结果显示：同型半胱氨酸组胰岛β细胞相关凋亡蛋白Bax荧光强度及蛋白水平表达与对照组相比明显上升，提示在同型半胱氨酸干预后Bax的表达量升高；同型半胱氨酸组Bcl-2荧光强度减弱及蛋白水平降低，提示在同型半胱氨酸干预后Bcl-2表达量下降；同型半胱氨酸组Caspase-3荧光强度及蛋白水平与对照组相比表达上升，提示同型半胱氨酸干预后Caspase-3表达量有所增加。由此证明同型半胱氨酸干预细胞后可以使胰岛β细胞的凋亡水平增加，见图1。



2.2   流式细胞术检测同型半胱氨酸对胰岛β细胞凋亡的影响   采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果显示：与对照组相比，同型半胱氨酸组细胞凋亡率与对照组相比明显升高。表明同型半胱氨酸干预后可使胰岛β细胞凋亡率上升，见图2。



2.3   同型半胱氨酸对EphA2表达水平的影响    为了证明EphA2可在同型半胱氨酸的诱导下致使胰岛β细胞发生凋亡，需检测胰岛β细胞中EphA2 mRNA和蛋白的表达情况，将分别采取实时荧光定量PCR及Western blot进行检测。结果显示：同型半胱氨酸组胰岛β细胞EphA2 mRNA表达与对照组相比，明显降低；且同型半胱胺酸组胰岛β细胞EphA2相关蛋白表达也明显降低，见图3。



2.4   同型半胱氨酸组对EphA2 DNA甲基化水平的影响   为了深入探索同型半胱氨酸使EphA2蛋白含量表达降低的具体机制，需采用巢式甲基化特异性PCR检测胰岛β细胞中EphA2的DNA甲基化水平。结果显示，同型半胱氨酸组EphA2 DNA甲基化水平与对照组相比明显升高，见图4。



2.5   同型半胱氨酸致胰岛β细胞凋亡中对DNMT1、DNMT3a蛋白表达的影响   Western blot法检测小鼠胰岛β细胞中DNMT1及DNMT3a蛋白表达状况。结果显示：同型半胱氨酸组胰岛β细胞DNMT1蛋白表达与对照组相比有所升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；而DNMT3a表达两组之间差异无显著性意义，见图5。

糖尿病是由胰岛素分泌或作用受损而导致血糖升高的一种慢性代谢性疾病，其中2型糖尿病在糖尿病患者中的比例高达90%[1-2]。2型糖尿病是由于胰岛素分泌不足，无法在有胰岛素抵抗的情况下降低血浆葡萄糖的浓度，当机体中葡萄糖稳态遭到破坏，会导致糖尿病发生，严重者还可诱发糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病血管病变等并发症的发生，甚至会危及生命。人体释放胰岛素的含量取决于胰岛β细胞的功能及数量[3]，同时有研究发现，在胰岛素抵抗的前期，胰岛β细胞可通过增加胰岛素分泌以维持血糖正常水平。当细胞发生凋亡时，会导致胰岛β细胞的数量骤降及胰岛功能发生不可逆的损伤，从而加快糖尿病的发生与发展。临床研究显示，2型糖尿病患者的血清中多伴有同型半胱氨酸水平升高，并与疾病的严重程度密切相关[4]。同型半胱氨酸是蛋氨酸在代谢过程中形成的一种中间产物[5]，实验室前期研究证实，同型半胱氨酸具有引起细胞发生凋亡、自噬、焦亡等重要的生物学功能[6-8]。Ephrin受体(Eph)是最重要的一类受体酪氨酸激酶(RTKs)，其中，肝配蛋白A型受体2(Ephrin A receptor 2，EphA2)是Eph受体家族中主要的调节因子[9-10]。研究发现，EphA2可在同型半胱氨酸诱导内皮细胞损伤的过程发挥着重要的作用，但其在同型半胱氨酸引起血糖异常中的作用尚不清楚[11]。DNA甲基化是同型半胱氨酸引起相关疾病的重要机制，且有研究显示，DNA甲基化水平异常是糖尿病发生的关键表观遗传学标志[12-14]。但同型半胱氨酸是否通过改变 EphA2 DNA 甲基化水平参与糖尿病的发生发展目前尚未见报道。因而，此次研究旨在探讨 EphA2 DNA 甲基化在同型半胱氨酸致胰岛β细胞凋亡中的作用，为进一步研究同型半胱氨酸导致糖尿病发生发展的分子机制提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   体外细胞实验，两组样本比较采用独立样本t检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年11月至2021年12月在宁夏医科大学国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室完成。
1.3   材料   小鼠胰岛β细胞株(Min6)，由宁夏医科大学病理生理学系惠赠。

实验主要试剂盒及仪器：胎牛血清、RPMI-1640培养基(美国，Gibco)；胰蛋白酶消化液(碧云天生物技术研究所)；同型半胱氨酸粉末(美国，Sigma)；基因组DNA提取试剂盒、总RNA提取试剂盒(北京，天根)；全蛋白提取试剂盒和蛋白定量试剂盒(南京，凯基)；反转录和实时荧光定量PCR试剂盒(美国，Thermo Fisher)；DNA甲基化修饰试剂盒(美国，ZYMO)；EphA2抗体、Bax抗体、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3(cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，Caspase-3)抗体、Bcl-2抗体(中国Affinity公司)；β-actin抗体(中山金桥，中国)；引物由上海生工生物工程有限公司合成；CO2培养箱(德国，Heraeus)；超净工作台(苏州，安泰)；5415D型微量台式离心机(德国，Eppendorf)；BS110S型精密天平(德国，Sartorius)；荧光定量PCR仪(上海，枫岭)；电泳仪、电转仪、凝胶成像仪(美国，Bio-rad)；激光共聚焦显微镜(Zeiss)。
1.4   实验方法   
1.4.1   细胞培养及处理   在含有体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养小鼠胰岛β细胞，置于温度为37 ℃，体积分数5%的CO2细胞培养箱中。当细胞密度占培养瓶总体积的80%时，按1∶3比例进行传代，2 d传代1次，取第3代细胞进行相关实验操作。取状态良好的细胞接种到6孔板中，当细胞浓度达到1×105个/孔时，分别用同型半胱氨酸浓度为0 µmol/L作为对照组，同型半胱氨酸浓度为120 µmol/L作为同型半胱氨酸组，在干预48 h后，将细胞收集于离心管中，进行相关指标检测。
1.4.2   免疫荧光染色检测Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达   用体积分数4%甲醛分别固定对照组及同型半胱氨酸组小鼠胰岛β细胞30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，体积分数10%过氧化氢下孵育10 min，PBS冲洗3次后加山羊血清封闭60 min，加入相对的Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗抗体(1∶400)，在4 ℃条件下孵育过夜后取出细胞，在室温下静置30 min恢复室温，PBS冲洗5 min加入荧光二抗(1∶100)，在避光条件下37 ℃孵育1 h后用PBS冲洗并避光加入100 μL DAPI染细胞核5 min，再次用PBS冲洗后滴加荧光淬灭剂封固，将染色后的细胞置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
1.4.3   流式细胞术检测细胞凋亡率   胰岛β细胞分为2组：①对照组(0 µmol/L同型半胱氨酸)；②同型半胱氨酸组(120 µmol/L同型半胱氨酸)。胰岛β细胞同型半胱氨酸干预48 h后，收细胞，PBS洗2遍后，用不含酚红和EDTA的0.25%胰酶消化后将细胞轻吹下来，转入1.5 mL离心管中，用离心机离心(4 ℃，1 000 r/min，5 min)后倒掉废液，加入1 mL PBS吹匀离心，重复上述操作2次。在避光条件下按1∶9的比例配结合液加入到各个离心管后，再分别加入PerCP 5 μL，PE 5 μL轻拨混匀，静止15 min。吹匀并用滤膜过滤后，立即用流式细胞仪检测细胞凋亡率。采用NovoExpress软件处理流式数据。
1.4.4   实时荧光定量PCR检测EphA2 mRNA的表达   依据RNA simple Total RNA Kit提取各组中小鼠胰岛β细胞总RNA，将总RNA依据Takara Bio 037A试剂盒反转录后合成cDNA；EphA2序列可通过NCBI及GenBank数据库进行查找并对其进行引物合成。

EphA2：F：5'-GCA CAG GGA AAG GAA GTT GTT-3'；R：5'-CAT GTA GAT AGG CAT GTC GTT C-3'。

PCR扩增程序：95 ℃(30 s)，95 ℃(5 s)，55.1℃(34 s)，设循环40次，将GAPDH设置为内参，并根据2-ΔΔCt法计算待检测各组小鼠胰岛β细胞中EphA2 mRNA的表达量。
1.4.5   Western blot检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、EphA2、DNMT1、DNMT3a的蛋白表达   按照全蛋白提取试剂盒说明书提取对照组和同型半胱氨酸组胰岛β细胞全蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度后定量，按1∶4加入蛋白loading buffer，金属浴99 ℃煮沸5 min使蛋白变性，每组取30 µg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电压为80 V，30 min后转至120 V，之后进行电转设置程序为：0.3 A，2 h，将蛋白转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭2 h，用PBST洗膜4次，每次5 min，分别按说明书上相应比例用抗体稀释液稀释Bcl-2、Bax、DNMT1、EphA2、Caspase-3、DNMT3a以及β-actin抗体，4 ℃ 摇床过夜；使用辣根过氧化物酶标记的二抗，按1∶5 000比例稀释，室温下孵育2 h，PBST洗膜4次/5 min；在凝胶成像分析仪上进行成像分析，统计Bcl-2、Bax、Caspase-3、EphA2、DNMT1和DNMT3a与β-actin内参灰度值的比值并进行计算分析。
1.4.6   巢氏甲基化特异性PCR检测EphA2 启动子区DNA甲基化水平   按照TIANamp Genomic DNA kit说明书提取各组细胞的全基因组DNA，并对提取后的全基因组DNA进行甲基化修饰。巢式甲基化特异性PCR法检测EphA2启动子区DNA甲基化水平是否发生变化。根据EphA2的序列，在MethPrimer网页设计内外引物及甲基化与非甲基化引物，见表1。

引物反应体系：总体积为25 μL，PCR MIX：12.5 μL，ddH2O：7 μL，F'：1 μL，R'：1 μL，修饰后DNA：3.5 μL；以外引物PCR产物为模板，引物扩增的反应条件为：95 ℃(5 min)；95 ℃(30 s)，63 ℃(30 s)，51 ℃(30 s)，循环数为20次。并对内引物甲基化和非甲基化引物进行扩增，随后用曝光仪在1%的琼脂糖凝胶上进行成像分析。发生甲基化为甲基化阳性条带(M)，未发生甲基化为非甲基化阳性条带(U)，按规定甲基化公式进行计算：甲基化=M/(M+U)×100%。
1.5   主要观察指标   ①Western blot及免疫荧光检测各组细胞 Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡相关蛋白表达；②流式细胞术检测细胞凋亡情况；③实时荧光定量PCR及Western blot检测EphA2 mRNA及蛋白表达；④巢式甲基化特异性PCR及Western blot检测在同型半胱氨酸作用下EphA2 DNA甲基化水平的变化。
1.6   统计学分析   文章统计学方法已经宁夏医科大学生物统计学专家审核。使用Prism 8.0统计软件对实验数据进行统计并分析，检测结果均属计量资料，以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05时表示实验数据差异有显著性意义。

随着经济的持续发展，人们的生活质量不断提高，同时2型糖尿病的发病率也日益增加且呈低龄化发展。2017年全球约有4.15亿2型糖尿病患者，预计到2045年将达到6.93亿。2型糖尿病是由胰腺中β细胞发生不可逆损伤导致胰岛素分泌下降和外周细胞胰岛素抵抗导致血糖升高、碳水化合物、蛋白质和脂质代谢发生紊乱的一种慢性疾病[15-16]。研究表明，凋亡对于维持胰岛β细胞稳态至关重要，当炎症和高糖高脂等因素对胰岛β细胞造成损伤时，会引起其发生凋亡，适当的凋亡水平有助于维持胰岛β细胞内环境平衡，但是过量的细胞凋亡水平会导致胰岛β细胞数量发生不可逆减少，进而引起胰岛素分泌降低[17]。因此细胞凋亡在2型糖尿病的发生发展中起着重要的作用。

细胞凋亡是由机体的异常变化从而触发细胞内预存的死亡程序而导致细胞发生死亡的过程[18]。细胞主要通过外源性、内源性和穿孔素介导这3种途径被激活而发生凋亡，这些途径都可以导致Caspase-3的激活。Bcl-2是公认的细胞凋亡调控靶点，它可与Bax发生拮抗[19]。Bcl-2的表达下降，会导致Bax转位到线粒体膜的数量增加，使线粒体的通透性增强并释放细胞色素c，激活Caspase-3的联线反应，进而发生凋亡[20]。而Caspase-3是细胞凋亡途径中常见的关键蛋白[21]，同时也是细胞凋亡的启动者和执行者，具有促进细胞因子生成和调节细胞生长、分化的作用。研究表明，同型半胱氨酸生物学功能繁多，其可加快血管动脉粥样硬化的形成，对内皮细胞造成损伤并调节脂质代谢等。人体中的同型半胱氨酸多以呈游离型的半胱氨酸结合物在血清中存在，少量以还原型同型半胱氨酸形式存在于血清之中。研究显示，同型半胱氨酸是心血管疾病发生的独立危险因素[22]。但在糖尿病患者中发现，血清中的同型半胱氨酸水平显著升高，因此糖尿病患者多伴有高同型半胱氨酸血症[23]。此次研究采用免疫荧光及Western blot检测到，与对照组相比，同型半胱氨酸组细胞Bax/Bcl-2的比值增大。而Bax与Bcl-2的比值决定了Caspase-3的激活程度，其比值越大，被激活程度越高，反之亦然。此次实验中发现，同型半胱氨酸组Caspase-3的蛋白表达明显上升。综上所述，同型半胱氨酸可以刺激胰岛β细胞发生凋亡，但是同型半胱氨酸具体通过哪种途径诱导胰岛β细胞发生凋亡目前尚不明确。

EphA2是产生促红细胞生成素的肝配蛋白(Eph)受体的主要成员[24]，Eph受体酪氨酸激酶及其ephrin的配体在多种生理和病理过程中都发挥着重要的作用。Eph受体及其配体分为2个亚家族，其中Eph受体是受体酪氨酸激酶(RTK)的最大亚家族。EphA2位于细胞膜上，与ephrin-A配体结合会导致其降解，并抑制细胞的增殖，而在没有配体的情况下，EphA2积累增多，同时增加细胞的侵袭性。研究表明，EphA2在乳腺癌、宫颈癌和胰腺癌中均高表达，在细胞的增殖和转移中发挥着重要作用[25-26]。WEI等[27]在研究胰腺癌模型小鼠中发现，降低EphA2的基因表达可使其肿瘤的生长和转移速度减慢，同时肿瘤细胞的凋亡水平升高。此次实验发现EphA2在同型半胱氨酸干预的胰岛β细胞中蛋白含量及mRNA的表达水平明显低于对照组，因此，这提示EphA2可能通过对胰岛β细胞凋亡的负向调控，从而在糖尿病发病的病理过程中发挥着功能。

DNA甲基化是表观遗传最具有特征性的机制之一[28]，它通过影响染色质结构、DNA稳定性、DNA构象和DNA与蛋白质相互作用，从而可以调控基因的特异性表达，其中DNMT1和DNMT3a是调控DNA甲基化的关键因子[29-31]。DNA甲基化对于哺乳动物的组织发育和体内代谢平衡是必不可少的，目前已发现DNA甲基化在包括糖尿病、慢性肾病等疾病中异常表达[32-33]。虽然理论上游离的甲基可以添加到DNA碱基的任何腺嘌呤或胞嘧啶上，但胞嘧啶甲基化通常仅在基因启动子区的CpG二核苷酸中观察到，这是富含CpG区域的基因是否具有DNA甲基化的重要理论依据[34]。通过分析EphA2基因启动子区CpG岛提示，EphA2可发生甲基化。人体所有的细胞中都包含胰岛素基因，但胰岛素基因只在胰岛β细胞中表达，研究发现，胰岛素基因可以促进胰岛β细胞产生，当胰岛素基因发生高甲基化时其功能则被抑制，从而使胰岛β细胞生成的数量减少，并且发生胰岛素抵抗，最终导致2型糖尿病的发生[35]。同时同型半胱氨酸是半胱氨酸参与甲基转移酶反应的副产物，因此其与细胞相关基因的DNA高甲基化密切相关。此次实验发现，同型半胱氨酸组中EphA2 DNA甲基化水平明显升高，而前面的结果已经表明同型半胱氨酸组中EphA2 基因的蛋白呈低表达，这就提示EphA2的表达水平降低与EphA2启动子区DNA甲基化水平升高密切相关。DNMT1是DNA复制后维持甲基化模式的主要酶[36]，在多种疾病中发挥着重要的调节作用。CHEN等[37]发现在2型糖尿病患者和小鼠的胰岛素基因中，均有高甲基化的发生，且检测出DNMT1与2型糖尿病患者的易感性相关，DNMT1在2型糖尿病中的表达明显高于对照组。此次研究发现同型半胱氨酸组中DNMT1表达升高，提示DNMT1可能在导致EphA2 DNA高甲基化中作用明显。

综上所述，EphA2启动子区DNA甲基化水平呈现高表达，可能是同型半胱氨酸导致胰岛β细胞凋亡的关键机制，这为更深一步探究同型半胱氨酸导致胰岛β细胞分泌功能发生障碍并导致糖尿病的发生提供了新的实验依据和研究方向。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
胰岛β细胞：是胰岛细胞中的一种内分泌细胞，位于胰岛的中部，可分泌胰岛素，在调节体内血糖水平的过程中起着重要的作用。当胰岛β细胞功能受到损伤时，会导致胰岛素分泌绝对或相对不足，发生胰岛素抵抗，使血糖异常升高，从而引发糖尿病。
EphA2：肝配蛋白A型受体2(EphA2)位于细胞膜上，是一种受体酪氨酸激酶，包含一个保守N端配体结合的胞外结构域、一个跨膜结构域和一个保守酪氨酸激酶结构域。Eph受体和相应的Eph受体相互作用(ephrin)的配体共同构成具有多种功能的关键细胞信号网络。

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2型糖尿病是由于胰岛素分泌不足，无法在有胰岛素抵抗的情况下降低血浆葡萄糖的浓度，当机体中葡萄糖稳态遭到破坏，会导致糖尿病发生，严重者还可诱发糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病血管病变等并发症的发生，甚至会危及生命。人体释放胰岛素的含量取决于胰岛β细胞的功能及数量，同时有研究发现，在胰岛素抵抗的前期，胰岛β细胞具有通过增加胰岛素分泌以维持血糖正常水平。当细胞发生凋亡时，会导致胰岛β细胞的数量骤降及胰岛功能发生不可逆的损伤从而加快糖尿病的发生与发展。

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