骨形态发生蛋白7抑制椎间盘髓核细胞的凋亡

doi:10.12307/2022.542

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (17): 2726-2731.doi: 10.12307/2022.542

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

骨形态发生蛋白7抑制椎间盘髓核细胞的凋亡

徐学振，宋立先，李爱群，杨坚，李晓鲲，王占青，石青鹏

滨州医学院烟台附属医院，山东省烟台市 264100

收稿日期:2021-06-15 修回日期:2021-06-17 接受日期:2021-08-14 出版日期:2022-06-18 发布日期:2021-12-27
通讯作者: 石青鹏，硕士，副主任医师，滨州医学院烟台附属医院，山东省烟台市 264100
作者简介:徐学振，1984年生，2011年哈尔滨医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事骨组织方面的研究。
基金资助:
山东省医药卫生科技发展计划项目(2019WS340)，项目名称：不同代次兔髓核种子细胞超低温保存的实验研究，项目负责人：徐学振

Bone morphogenetic protein 7 inhibits apoptosis of nucleus pulposus cells

Xu Xuezhen, Song Lixian, Li Aiqun, Yang Jian, Li Xiaokun, Wang Zhanqing, Shi Qingpeng

Yantai Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Yantai 264100, Shandong Province, China

Received:2021-06-15 Revised:2021-06-17 Accepted:2021-08-14 Online:2022-06-18 Published:2021-12-27
Contact: Shi Qingpeng, Master, Associate chief physician, Yantai Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Yantai 264100, Shandong Province, China
About author:Xu Xuezhen, Master, Associate chief physician, Yantai Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Yantai 264100, Shandong Province, China
Supported by:
Shandong Provincial Medicine and Health Science and Technology Development Plan, No. 2019WS340 (to XXZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
椎间盘髓核细胞：髓核是椎间盘内类似凝胶样的物质，由软骨样的细胞、胶原纤维和蛋白多糖组成，它的作用是在脊柱压缩负载的情况下全面地调节液压。椎间盘细胞存在于一个营养供应有限、缺氧、高渗、过酸和机械过载的特殊内环境中，因此除了自然衰老过程外，机械过载、椎间盘损伤、氧化应激损伤、糖尿病、吸烟、肥胖和遗传等都是椎间盘细胞衰老的危险因素，而髓核细胞体外培养可为研究椎间盘退变的细胞学及分子生物学机制提供实验基础。
骨形态发生蛋白：又称骨形成蛋白，是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白，属于转化生长因子β家族。骨形态发生蛋白能刺激DNA的合成和细胞的复制，从而促进间充质细胞定向分化为成骨细胞。它还是体内诱导骨和软骨形成的主要因子，并在肢体生长、软骨内骨化、骨折早期及软骨修复时表达，对骨骼的胚胎发育和再生修复起重要作用。

背景：椎间盘退变是引起下腰痛的主要原因之一，目前临床的手术治疗可以缓解疼痛症状，但会牺牲椎间盘的功能，无法完全治愈椎间盘退变，开发新的生物学治疗方法对于遏制早期椎间盘退变的进展，或再生退变的椎间盘组织是非常重要的。
目的：探讨骨形态发生蛋白7能否减轻人椎间盘髓核细胞在传代培养过程的细胞衰老及其可能机制。
方法：以行椎间盘摘除术的患者为研究对象，手术过程中获取椎间盘组织并提取人椎间盘髓核细胞体外传代培养6次。在培养基中外源性加入骨形态发生蛋白7或磷酯酰肌醇-3激酶特异性抑制剂LY294002，分别检测细胞增殖能力、端粒酶活性、β-半乳糖苷酶活性，以及细胞凋亡相关基因和磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路分子的表达情况。
结果与结论：①细胞培养基中添加骨形态发生蛋白7后可以显著提高髓核细胞增殖能力和端粒酶活性，降低细胞β-半乳糖苷酶活性，并下调p16和p53的表达，激活磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路；②此外通过磷酯酰肌醇-3激酶特异性抑制剂LY294002能够明显逆转骨形态发生蛋白7对髓核细胞的抗凋亡作用；③提示骨形态发生蛋白7通过激活磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B途径发挥髓核细胞的抗凋亡作用，可为异体椎间盘髓核细胞的体外培养和组织工程学研究提供新思路。
缩略语：β-半乳糖苷酶：senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal；磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B：phosphatidyl-inositol 3-kinase/ protein kinase B，PI3K/Akt

https://orcid.org/0000-0003-3778-6783 (徐学振)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 椎间盘再生, 髓核细胞, 骨形态发生蛋白7, 细胞凋亡

Abstract: BACKGROUND: Disc degeneration is one of the major causes of lower back pain, and current clinical surgical treatments can relieve painful symptoms but sacrifice disc function and cannot completely cure disc degeneration. Therefore, it is important to develop new biological treatments to curb the progression of early disc degeneration, or to regenerate degenerated disc tissue.
OBJECTIVE: To investigate whether bone morphogenetic protein 7 can reduce the senescence of human nucleus pulposus cells during subculture and its possible mechanism.
METHODS: Patients who underwent discectomy were enrolled in this study. During the operation, the intervertebral disc tissue was obtained and human nucleus pulposus cells were extracted and subcultured in vitro for six times. The cells were then cultured with bone morphogenetic protein 7 or LY294002, a specific inhibitor of phosphatidyl-inositol 3-kinase. Cell proliferation ability, telomerase activity, β-galactosidase activity, and the expression of apoptosis-related genes and phosphatidyl-inositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway molecules were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone morphogenetic protein 7 could significantly increase the cell proliferation and telomerase activity of nucleus pulposus cells, decrease the activity of β-galactosidase, down-regulate the expression of p16 and p53, and activate phosphatidyl-inositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway. In addition, LY294002 could significantly reverse the anti-apoptotic effect of bone morphogenetic protein 7 on nucleus pulposus cells. Overall, bone morphogenetic protein 7 exerts the anti-apoptotic effect on nucleus pulposus cells by activating the phosphatidyl-inositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway. The results of this study can provide new knowledge for in vitro culture and tissue engineering of allogenic nucleus pulposus cells.

Key words: intervertebral disc regeneration, nucleus pulposus cells, bone morphogenetic protein 7, apoptosis

中图分类号:

徐学振, 宋立先, 李爱群, 杨坚, 李晓鲲, 王占青, 石青鹏. 骨形态发生蛋白7抑制椎间盘髓核细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(17): 2726-2731.

Xu Xuezhen, Song Lixian, Li Aiqun, Yang Jian, Li Xiaokun, Wang Zhanqing, Shi Qingpeng. Bone morphogenetic protein 7 inhibits apoptosis of nucleus pulposus cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(17): 2726-2731.

图/表（结果） 4

2.1 骨形态发生蛋白7可以促进椎间盘髓核细胞的增殖 CCK-8细胞增殖实验结果显示，与对照组相比，用骨形态发生蛋白7处理后的人椎间盘髓核细胞的增殖能力显著提高，但是添加PI3K抑制剂LY294002后，骨形态发生蛋白7的促细胞增殖作用被明显抑制，见图1，提示骨形态发生蛋白7的促增殖作用可能通过PI3K信号通路发挥作用。

2.2 骨形态发生蛋白7可以增强椎间盘髓核细胞中端粒酶活性 ELISA试剂盒检测细胞内的端粒酶活性，发现与对照组髓核细胞相比，经骨形态发生蛋白7处理的椎间盘髓核细胞内端粒酶活性明显增强，提示骨形态发生蛋白7可抑制椎间盘髓核细胞凋亡；但是添加PI3K抑制剂LY294002后，骨形态发生蛋白7处理过的椎间盘髓核细胞的端粒酶活性被抑制，见图2，说明骨形态发生蛋白7可能是通过PI3K信号通路介导髓核细胞的抗凋亡作用。

2.3 骨形态发生蛋白7可以明显抑制椎间盘髓核细胞中 SA-β-Gal活性衰老细胞有着显著的特性，其中之一就是细胞通常体积变大，SA-β-Gal的活性增强，通过试剂盒检测SA-β-Gal活性发现，与对照组髓核细胞相比，骨形态发生蛋白7处理后的椎间盘髓核细胞内的SA-β-Gal活性显著降低。但是添加抑制剂LY294002抑制PI3K蛋白后，可以部分提高骨形态发生蛋白7处理后人椎间盘髓核细胞的SA-β-Gal活性，见图3。

2.4 骨形态发生蛋白7可以调控髓核细胞内衰老相关基因的转录和翻译水平与对照髓核细胞相比，骨形态发生蛋白7处理后的人椎间盘髓核细胞中，凋亡相关基因p16和p53的mRNA表达均下调，并且骨形态发生蛋白7对p16和p53基因的抑制作用可以被抑制剂LY294002所逆转，见图4A。进一步通过免疫印迹检测衰老标志物的蛋白质表达情况，发现在骨形态发生蛋白7处理的人椎间盘髓核细胞中p16和p53的蛋白质表达均被下调，但是抑制剂LY294002可以提高被抑制的p16和p53的蛋白表达水平，见图4B。同时检测PI3K/Akt信号通路的关键信号分子p-Akt和PI3K，证实骨形态发生蛋白7通过激活PI3K/Akt信号通路参与调控椎间盘髓核细胞的抗凋亡作用，见图4C，D。

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引言

椎间盘退变是引起下腰痛的主要原因之一[1]，目前针对椎间盘退变的临床治疗以手术为主，包括椎间盘切除术和脊柱椎间融合术，主要目的是缓解疼痛症状，但会牺牲椎间盘的功能，无法从根本上治愈椎间盘退变[2]。因此开发一种生物学治疗方法从根本上减缓早期椎间盘退变的进展，或再生退变的椎间盘组织尤为重要和迫切。
基于组织工程的治疗策略可以再生和修复变性组织，而组织工程疗法的关键是获取合适而足够的细胞资源[3-4]。鉴于椎间盘变性时髓核区域首先表现出退行性变化，因此针对椎间盘的大多数组织再生方法主要聚焦于通过合成新的细胞外基质来增强髓核细胞活性或增加髓核细胞密度以改善和恢复椎间盘髓核组织的功能[5-6]。同种异体髓核细胞移植是组织工程生物治疗的焦点，然而在手术过程中实际获取到的椎间盘髓核细胞经常表现出衰老和凋亡的倾向，并且在体外细胞培养和扩增的过程中，髓核细胞的衰老表型随着传代倍数的增加而加重[7-8]。因此，在细胞传代培养过程中减轻人椎间盘髓核细胞衰老和凋亡是椎间盘退变生物学治疗亟待解决的关键问题。
既往研究认为，生长因子能够促进椎间盘细胞的生物学功能，甚至可以再生退变的椎间盘组织[9-11]。骨形态发生蛋白7作为生长因子的一种，属于转化生长因子β家族[12]，体内和体外研究表明，骨形态发生蛋白7通过提高椎间盘细胞活力和基质合成代谢来延缓椎间盘退变[12-13]。此次研究旨在进一步探讨骨形态发生蛋白7能否延缓传代培养人椎间盘髓核细胞的衰老及其可能机制，现将研究结果报道如下。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)分析。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2021年1月在滨州医学院烟台附属医院骨科完成。
1.3 对象研究对象为7例因椎间盘突出行椎间盘切除术的患者，平均年龄47岁。采用Thompson分级系统对椎间盘退变节段进行评分，其中Ⅲ级变性3例(男1例，女2例)，Ⅳ级变性4例(男2例，女2例)。
纳入标准：①确诊单节段椎间盘突出患者，经正规保守治疗无效，症状严重影响日常生活，手术意愿强烈；②影像学资料提示为软性突出或椎间孔狭窄，不伴有后纵韧带、黄韧带骨化。
排除标准：①病变节段存在明显颈椎不稳者；②症状不典型或不能明确责任节段者；③合并系统性疾病不能耐受全身麻醉手术的患者。
1.4 材料
1.4.1 标本来源所有人体椎间盘样本的获取过程均符合滨州医学院烟台附属医院伦理委员会[批准号：Kydd(SU)2020-0206]和赫尔辛基宣言中描述的伦理标准，手术过程中选取中心的椎间盘组织标本以用于后续实验。在此次研究中，所有患者在样本采集前均签署知情同意书并进行实验方案告知。
1.4.2 主要实验试剂 0.25%胰蛋白酶(25200-056，Gibco，美国)，0.20%胶原酶(9001-12-1，Sigma Aldrich，美国)，重组人源性骨形态发生蛋白7(P5772，碧云天，中国)，LY294002(9901S，CST，美国)，CCK-8试剂盒(C0038，碧云天，中国)，端粒酶ELISA试剂盒(yb-E11110，BioLegend，美国)，β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色试剂盒(RG0039，Beyotime，中国)，TRizol试剂(15596026，Invitrogen，美国)，实验相关抗体兔抗人β-actin蛋白单克隆抗体(ab8226，Abcam，美国)，鼠抗人 p16蛋白单克隆抗体(ab108349，Abcam，美国)，鼠抗人p53蛋白单克隆抗体(ab1101，Abcam，美国)，鼠抗人PDK2蛋白单克隆抗体(sc-100534，CST，美国)，兔抗人蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)蛋白单克隆抗体(#4685，CST，美国)，鼠抗人p-Akt蛋白单克隆抗体(#9271，CST，美国)，化学发光BeyoECL Plus试剂盒(P0018S，Beyotime，中国)。
1.5 方法
1.5.1 髓核细胞的分离和培养手术获取的椎间盘组织标本用PBS洗涤3次，在显微镜下进一步分离出椎间盘髓核组织，以0.25%胰蛋白酶和0.20%胶原酶对髓核组织进行酶消化。将髓核细胞在体外传代培养5代，取第6代(P6)人椎间盘髓核细胞进行此次研究的相关实验。
细胞体外实验分为3组：对照组(正常培养基不做处理)；骨形态发生蛋白7组：在细胞培养基中加入骨形态发生蛋白7(100 μg/L)；骨形态发生蛋白7+LY294002组：培养基中加入骨形态发生蛋白7(100 μg/L)基础上，添加磷酯酰肌醇-3激酶 (phosphatidyl-inositol 3-kinase，PI3K)特异性抑制剂LY294002(10 μmol/L)。
1.5.2 CCK-8细胞增殖实验通过CCK-8试剂盒评估细胞增殖能力，将P6的人椎间盘髓核细胞(每组每孔1×104个细胞)接种到24孔培养板中。在第1，2，4，8天，200 μL培养基中加入20 μL CCK-8工作溶液，更换培养基，在37 ℃下进一步孵育30 min后，分光光度计测量450 nm波长下的吸光度A值。
1.5.3 端粒酶活性测定采用端粒酶ELISA试剂盒分析端粒酶活性。收集P6人椎间盘髓核细胞后，将其裂解并离心，收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行端粒酶活性检测。
1.5.4 SA-β-Gal活性测量使用SA-β-Gal染色试剂盒测定 SA-β-Gal活性，按照每组每孔1×105细胞进行接种，以无菌PBS洗涤P6人盘髓核细胞2次后，对细胞进行SA-β-Gal染色，显微镜下观察SA-β-Gal活性细胞数目，计算10个随机视野下SA-β-Gal阳性染色细胞与总细胞的比例。

1.5.5 RT-PCR分析通过RT-PCR分析凋亡相关基因CDK3、p16和p53以及PI3K-Akt信号通路关键分子的表达，使用TRizol试剂提取椎间盘髓核细胞的总RNA，反转录合成为cDNA，设计p16和p53基因特异性PCR引物(引物序列见表1)，然后由cDNA，基因引物和SYBR Green Mix酶组成的反应系统中进行PCR，β-actin基因作为内参基因。PCR反应方案：95 ℃持续3 min，然后进行35个循环，分别是95 ℃持续10 s，56 ℃持续15 s，72 ℃持续30 s。记录反应的Ct值，按照2-∆∆Ct的方法计算基因相对表达。

1.5.6 蛋白质免疫印迹(Western blot)分析 RIPI裂解缓冲液提取P6椎间盘髓核细胞的总蛋白，采用电泳法在SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质上清液样品，以湿转法将其转移到PVDF膜上。随后，将PVDF膜与一抗在4 ℃过夜，次日与二抗体在37 ℃环境中孵育2 h。最后，使用BeyoECL Plus化学发光试剂盒对蛋白条带显影，使用Image J软件进行图像分析。
1.6 主要观察指标髓核细胞的增殖情况、端粒酶活性、髓核细胞中SA-β-Gal活性以及衰老相关基因的转录和翻译水平表达。
1.7 统计学分析所有数据均表示为3个独立实验的x±s，使用SPSS 19.0软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)， P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

椎间盘退变相关性疾病在骨科临床中比较常见，患者主要表现为腰痛和活动受限，不仅影响日常工作生活，也会为社会医疗带来沉重经济负担。腰椎间盘退变机制复杂，常伴有下腰痛、急性下肢神经根型疼痛等不良症状，严重影响患者的生活质量，多项研究表明机体炎症反应、氧化应激反应、髓核细胞退变等均与腰椎间盘退变联系密切[14-15]。髓核组织是椎间盘中央的胶状组织，是椎间盘退变过程中首先表现出退行性变化的部位[16]。髓核细胞衰老是退变椎间盘组织的重要细胞特征，与椎间盘退变的进展呈正相关[17]，因此如何抑制髓核细胞衰老可能是未来延缓和治疗椎间盘退变的有效途径。衰老髓核细胞呈现几个典型的特征，如SA-β-Gal活性增加，细胞增殖减少，端粒酶活性降低，出现G0/G1细胞周期阻滞，衰老相关标记物的表达增加[18-19]。与其他组织不同的一点是，椎间盘细胞存在于一个营养供应有限、缺氧、高渗、过酸和机械过载的特殊内环境中，因此除了自然衰老过程外，机械过载、椎间盘损伤、氧化应激损伤、糖尿病、吸烟、肥胖和遗传等都是椎间盘细胞衰老的危险因素[14，20]。既往一些探索抑制椎间盘细胞衰老的研究发现，通过siRNA抑制p53的表达以及延长端粒酶长度可以延缓椎间盘细胞的衰老过程[21]，但是针对上游信号调控分子的研究证据不多。
此次研究首次探讨了骨形态发生蛋白7对传代培养的人椎间盘髓核细胞衰老和凋亡的调控作用，结果发现，骨形态发生蛋白7能显著提高椎间盘髓核细胞的增殖能力和端粒酶活性，降低SA-β-Gal活性，下调衰老标志物的表达；表明骨形态发生蛋白7能够作为上游调控分子，减轻传代培养诱导的人椎间盘髓核细胞的衰老和凋亡过程，可能成为未来椎间盘退行性病变的治疗靶点[22-28]。骨形态发生蛋白7是转化生长因子β超家族成员之一，具有强大的骨诱导活性，一定浓度的骨形态发生蛋白7能促进髓核及纤维环细胞有丝分裂[29-31]。一些研究已经报道了其他类型的生长因子(即转化生长因子β)在减轻髓核细胞衰老方面也能发挥相似的作用，一篇针对间充质干细胞的研究发现，骨形态发生蛋白3通过激活转化生长因子β信号通路诱导骨髓间充质干细胞增殖和分化为髓核样细胞，增加髓核细胞的数量并增补衰老的髓核细胞[32]。而且研究发现，转化生长因子β与ML264协同作用，阻断椎间盘髓核中Krüppel样因子5介导的白细胞介素1β诱导的基质降解，缓解椎间盘退变引起的下腰痛[33]。
细胞衰老和凋亡过程中存在多种信号通路的激活和作用，已有研究证实PI3K/Akt通路参与多种细胞活动，如细胞衰老、细胞凋亡和细胞增殖[34]。此次研究观察到骨形态发生蛋白7通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制了传代培养诱导的人椎间盘髓核细胞的衰老过程。此外，PI3K的特异性抑制剂LY294002抑制PI3K/Akt通路可部分减弱骨形态发生蛋白7对传代诱导的人椎间盘髓核细胞衰老的调控作用。与此次研究结果一致的是，既往研究报道了PI3K/Akt通路的激活也会参与其他类型细胞的衰老，例如大鼠心肌梗死模型中，抑制PI3K/Akt信号通路会加重缺血性心肌细胞的凋亡[35]；而在大鼠骨关节炎模型的软骨细胞中，激活PI3K/Akt信号通路可以明显增强软骨细胞的增殖活力，从而抑制细胞凋亡[36-37]。
然而，此次研究也存在一定的局限性。首先，没有进一步对骨形态发生蛋白7进行剂量效应实验，评估其对传代培养的人髓核细胞衰老的保护作用；其次，骨形态发生蛋白7的保护作用没有在动物椎间盘退变模型中得到验证，即缺少可靠的动物体内实验证据，因此后续会在动物模型中进行骨形态发生蛋白7作用相关实验内容。总之，此次研究探讨了骨形态发生蛋白7对传代培养的人椎间盘髓核细胞衰老的影响，成功证明了骨形态发生蛋白7通过激活PI3K/Akt通路减轻传代诱导的人椎间盘髓核细胞衰老，为骨形态发生蛋白7在延缓髓核细胞衰老和以此为基础的组织工程学研究方面提供了理论依据，为临床治疗椎间盘退变疾病探索了新的方向。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨形态发生蛋白7抑制椎间盘髓核细胞的凋亡

Bone morphogenetic protein 7 inhibits apoptosis of nucleus pulposus cells

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