虎杖苷对小鼠腰椎间盘退变髓核细胞凋亡及SIRT1/mTOR通路的影响

doi:10.12307/2021.290

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (35): 5619-5625.doi: 10.12307/2021.290

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虎杖苷对小鼠腰椎间盘退变髓核细胞凋亡及SIRT1/mTOR通路的影响

左斌，夏晓枫，车彪，邹凯，唐家国

长江航运总医院骨外科，湖北省武汉市 430010

收稿日期:2020-11-24 修回日期:2020-12-31 接受日期:2021-01-23 出版日期:2021-12-18 发布日期:2021-08-03
通讯作者: 夏晓枫，主治医师，长江航运总医院骨外科，湖北省武汉市 430010
作者简介:左斌，男，1982年生，湖北省武汉市人，汉族，2005年咸宁医学院毕业，主治医师，主要从事关节及脊柱基础与临床研究
基金资助:
湖北省卫生健康委员会联合基金立项项目(WJ2019H388)，项目负责人：唐家国

Polydatin effects on apoptosis of nucleus pulposus cells and SIRT1/mTOR pathway in mice with lumbar disc degeneration

Zuo Bin, Xia Xiaofeng, Che Biao, Zou Kai, Tang Jiaguo

Department of Orthopedics, General Hospital of the Yangtze River Shipping, Wuhan 430010, Hubei Province, China

Received:2020-11-24 Revised:2020-12-31 Accepted:2021-01-23 Online:2021-12-18 Published:2021-08-03
Contact: Xia Xiaofeng, Attending physician, Department of Orthopedics, General Hospital of the Yangtze River Shipping, Wuhan 430010, Hubei Province, China
About author:Zuo Bin, Attending physician, Department of Orthopedics, General Hospital of the Yangtze River Shipping, Wuhan 430010, Hubei Province, China
Supported by:
the Joint Fund Project of Hubei Provincial Health Commission, No. WJ2019H388 (to TJG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
髓核：是由软骨细胞及蛋白多糖黏液样基质构成的弹性冻胶物质，位于两软骨板与纤维环之间，为椎间盘结构的一部分，具有平衡应力、吸收传递外力震荡、支撑椎体等作用，其中老年人髓核中的蛋白多糖解聚增多，水分减少，较易发生椎间盘退变等疾病。
虎杖苷：又称为白藜芦醇苷，分子式为C20H22O8，是提取于中国传统中药虎杖的干燥根茎中的天然活性成分，为芪类有机化合物，具有降血脂、抗血栓、抗休克、镇咳、改善微循环、防治脑缺血、抑制心肌细胞收缩等作用。
背景：椎间盘退变常会引发腰背痛、肩颈痛等，与椎间盘退变髓核细胞的凋亡、炎症及氧化应激反应联系密切，虎杖苷是虎杖的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等生物活性。
目的：探讨虎杖苷对小鼠腰椎间盘退变髓核细胞凋亡及沉默信息调节因子1(silence information regulator 1，SIRT1)/哺乳动物雷帕毒素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路的影响。
方法：采用胰蛋白酶分离培养原代小鼠髓核细胞，采用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色对髓核细胞进行鉴定并检测虎杖苷处理后的细胞毒性。将髓核细胞随机分为5组，空白组、模型组、虎杖苷低、中、高剂量组(分别为虎杖苷10，25，50 mg/L)。除空白组正常培养，其余各组均用白细胞介素1β诱导髓核细胞退变模型，并按照各组给药剂量进行培养；流式细胞仪检测各组髓核细胞凋亡情况，酶联免疫吸附(ELISA)法测定各组髓核细胞氧化应激因子及炎症因子表达水平；蛋白免疫印迹法检测髓核细胞凋亡相关蛋白及SIRT1/mTOR信号通路相关蛋白表达。研究经长江航运总医院伦理委员会批准同意，批准号：L20200059。
结果与结论：①用胰蛋白酶成功分离较纯的小鼠腰椎间盘髓核细胞；②与空白组相比，模型组小鼠腰椎间盘髓核细胞凋亡率、半胱氨酸蛋白酶3、Bax蛋白、丙二醛、乳酸脱氢酶、白细胞介素6、诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子α表达水平显著升高，虎杖苷各剂量组上述各指标较模型组显著降低；与空白组相比，模型组Bcl-2蛋白、超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽及SIRT1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、mTOR蛋白表达水平显著降低(P < 0.05)；虎杖苷各剂量组上述各指标较模型组显著升高(P < 0.05)；虎杖苷各剂量组之间呈现一定的剂量依赖效应，其中高剂量组效果较优；③结果表明，虎杖苷能显著减轻由白细胞介素1β引起的髓核细胞凋亡、炎症、氧化应激反应，可能是通过激活SIRT1/mTOR通路实现的。
https://orcid.org/0000-0001-6399-4047 (左斌)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 虎杖苷, 腰椎间盘退变, 髓核细胞, 沉默信息调节因子1, 哺乳动物雷帕毒素靶蛋白

Abstract: BACKGROUND: Intervertebral disc degeneration often causes low back pain, shoulder and neck pain in the elderly, which is closely related to the apoptosis, inflammation and oxidative stress of nucleus pulposus cells in intervertebral disc degeneration. Polydatin is the main active component of Polygonum cuspidatum, which has anti-inflammatory, antioxidant and other biological activities.
OBJECTIVE: To investigate the effects of polydatin on apoptosis of nucleus pulposus cells and silent information regulator 1 (SIRT1)/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway in mice with intervertebral disc degeneration.
METHODS: Primary mouse nucleus pulposus cells were isolated and cultured by trypsin. Cell identification and cytotoxicity measurement were conducted by toluidine blue staining and type II collagen immunocytochemistry staining. The nucleus pulposus cells were randomly divided into five groups: blank group, model group, low-, middle-, and high-dose polydatin groups (10, 25, and 50 mg/L). The blank group was normally cultured; in addition, the other groups were induced by interleukin-1β to build the degenerative model of nucleus pulposus cells, followed by cultured with different doses of polydatin. Cell apoptosis in each group was detected by flow cytometry. The expression levels of oxidative stress factors and inflammatory factors were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The expression levels of apoptosis related proteins and SIRT1/mTOR signaling pathway related proteins in nucleus pulposus cells were detected by western blot method. The study protocol was ethically approved by the Ethics Committee of General Hospital of the Yangtze River Shipping with an approval No. L20200059.
RESULTS AND CONCLUSION: The nucleus pulposus cells were successfully isolated and purified by trypsin. Compared with those in the blank group, the apoptotic rate of nucleus pulposus cells, the expression of Caspase-3 and Bax proteins, the expression levels of malondialdehyde, lactate dehydrogenase, interleukin-6, inducible nitric oxide synthase, and tumor necrosis factor α were significantly higher in the model group. Compared with the model group, these indexes were significantly decreased in the polydatin groups. Compared with the blank group, the model group showed a significant reduction in the expression levels of Bcl-2 protein, superoxide dismutase, reduced glutathione, SIRT1, phosphorylated PI3K/phosphatidylinositol-3-kinase, phosphorylated Akt/protein kinase B and mTOR protein (P < 0.05), and the polydatin groups had a significant increase in the above-mentioned indexes in a dose-dependent manner (P < 0.05). To conclude, polydatin can significantly reduce the apoptosis, inflammation and oxidative stress of nucleus pulposus cells induced by interleukin-1β, which may be achieved by activating the SIRT1/mTOR pathway.

Key words: polydatin, lumbar disc degeneration, nucleus pulposus cells, silent information regulator 1, mammalian target of rapamycin

中图分类号:

左斌, 夏晓枫, 车彪, 邹凯, 唐家国. 虎杖苷对小鼠腰椎间盘退变髓核细胞凋亡及SIRT1/mTOR通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5619-5625.

Zuo Bin, Xia Xiaofeng, Che Biao, Zou Kai, Tang Jiaguo. Polydatin effects on apoptosis of nucleus pulposus cells and SIRT1/mTOR pathway in mice with lumbar disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(35): 5619-5625.

图/表（结果） 9

2.1 小鼠腰椎间盘髓核细胞鉴定及形态学观察结果显微镜下观察到小鼠腰椎间盘髓核细胞形态一致，大多呈现三角形、多角形、长梭形，细胞呈现旋涡状生长，传代后生长速度较快，细胞轮廓清晰；髓核细胞经甲苯胺蓝染色后，细胞质被染成天蓝色，且越靠近细胞核染色越深；Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色呈现明显棕黄色，且越接近细胞核染色越深；髓核细胞是特殊类型的软骨细胞，结果显示其与软骨细胞形态特点相似，表明髓核细胞分离成功。见图1。

2.2 虎杖苷对髓核细胞毒性比较结果与0 mg/L虎杖苷组相比，5，10，25，50 mg/L的虎杖苷对小鼠腰椎间盘髓核细胞无毒害作用(P > 0.05)，100，200，400 mg/L的虎杖苷显著降低了髓核细胞存活率(P < 0.05)。见表1。

2.3 虎杖苷对小鼠腰椎间盘退变髓核细胞凋亡的影响与空白组相比，模型组髓核细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)，Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高(P < 0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P < 0.05)；与模型组相比，虎杖苷各剂量组髓核细胞凋亡率显著降低(P < 0.05)，Caspase-3、Bax蛋白表达显著降低(P < 0.05)，Bcl-2蛋白表达显著升高(P < 0.05)，且呈现一定的剂量效应关系，其中高剂量组较优。见表2，图2，3。

2.4 虎杖苷对小鼠腰椎间盘退变髓核细胞氧化应激因子的影响与空白组相比，模型组小鼠腰椎间盘退变髓核细胞超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽表达水平均显著降低(P < 0.05)，丙二醛、乳酸脱氢酶表达水平显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，虎杖苷各剂量组髓核细胞超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽表达水平均显著升高(P < 0.05)，丙二醛、乳酸脱氢酶表达水平显著降低(P < 0.05)，且呈现一定的剂量效应关系，其中高剂量组较优。见表3。

2.5 虎杖苷对小鼠腰椎间盘退变髓核细胞炎症因子的影响与空白组相比，模型组小鼠腰椎间盘退变髓核细胞炎症因子白细胞介素6、诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子α表达水平均显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，虎杖苷各剂量组髓核细胞炎症因子表达水平显著降低(P < 0.05)，且呈现一定的剂量效应关系，其中高剂量组较优。见表4。

2.6 虎杖苷对小鼠腰椎间盘退变髓核细胞SIRT1/mTOR通路蛋白表达的影响与空白组相比，模型组小鼠腰椎间盘退变髓核细胞SIRT1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、mTOR蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)；与模型组相比，虎杖苷各剂量组小鼠腰椎间盘退变髓核细胞SIRT1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、mTOR蛋白表达水平升高(P < 0.05)，呈剂量依赖性，其中高剂量组效果较优。见表5，图4。

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引言

材料方法

1.1 设计离体原代细胞模型，分子机制数据多组间比较单因素方差分析，两组间比较SNK-q检验。
1.2 时间及地点实验于2020年6至7月在长江航运总医院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6只健康约8周龄BALB/c雄性小鼠购自河南省实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(豫)2017-0001，动物使用许可证号：SYXK(豫)2017-0009，动物质量合格证号：HNHG2020031503，小鼠体质量20-30 g。所有小鼠均在长江航运总医院动物房中饲养，自由进食、进水，自然光照，相对湿度50%，温度25 ℃，保持动物房环境及鼠笼清洁、透气，每天更新食物及饮用水，每周清洁1次鼠笼，均适应性喂养7 d。研究经长江航运总医院伦理委员会批准同意，批准号：L20200059。
1.3.2 主要试剂及仪器虎杖苷(原料药，纯度：HPLC≥98%，批号：IP0770)购自北京索莱宝科技有限公司；白细胞介素1β(批号：407617)购自美国Sigma公司；DMEM/F-12培养液(批号：MA0214)购自大连美仑生物技术有限公司；DAB显色试剂盒、苏木素染色试剂盒、甲苯胺蓝染液、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、胰蛋白酶、青-链霉素、超氧化物歧化酶、丙二醛、还原型谷胱甘肽、乳酸脱氢酶、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒、磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS)、噻唑蓝(MTT)试剂盒(批号分别为：DA1010，G1120，G3668，T8200，T1300，P7630，BC0170，BC0025，BC1175，BC0685，SEKM-0007，SEKM-0034，P1020，11011-8611，M1020)均购自北京索莱宝科技有限公司；诱导型一氧化氮合酶ELISA试剂盒(批号：ml057773)购自上海酶联生物科技有限公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(批号：BD556547)购自杭州昊鑫生物科技有限公司；兔源Ⅱ型胶原多克隆抗体、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关x蛋白(Bax)、SIRT1、mTOR、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG二抗(批号分别为：ab188570，ab13847，ab32503，ab32124，ab189494，ab134903，ab140307，ab8805，ab150077，ab30112，ab51347，ab190064)均购自Abcam公司；RIPA裂解液、蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、硝酸纤维素膜、TBST缓冲液(批号分别为：SF13064、P0027、P0011、K5019、P3017)均购自上海碧云天公司等。
细胞培养箱(型号：MCO-15AC，日本SANYO公司)；倒置显微镜(型号：TS100，日本Nikon公司)；细胞计数器(型号：NC-100，丹麦Chemimetec公司)；流式细胞仪(型号：Accuri C6，美国BD公司)；酶标仪(型号XElx800，美国Perkin Elmer公司)；蛋白电泳仪、半干转膜仪(型号1659001、Trans-Blot SD，美国Bio-Rad公司)；凝胶成像仪(型号：GIS-500，杭州米欧仪器有限公司)。
1.4 实验方法

1.4.1 髓核细胞分离、培养及传代髓核细胞的分离培养参考文献[11-12]，6只健康小鼠麻醉后处死，体表消毒并PBS冲洗，无菌环境下分离小鼠胸腰段脊柱并去除周围多余的肌肉、神经等组织，无菌手术刀划开纤维环获取冻胶状髓核组织，用PBS冲洗，将髓核组织剪成小碎块并移入无菌离心管中，胰酶消化后DMEM/F-12完全培养液终止消化，然后离心去除上清液，用胰蛋白酶继续消化细胞6 h，用DMEM/F-12完全培养液冲洗组织块3遍后移入细胞培养瓶中，加入含有体积分数10%FBS及1%青-链霉素的DMEM/F-12完全培养液，于细胞培养箱(37 ℃、体积分数5%CO2)中培养。 3 d后去除漂浮组织块并更新培养液，每3 d更换1次培养液，观察细胞贴壁及生长情况，当细胞铺满瓶底、融合率达到80%-90%时可进行消化传代。用胰蛋白酶进行消化，消化至细胞变圆、即将从瓶壁脱落时停止消化并继续培养。

1.4.2 小鼠腰椎间盘髓核细胞鉴定及形态学观察
(1)细胞爬片制备：将培养至第2代的细胞经0.25%胰蛋白酶消化后收集于15 mL离心管中，离心后弃去上清液并加入DMEM/F-12完全培养液重悬细胞，按照1×105个/孔的密度接种于放有盖玻片的6孔板中制备髓核细胞爬片。
(2)甲苯胺蓝染色：细胞爬片经PBS冲洗后用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3次后用1%甲苯胺蓝染色 10 min，双蒸水冲洗后，中性树脂封固，于光镜下观察。
(3)Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色：细胞爬片经多聚甲醛固定、PBS冲洗，Triton X-100(0.5%)通透化处理15 min，体积分数3%过氧化氢室温孵育15 min，PBS冲洗3次， 0.01 mol/L柠檬酸缓冲液(95 ℃)中修复15 min，冷却后用PBS冲洗3次，用体积分数5%山羊血清封闭30 min(37 ℃)，加入兔抗鼠Ⅱ型胶原多克隆抗体(1∶50)后过夜(4 ℃)，PBS冲洗3次后滴加生物素标记二抗，室温孵育30 min后PBS冲洗3次，DAB显色5 min后进行苏木素复染，中性树脂封固，于光镜下观察。
1.4.3 虎杖苷干预后髓核细胞毒性的检测取对数生长期的髓核细胞，接种于48孔培养板中(1×105个/孔)，分别用0，5，10，25，50，100，200，400 mg/L的虎杖苷处理24 h后吸去上清[13]，用MTT法检测虎杖苷处理后的髓核细胞毒性，每孔加入90 μL新鲜培养液及10 μL MTT溶液，培养4 h后去除上清液，加入110 μL Formazan溶液，摇匀后于酶标仪中测定吸光度值，同时设置空白孔(含有培养液、MTT、Formazan)及对照孔(细胞、培养液、MTT、Formazan)，按照公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)=(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)×100%，具体操作按照MTT试剂盒中说明书的要求进行检测。每组5个复孔。
1.4.4 小鼠腰椎间盘退变髓核细胞模型构建及分组将培养至第3代的髓核细胞接种于6孔板(1×105个/孔)中并按随机数表法分为5组，空白组、模型组、虎杖苷低剂量组(10 mg/L)、虎杖苷中剂量组(25 mg/L)、虎杖苷高剂量组(50 mg/L)。小鼠腰椎间盘退变髓核细胞模型制备参考文献[14]，模型组及虎杖苷各剂量组分别加入等量含10 μg/L的白细胞介素1β培养基培养24 h[15]，弃去含有白细胞介素1β的培养基。虎杖苷各剂量组分别对应加入含10，25，50 mg/L的虎杖苷培养基继续培养48 h；模型组加入等量含体积分数10%FBS的DMEM/F-12完全培养液；空白组进行常规培养。10 μg/L的白细胞介素1β 10，25，50 mg/L的虎杖苷均用含体积分数10%FBS的DMEM/F-12完全培养液制备。
1.4.5 髓核细胞凋亡情况检测参照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒中的步骤和参考文献[16]测定各组髓核细胞的凋亡情况。实验分为5组：空白组、模型组、虎杖苷低剂量组(10 mg/L)、虎杖苷中剂量组(25 mg/L)、虎杖苷高剂量组 (50 mg/L)。经过含白细胞介素1β及虎杖苷处理过的各组细胞加入胰蛋白酶进行消化处理，轻轻吹打可使贴壁细胞吹打下来时吸除消化液，用预冷的PBS洗涤细胞，用1×Binding Buffer悬浮细胞并调整细胞浓度为1×109 L-1，收集100 μL细胞液于1.5 mL EP管中，加入5 μL Annexin V-FITC，混匀后室温避光孵育10 min，加入5 μL PI溶液染色5 min，加200 μL的1×Binding Buffer后用流式细胞仪观察并分析细胞凋亡情况。每组5个复孔。
1.4.6 小鼠髓核细胞氧化应激因子及炎症因子表达检测用PBS洗涤待测细胞后调整浓度至1×108 L-1左右，通过反复冻融使细胞破坏并释放细胞内成分，离心取上清液，参考白细胞介素6、诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子α、超氧化物歧化酶、丙二醛、还原型谷胱甘肽、乳酸脱氢酶相关试剂盒中的要求测定各组髓核细胞中氧化应激因子的表达水平。每组5个复孔。
1.4.7 小鼠髓核细胞凋亡相关因子、SIRT1/mTOR通路相关蛋白表达检测采用蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡相关因子及SIRT1/mTOR通路相关蛋白的表达。实验分为5组：空白组、模型组、虎杖苷低剂量组(10 mg/L)、虎杖苷中剂量组(25 mg/L)、虎杖苷高剂量组(50 mg/L)。经过含白细胞介素1β及虎杖苷处理过的各组细胞，吸去培养基，置于灭菌离心管中，加入RIPA裂解液于冰中裂解30 min，采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，取上清至无菌离心管中，参照BCA蛋白定量试剂盒的要求测定其中总蛋白含量，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量蛋白质后转移至硝酸纤维素膜上(湿转法)，5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下添加Caspase-3(1∶1 000)、Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、SIRT1(1∶500)、p-PI3K(1∶500)、PI3K(1∶500)、p-Akt(1∶500)、Akt(1∶500)、mTOR(1∶500)、GAPDH(1∶500)一抗孵育过夜，用TBST缓冲液洗涤3次后添加二抗(1∶3 000)常温下孵育2 h。采用凝胶成像仪对Caspase-3、Bax、Bcl-2、SIRT1、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、mTOR蛋白水平进行半定量分析。
1.5 主要观察指标 ①小鼠腰椎间盘髓核细胞鉴定及形态学观察；②虎杖苷干预后髓核细胞毒性比较；③小鼠腰椎间盘退变髓核细胞凋亡情况；④小鼠腰椎间盘退变髓核细胞氧化应激因子和炎症因子的表达；⑤小鼠腰椎间盘退变髓核细胞SIRT1/mTOR通路蛋白的表达。
1.6 统计学分析以SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以x±s表示，多组间比较进行单因素方差分析，进一步两组间比较行SNK-q检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

腰椎间盘退变机制复杂，常伴有下腰痛、急性下肢神经根型疼痛等不良症状，严重影响患者生活质量，多项研究表明机体炎症反应、氧化应激反应、髓核细胞退变等均与腰椎间盘退变联系密切，因此探究具有抑制炎症反应及髓核细胞退变的新型药物仍是近年来的研究热点[17-21]。白细胞介素1β是促炎性细胞因子白细胞介素1家族成员，与腰椎间盘髓核细胞增殖、衰老、自噬等生物学行为联系密切，资料显示高浓度的白细胞介素1β能诱导一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子α等炎症递质及炎症因子的表达，促进髓核细胞的凋亡，进而加速腰椎间盘退变进程[22-25]。史锐等[15]用白细胞介素1β处理髓核细胞构建腰椎间盘退变细胞模型，发现白细胞介素1β能显著诱导髓核细胞凋亡，加剧髓核细胞的炎症反应及氧化应激反应。此次研究结果显示，与空白组相比，模型组髓核细胞凋亡率、凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bax)水平、炎症因子(白细胞介素6、诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子α)表达均显著升高，抗氧化物质(超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽)表达显著降低，氧化产物(丙二醛、乳酸脱氢酶)水平显著升高，与史锐等[15]研究结果类似，提示白细胞介素1β可诱导小鼠髓核细胞发生炎症及氧化应激反应，进而促进髓核细胞的凋亡，表明白细胞介素1β诱导小鼠椎间盘髓核细胞退变模型构建成功，可用于后续研究。
随着社会老龄化人口加剧，肩颈痛、腰腿痛等疾病发病率显著增高，椎间盘退变是肩颈痛、腰腿痛等疾病的主要病因，腰椎间盘退变过程机制复杂，临床主要通过椎间盘切除术、脊柱融合、保守治疗等方法缓解腰腿痛等疾病，尚无理想的治疗方案[26-29]。资料显示椎间盘氧化还原反应的失衡与椎间盘退变发病密切相关，机体内抗氧化物质减少，氧化产物得不到及时清理，会产生较多的氧自由基，会对脂质、蛋白质等造成氧化损伤，进而影响细胞功能，而氧化应激的产物会积累在腰椎间盘组织中，进而引起腰椎间盘病变[30-31]，因此探究具有抗氧化作用的新型药物对于治疗椎间盘退变具有重要意义。
植物虎杖具有降糖降脂、抗炎、止血等功效，常用于治疗黄疸、胁痛等疾病，虎杖苷为虎杖的主要活性成分之一，为白色针状结晶，具有糖代谢、脂代谢、抗炎、抗氧化等多种生物活性[32]，王曌华等[33]研究发现虎杖苷能显著抑制严重烧伤小鼠氧化应激及炎症反应，缓解严重烧伤小鼠的症状。QIAO等[34]研究发现虎杖苷能显著缓解过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞的氧化应激损伤，并提高细胞中还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶的含量。此次研究结果显示，与模型组相比，经过虎杖苷处理的小鼠椎间盘退变髓核细胞的凋亡率显著降低，白细胞介素6、诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子α炎症因子水平、丙二醛、乳酸脱氢酶水平均显著下降，超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽水平显著升高，表明虎杖苷具有抑制椎间盘退变髓核细胞凋亡、炎性反应及氧化应激反应的作用，推测其可能具有一定的缓解椎间盘退变临床症状的作用，但其作用机制仍不清晰。
SIRT1是sirtuins家族成员，在脂肪、大脑、心脏等组织中均有表达，参与细胞的增殖、新陈代谢、氧化应激、炎症等生理过程，在糖尿病、骨关节炎等疾病的发展过程中发挥重要作用[35-37]。SUN等[36]研究发现SIRT1可通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路参与大鼠软骨细胞的增殖凋亡过程。翟铁等[38]研究发现过表达的SIRT1可升高PI3K和Akt的磷酸化水平，进而抑制由高糖诱导的心肌细胞凋亡，并降低其氧化应激反应。mTOR是Akt下游的一个重要靶点，可参与相关蛋白的表达及基因的转录，进而影响炎症、氧化应激、细胞自噬凋亡等生物学活动[39-40]，过表达的SIRT1通过受体酪氨酸激酶激活PI3K，活化的PI3K可促进Akt发生磷酸化，激活mTOR，进而抑制机体氧化应激、炎症反应[41]。此次研究结果显示，与空白组相比，模型组小鼠腰椎间盘髓核细胞SIRT1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、mTOR蛋白表达水平显著降低，经虎杖苷处理过后，SIRT1/mTOR通路相关蛋白表达水平均显著升高，表明虎杖苷具有一定的激活SIRT1/mTOR信号通路的作用，可能与其具有的抑制腰椎间盘退变髓核细胞凋亡、炎症及氧化应激反应有关。
综上所述，虎杖苷具有抑制小鼠腰椎间盘退变髓核细胞凋亡、炎症反应及氧化应激反应的作用，可能通过激活SIRT1/mTOR信号通路来发挥作用，文章初步探讨虎杖苷对小鼠腰椎间盘退变髓核细胞的影响及其可能作用机制，并未用相关通路抑制剂进行对比实验，且未设置相应的动物实验进一步验证，因此仍需深入研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

虎杖苷对小鼠腰椎间盘退变髓核细胞凋亡及SIRT1/mTOR通路的影响

Polydatin effects on apoptosis of nucleus pulposus cells and SIRT1/mTOR pathway in mice with lumbar disc degeneration

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