anabolic effects of platelet-rich plasma on type II collagen and aggrecan in nucleus pulposus cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the manual group, the OSP group showed significantly longer preparation time and higher platelet and leukocyte concentrations in the preparation of platelet-rich plasma. The fold enrichment of platelet-rich plasma was 5.6 in the OSP group and 3.0 in the manual group, while the fold enrichment of leukocytes was 2.21 and 1.36 respectively. The concentrations of transforming growth factor-β1, platelet-derived growth factor-BB, tumor necrosis factor-α and interleukin-1β of the OSP group were significantly higher than those of the manual group (P < 0.05). In the cell counting kit-8 detection of cell proliferation, the absorbance value at 450 nm of the OSP group was significantly higher than that of the other groups (P < 0.000 1); there was no significant difference in the absorbance value at 450 nm of the manual group compared with the whole blood and control groups (P=0.192 7). The relative expression of type II collagen in the OSP group was significantly higher than that in the other groups (P < 0.000 1). As for the synthesis of aggrecan, the relative expression of aggrecan in the manual group was lower than that in the remaining groups (P=0.040 5). These findings indicate that compared with the manual preparation method, the kit preparation method represented by OSP consumes more time and can acquire significantly higher concentration of leukocytes and proinflammatory cytokines. However, the kit preparation method can obtain higher concentrations of platelets and growth factors and has better cell proliferation effect and synthesis effect of extracellular matrix. For a better therapeutic effect of platelet-rich plasma, it is suggested to enhance the isolation of leukocytes when using the kit preparation method.

Key words: nucleus pulposus cell, platelet-rich plasma, manual preparation, OSP kit preparation, intervertebral disc degeneration, tissue repair

中图分类号:

练诗林, 张燕, 蒋强, 张晗硕, 李土胜, 丁宇. 全血及不同方式制备富血小板血浆对髓核细胞的干预效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1199-1204.

Lian Shilin, Zhang Yan, Jiang Qiang, Zhang Hanshuo, Li Tusheng, Ding Yu. Interventional effects of whole blood and platelet-rich plasma with different preparation methods on nucleus pulposus cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(8): 1199-1204.

图/表（结果） 9

2.1 富血小板血浆制备结果富血小板血浆制备过程及制备参数见表1及图1-3，手工制备相对于OSP制备所耗费时间更短，但获得的血小板浓度及富集倍数较低。各组之间比较，OSP组的血小板、白细胞浓度均最高，差异有显著性意义(P < 0.000 1，P=0.023 3)。

2.2 髓核细胞培养结果髓核细胞培养，可见P0代细胞由消化过后的髓核组织碎块中向外辐射生长，聚集程度高，形状不规则，见图4，5。从获取组织消化到开始有细胞爬出组织块需要五六天时间，而传代后的细胞分布均匀，P1、P2、P3代细胞的生长速度较快，平均四五天传代1次，比例1∶3，细胞形态相对于P0趋于稳定。

2.3 ELISA检测结果 ELISA结果显示，在4组中，OSP组转化生长因子β1、PDGF-BB质量浓度均最高，分别为(594.71±144.76) ng/L、(511.05±22.59) ng/L，同时OSP组也具有组间最高的促炎因子质量浓度，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β分别为(464.20±115.06) ng/L、(152.80±22.83) ng/L，见图6。

2.4 CCK-8检测结果富血小板血浆对髓核细胞的增殖效应是其可以用于退变髓核组织修复的重要基础，通过观察CCK-8增殖实验结果，发现在干预后的48 h和72 h，OSP组髓核细胞增殖程度优于手工组、全血组及对照组，差异有显著性意义(P < 0.000 1)，见图7。

2.5 Western blot检测结果富血小板血浆促进髓核细胞的合成代谢效应是另一个需要评价的指标，在髓核细胞的细胞外基质中Ⅱ型胶原和聚蛋白聚糖作为主要成分，其含量可以反映髓核组织的退变程度。Western Blot蛋白印迹实验的结果通过对比β-actin计算的相对表达量显示，从结果可以看出，OSP组富血小板血浆干预后，细胞Ⅱ型胶原的表达量显著提高，为(78.67±3.21)%，而手工组没有显著效应；而从聚蛋白聚糖的表达情况上看，OSP组和手工组的富血小板血浆均没有明显提高聚蛋白聚糖的表达，见图8。

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引言

椎间盘退变相关疾病的发病率高，症状表现明显，对人们的正常生活影响显著。轻度的椎间盘退变选择临床观察或保守治疗，患者即可收到满意疗效，而中重度的退变相关疾病，尤其是椎间盘突出导致的神经根压迫症状以及椎管狭窄症等，保守治疗效果欠佳，患者常需要通过开放融合内固定或内镜手术精确摘除突出髓核解除压迫来解除症状[1]。而手术后伴随的邻椎病、再突出和术后疼痛等，患者又往往需要二次手术来改善症状[2]。富血小板血浆治疗作为一种组织修复治疗策略，可以起到促进细胞增殖和组织修复等作用[3]，已被广泛地使用于各学科领域。在脊柱手术中合并使用富血小板血浆的疗效近来受到越来越多研究退变椎间盘修复学者及临床医生的关注[4-7]。

对于椎间盘组织而言，退变的发生与髓核内部的髓核细胞数量和功能关系密切。正常髓核细胞功能稳定，可以合成和维持包括Ⅱ型胶原和聚蛋白聚糖在内的细胞外基质成分的稳定[8]。椎间盘退变的主要原因是髓核细胞衰老，细胞正常功能减退，继而引发细胞外基质含量的减少、椎间盘含水量降低，椎间盘内部稳定性变差、纤维环脆性增加，在T2加权MRI上可以表现为髓核内部信号的减低甚至椎间隙的高度下降，进而引发椎间盘突出等改变。富血小板血浆在用于退变椎间盘的修复方面已经有较多的研究报道，例如血小板浓度应富集达到全血的3-7倍，白细胞的含量也会影响治疗效应等等。但富血小板血浆的具体使用策略较难统一[9]，这主要受到制备方式以及设备参数等条件的影响。目前较广泛使用的制备方式包括手工制备和套装制备，二者分别对应的是手工的一次离心以及套装的二次离心。在富血小板血浆制备、实际治疗效应方面的差异是影响富血小板血浆应用的重要环节。因而，此次研究利用全血、手工制备富血小板血浆和OSP为代表的套装制备富血小板血浆干预髓核细胞，对比不同的制备方式下富血小板血浆所起到的细胞增殖效应和促合成代谢方面的差异性，找到更适合的富血小板血浆椎间盘修复治疗方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，计量资料数据组间比较使用单因素方差分析(One-way ANOVA)。
1.2 时间及地点实验于2021年8月在北京迈迪思维生物技术有限公司完成。
1.3 材料

实验动物：细胞及血液来源于1只健康的雄性小型猪，3月龄，体质量14 kg，购自天津市百农实验动物繁育科技有限公司；许可证号：SCXK(津)2020-0002。实验方案经北京迈迪斯维生物技术有限公司动物实验伦理委员会批准，批准号为MDSW-2021-991A。

试剂及耗材：DMEM/F12培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA、100X青霉素-链霉素溶液(GIBCO)；细胞培养皿、细胞培养瓶、6孔板、24孔板、96孔板、15 mL、50 mL无菌离心管(CORNING)；微量移液器枪头、1.5 mL无菌离心管(AXGEN)；氯化钙溶液、ACD-A溶液(LEAGENE)，猪凝血酶冻干粉(湖南一格制药有限公司)，戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：WS20060401)；OSP制备套装(惠众国际医疗器械有限公司)，Ⅱ型胶原酶(sigma)；Ⅱ型胶原抗体 (bs-10589R，博奥森)、聚蛋白聚糖抗体(GTX54920，GeneTex公司)、Anti-beta Actin抗体(ab8227，Abcam公司)；Goat anti-rabbit IgG(H+L，ab150078，Alexa Fluor® 555)。其他常规化学试剂均购自上海国药试剂公司。
1.4 方法
1.4.1 富血小板血浆制备从麻醉的小型猪的股静脉穿刺建立采血通路，取血前在5 mL注射器和OSP制备套装分别抽取体积分数10%的ACD-A溶液，之后分别抽取5 mL和15 mL动脉血。5 mL注射器采用目前临床上常用的手工制备方式离心：采用630×g RCF离心10 min，用5 mL注射器吸取白膜层以上1 cm的组分，即手工组富血小板血浆；再采用制备套装200×g RCF离心10 min，之后去除底部浓集红细胞层约5 mL，上层剩余成分继续进行1 000×g RCF离心10 min，取得套装容积内下部约1/2，即为OSP组富血小板血浆；再留取适量全血设立全血组进行对照。

记录不同方式制备富血小板血浆所用时间，测定富血小板血浆的血小板浓度及白细胞浓度，计算血小板富集倍数。留取少量样本用于后续生长因子[转化生长因子β1、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)]以及促炎因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β)测定。富血小板血浆以及全血使用前利用激活剂进行激活后提取上清液，激活剂由1 000 U猪凝血酶冻干粉以及5 mL的10%氯化钙溶液进行配置。激活剂加入后将含有样本的离心管转移至37 ℃水浴锅内孵育30 min，之后将离心管取出置于离心机内使用3 000×g RCF离心20 min，之后提取上清液，获得富血小板血浆激活物。留取少部分进行ELISA实验测定生长因子及促炎因子含量，其余富血小板血浆激活物置入-80 ℃冰箱保存。
1.4.2 原代髓核细胞分离培养用静脉麻醉法处死小型猪(2%戊巴比妥钠，40 mg/kg，国药集团化学试剂有限公司，批号：WS20060401)，剥离其背部表皮及肌肉等组织，暴露脊柱。用咬骨剪咬掉多余骨质，分离出单个保留间盘组织的腰椎节段(L1-L6)，并用一次性手术刀和眼科镊分离完整髓核组织，操作过程确保无污染。在无菌培养皿中用眼科剪将髓核剪碎至约3 mm大小，并将组织块转入15 mL离心管内，浸泡在用DMEM-F12(1∶1)培养基配置的10%Ⅱ型胶原酶溶液中。随后在37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中消化4 h，消化过程中拧松离心管口。消化完毕后，向离心管内加入等体积的完全培养基(DMEM-F12∶胎牛血清=9∶1)终止胶原酶消化，将离心管管口拧紧，并置入低速离心机1 000 r/min，10 min离心。弃掉上清液，尽量保留沉淀物并转入25 cm2培养瓶中，用含有体积分数10%胎牛血清的完全培养基培养数日，期间半换液，尽量保留消化后的组织碎块以减少细胞量损失，每日观察细胞爬出及生长状况。
1.4.3 髓核细胞培养及传代待细胞贴壁后，再保持组织培养3 d左右，期间每日观察细胞生长情况，待细胞成团生长且密度接近融合率80%左右，可将P0细胞按照1∶3比例传代：将组织块和旧培养基一并丢弃，用PBS冲洗培养瓶2次，向培养瓶内加入3 mL含有10%EDTA的0.25%胰蛋白酶，将培养瓶置入37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中消化10 min。取出培养瓶之后用等体积完全培养基终止消化，培养瓶内容物转入15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min。将沉淀物用完全培养基重悬后转入新的培养瓶即P1，并用同样的方法将细胞传代至P3。
1.4.4 ELISA法测定生长因子质量浓度检测全血组、手工组、OSP组的目标因子，每个组的单个因子设立3个复孔，标准孔7孔。利用ELISA法测定富血小板血浆激活物中的PDGF-BB、转化生长因子β1、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α的质量浓度。按照试剂盒说明进行操作：利用包被缓冲液稀释抗体，之后在每一个孔中添加100 μL的稀释液，37 ℃环境孵育30 min，之后弃去孔内液体，PBS清洗3遍；按照每个孔100 μL待测样品的体积添加进反应孔中，37 ℃环境孵育1 h，同样使用PBS清洗3遍；随后在每一个反应孔加入稀释过的酶标抗体100 μL，再同样37 ℃孵育30 min，PBS清洗3遍；之后加底物液进行显色反应，每孔加入TMB底物溶液100 μL，37 ℃孵育10 min；每个孔加入50 μL终止液停止反应，随后测定结果，利用酶标仪测定450 nm吸光度(A)值。根据不同组样本的数据绘制曲线，然后计算样本中相应因子含量浓度。
1.4.5 CCK-8细胞增殖情况检测将P3代细胞用胰酶消化好并重悬，计数并接种于96孔板上，每孔添加100 μL细胞悬液(细胞浓度2×104 L-1)。待孔板内细胞融合度达到25%左右时，弃去原培养基，PBS洗2遍。按照对照组、全血组、手工组、OSP组的顺序添加干预因素：①对照组：10 μL PBS溶液；②全血组：10 μL全血激活物；③手工组：10 μL手工富血小板血浆激活物；④OSP组：10 μL套装制备富血小板血浆激活物。并在每个孔内添加新的完全培养基。每组设立5个复孔，在干预后的24，48，72 h添加CCK-8试剂，置入培养箱内孵育2 h，酶标仪测定A450 nm值，绘制生长曲线。
1.4.6 Western blot检测富血小板血浆的促合成代谢作用同样使用上述P3代细胞，调整细胞浓度为2×104 L-1铺板。每孔内添加1 mL细胞悬液，共铺2块6孔板：按照对照组、全血组、手工组、OSP组的顺序，每一组设置3个复孔。待细胞贴壁且融合率达到50%左右，再添加100 μL的干预因素：①对照组：100 μL PBS；②全血组：100 μL全血激活物；③手工组：100 μL手工制备富血小板血浆激活物；④OSP组：100 μL套装制备富血小板血浆激活物。

细胞培养5 d后进行检测：①首先进行蛋白提取：将样本取出，利用RIPA buffer裂解细胞，震荡悬浮，之后用超声波破碎仪破碎10 s，14 000×g 4 ℃离心10 min，用BCA试剂盒测定上清中的蛋白浓度。②RIPA将样品蛋白浓度调整至2 g/L，取30 μg蛋白，加入样品1/4体积的5xloading buffer，混匀，100 ℃水浴锅加热5 min。③电泳转膜：配置8%SDS-PAGE Gel，100 V稳压电泳(1 h左右)。直至样品进入分离胶，将电压调整到130 V，继续稳压跑，直至Loading buffer染料达到胶底部。停止电泳，拆板，进行湿转膜。转膜条件：25 mmol/L Trisbase，192 mmol/L Glycine，20% methanol转膜液，4 ℃ 100 V稳压转膜60 min。④一抗、二抗孵育与洗涤：5%脱脂奶粉(TBST)室温下封闭1 h；封闭完成后将膜用TBST洗涤3次；Ⅱ型胶原、聚蛋白聚糖抗体一抗1∶1 000，β-actin抗体1∶1 000，分别用3%BSA(TBST配置)稀释。4 ℃水平摇床孵育过夜；一抗孵育完成后，用TBST洗涤膜3×10 min。二抗(比例1∶1 000)用5%脱脂奶粉封闭液稀释，室温孵育60 min。⑤TBST洗涤3×10 min。提取PVDF膜，沥干膜上过多洗涤液。将膜平铺在干净的保鲜膜上并放入化学发光拍照仪，滴加配置好的ECL反应液反应2 min，曝光拍照。
1.5 主要观察指标富血小板血浆血常规测定；ELISA法测生长因子及促炎因子质量浓度(PDGF-BB、转化生长因子β1、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α)；CCK-8法检测24，48，72 h细胞增殖情况；Western Blot蛋白印迹法检测干预后5 d髓核细胞中Ⅱ型胶原、聚蛋白聚糖的蛋白表达。

1.6 统计学分析数据使用Graphpad Prism 9进行统计分析，绘制图表。计量资料数据表示方式采用x±s；组间比较使用单因素方差分析(One-way ANOVA)，显著性取α=0.05，P < 0.05时为差异有显著性意义。

讨论

脊柱退行性疾病的发生率极高，有研究统计约84%的成年人一生中都会经历至少一次的脊柱退行性疾病相关损害[10]，这其中又以髓核退变相关疾病为主[11]。髓核细胞由脊索细胞转化而来，在结构和功能上与软骨细胞类似，增殖能力较弱，其分泌的主要细胞外基质成分包括Ⅱ型胶原和聚蛋白聚糖。Ⅱ型胶原通过形成不规则网格化结构，使得聚蛋白聚糖在椎间盘内部保持稳定。聚蛋白聚糖具有吸水性，并且可以保持髓核整体的含水量维持在正常水准[12]。当椎间盘发生退变时，其内部的合成代谢与分解代谢平衡被打破，促炎因子促进基质金属蛋白酶水平上调，Ⅱ型胶原、聚蛋白聚糖的含量均下降，在MRI的T2WI上可以看到椎间盘内部信号的改变。退变后的椎间盘难以承受过高的机械负荷，将导致椎间盘突出。另一方面，椎间盘内部本身属于乏血管区，髓核内的聚蛋白聚糖具有抑制新生血管长入的作用[13]，如果退变发生而导致聚蛋白聚糖含量降低，新生血管长入深达纤维环或髓核，将会导致椎间盘源性腰痛。富血小板血浆之所以能够用于治疗椎间盘退变相关疾病，是因为其促进细胞增殖和促进细胞外基质合成的能力。有报道指出通过在间盘内注射富血小板血浆，突出物可以部分回缩[14]；退变髓核的T2相MRI信号强度改善，椎间隙高度得到恢复[15]；患者的疼痛能在短期内得到较好地缓解，目测类比评分显著降低[16]。这些作用都使得富血小板血浆在促进组织修复、促进患者临床症状改善以及快速康复方面具备了应用优势。

富血小板血浆对组织的修复功效主要源自其中蕴含的高浓度生长因子。在血小板的α颗粒中包含有许多不同类型的生长因子[17]，包括PDGF、转化生长因子[18]、胰岛素样生长因子[19]、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等。多种生长因子协同促进组织愈合，并且能发挥细胞趋化作用，促进新血管形成、细胞外基质合成，促使细胞产生更多的细胞外基质进行组织重塑。富血小板血浆活性成分中以PDGF和转化生长因子对于细胞增殖和组织重塑的作用最为重要。PDGF可以作为丝裂原，调节间充质细胞、成骨细胞等的有丝分裂；同时在胶原酶的分泌、胶原的合成等方面起到调控作用，另外还能刺激巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞的趋化[20]。当PDGF作用于椎间盘细胞后，会使细胞内磷脂酶C激活，增强二磷酸肌醇和二酰基甘油的合成，提高细胞内的钙离子浓度，从而使更多的细胞从G0/G1进入S期，加速细胞增殖。转化生长因子β在软骨的发生、生长板的发育、关节的形成、关节软骨的维持、椎间盘的形成发育过程等方面具有重要作用[21]。其能够刺激未分化间充质细胞增殖、调节内皮细胞和成纤维细胞有丝分裂、调节胶原合成和胶原酶分泌、刺激内皮细胞的趋化作用和血管生成、抑制巨噬细胞和淋巴细胞增殖。在椎间盘退变中的作用包括抑制细胞外基质降解并促进其合成、促进细胞增殖并抑制凋亡、抑制炎症反应减少炎症细胞聚集等等[22]。

此次研究从临床实践出发，选择了目前常用的手工制备方式以及套装制备方式结合全血以及空白对照对富血小板血浆的髓核干预效应进行了对比[23-25]。OSP组的富血小板血浆富集血小板浓度达到5.6倍，而白细胞浓度也富集了2.21倍，2项数据均高于手工组。从CCK-8结果来看，套装制备的富血小板血浆促进细胞增殖效应显著，而手工组促细胞增殖效应无显著性。而Western blot结果提示，OSP组套装制备的富血小板血浆能够显著提高Ⅱ型胶原的表达量，增加髓核组织的胶原水平，而手工组没有显著效应；OSP和手工组的富血小板血浆均没有明显提高聚蛋白聚糖的表达。其原因可能是在OSP制备富血小板血浆过程中，较高浓度的白细胞所带来的促分解代谢作用在一定程度上削弱了促合成代谢作用[26]。正如ELISA结果指出的，OSP组不仅具备高浓度的PDGF-BB、转化生长因子β1，同时也有很高浓度的白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α。促炎因子白细胞介素1β能够促进聚蛋白聚糖的去硫酰化并诱发聚蛋白聚糖的降解。因此，结果中OSP组聚蛋白聚糖的表达量没有显著增高，可能是由于OSP组富血小板血浆含有高浓度的白细胞介素1β[27]。既往也有文献报道指出，推荐使用含有白细胞成分较少的乏白细胞富血小板血浆用于椎间盘退变的修复，使用含有较高浓度的白细胞的富白细胞富血小板血浆对髓核细胞的合成代谢会产生负面的结果[28]。而此次研究中OSP组的白细胞浓度较高并非个案，在其他商品化制备套装中，同样存在着血小板浓度和白细胞浓度同步富集的情况。在一项对比不同制备套装的富血小板血浆制备结果的研究中[29]，威高富血小板血浆套装、Harvest 富血小板血浆套装的白细胞富集倍数甚至达到了4.4倍和4.2倍。在另一项不同制备套装的对比中，研究者对比了5款不同商品化制备套装(Arthrex Angel、Emcyte Genesis CS、Arteriocyte Magellan、Harvest SmartPrep以及Biomet GPSⅢ)所制备的富血小板血浆的参数，其中包括血小板浓度、白细胞浓度、嗜中性粒细胞浓度、红细胞浓度和pH值，结果表明这5种不同的套装同样存在白细胞和血小板同时富集的情况[30]。为了获得白细胞浓度较低的乏白细胞富血小板血浆，在第1次离心时应该选择较低的转速，使血小板不会大量沉降在白膜层(buffy coat)[31]，并尽量分离出白膜层以下的组分；在第2次离心时可以选用更大转速使血浆中的血小板尽可能沉降，沉淀物重悬之后即可获得白细胞较少的乏白细胞富血小板血浆。

此次研究仍存在局限性：①选用的是动物细胞实验，而缺少动物体内实验或临床研究，因此后续研究中应在此方面进行加强；②没有加入手动制备的二次离心法进行对比。综上所述，使用套装制备富血小板血浆的方法能够取得更好的髓核细胞促增殖和促合成代谢效应，但需要减少套装富集的白细胞带来的负面效应，从而达到更好的干预效果。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全血及不同方式制备富血小板血浆对髓核细胞的干预效应

Interventional effects of whole blood and platelet-rich plasma with different preparation methods on nucleus pulposus cells

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