长链非编码RNA MEG3 对大鼠椎间盘髓核细胞增殖及凋亡的调控

doi:10.12307/2021.118

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
长链非编码RNA：长度>200 nt，缺少或无开放阅读编码框，不一定都带多聚腺苷酸尾，数量上远低于编码蛋白基因，与编码蛋白基因相比，具有更高的组织器官特异性，其可充当miRNA的竞争性RNA而调控下游基因表达从而参与多种疾病发生及发展过程。

背景：椎间盘髓核细胞损伤是引起椎间盘退行性病变的重要原因之一，长链非编码RNA在椎间盘退行性病变中的作用机制尚未阐明。
目的：探讨长链非编码RNA MEG3对大鼠椎间盘髓核细胞增殖、凋亡的影响及其对磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，Akt)信号通路的调控作用。
方法：原代培养大鼠椎间盘髓核细胞，使用白细胞介素1β处理细胞建立模型，实验设置对照组、白细胞介素1β组、白细胞介素1β+pcDNA组、白细胞介素1β+pcDNA-MEG3组、白细胞介素1β+pcDNA-MEG3+LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂)组。实时荧光定量PCR检测长链非编码RNA MEG3的表达量；MTT法检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞凋亡率；蛋白免疫印迹法检测增殖标记蛋白Ki-67、增殖细胞核抗原、Bax、活化半胱氨酸蛋白酶3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表达量。
结果与结论：①与对照组比较，白细胞介素1β组细胞中MEG3的表达量显著降低(P < 0.05)，细胞活力显著降低(P < 0.05)，细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)，Ki-67、增殖细胞核抗原、p-PI3K、p-Akt蛋白水平显著降低(P < 0.05)，Bax、活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白水平显著升高(P < 0.05)；②与白细胞介素1β+pcDNA组比较，白细胞介素1β+pcDNA-MEG3组细胞活力显著升高(P < 0.05)，Ki-67、增殖细胞核抗原、p-PI3K、p-Akt蛋白水平显著升高(P < 0.05)，细胞凋亡率显著降低(P < 0.05)，Bax、活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白水平显著降低(P < 0.05)；③与白细胞介素1β+pcDNA-MEG3组比较，白细胞介素1β+pcDNA-MEG3+LY294002组细胞活力显著降低(P < 0.05)，细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)，Ki-67、增殖细胞核抗原蛋白水平显著降低(P < 0.05)，Bax、活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白水平显著升高(P < 0.05)；④提示MEG3过表达可能通过激活PI3K/Akt信号通路从而促进白细胞介素1β诱导的大鼠椎间盘髓核细胞增殖，并抑制细胞凋亡。

https://orcid.org/0000-0002-1322-4834 ( 程宁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 长链非编码RNA MEG3, PI3K/Akt, 大鼠, 椎间盘, 髓核细胞, 增殖, 凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Injury of nucleus pulposus cells in the intervertebral disc is one of the important causes of degenerative disc disease. The mechanism of longchain non-coding RNA (LncRNA) in intervertebral disc degeneration has not been clarified.

OBJECTIVE: To investigate the effect of LncRNA MEG3 on the proliferation and apoptosis of nucleus pulposus cells in rat intervertebral discs and its regulatory effect on phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) signaling pathway.

METHODS: Primary cultured rat nucleus pulposus cells were treated with interleukin 1β (IL-1β) to establish a cell model. There were five groups in this experiment, including control group, IL-1β group, IL-1β+pcDNA group, IL-1β+pcDNA-MEG3 group, and IL-1β+pcDNA-MEG3+LY294002 group. Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of MEG3. MTT was used to measure cell proliferation. Flow cytometry was used to detect apoptosis rate.Western blot was used to detect the expression of Ki-67, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), Bax, Cleaved Caspase-3, PI3K, p-PI3K, Akt, and p-Akt.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, in the IL-1β group, the expression of MEG3 in the cells was significantly reduced (P < 0.05), the cell viability was significantly reduced (P < 0.05), the apoptosis rate was significantly increased (P < 0.05), the levels of Ki-67, PCNA, p-PI3K, and p-Akt proteins were significantly reduced (P < 0.05), and the levels of Bax and Cleaved Caspase-3 proteins were significantly increased (P<0.05). Compared with the IL-1β+pcDNA group, in the IL-1β+pcDNA-MEG3 group, the cell viability was significantly increased (P < 0.05), the levels of Ki-67, PCNA, p-PI3K, and p-Akt proteins were significantly increased (P < 0.05), the apoptosis rate was significantly reduced (P < 0.05), and the levels of Bax and Cleaved Caspase-3 proteins were significantly reduced (P < 0.05). Compared with the IL-1β+pcDNA-MEG3 group, in the IL-1β+pcDNA-MEG3+LY294002 group, the cell viability was significantly reduced (P < 0.05), the apoptosis rate was significantly increased (P < 0.05), the levels of Ki-67 and PCNA proteins were significantly reduced (P < 0.05), and the levels of Bax and Cleaved Caspase-3 proteins were significantly increased (P < 0.05). To conclude, overexpression of MEG3 may promote IL-1β-induced proliferation and inhibit apoptosis in rat nucleus pulposus cells by activating the PI3K/Akt signaling pathway.

Key words: LncRNA MEG3, PI3K/Akt signaling pathway, rat, intervertebral disc, nucleus pulposus cells, proliferation, apoptosis

中图分类号:

程宁, 张志忠. 长链非编码RNA MEG3 对大鼠椎间盘髓核细胞增殖及凋亡的调控[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(26): 4106-4111.

Cheng Ning, Zhang Zhizhong. Regulatory effects of LncRNA MEG3 on the proliferation and apoptosis of nucleus pulposus cells in rat intervertebral disc[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(26): 4106-4111.

图/表（结果） 7

2.1 白细胞介素1β诱导的大鼠椎间盘髓核细胞中MEG3的表达量
采用实时荧光定量PCR检测白细胞介素1β诱导的大鼠椎间盘髓核细胞中MEG3的表达量，结果显示与对照组（1.02±0.20）比较，白细胞介素1β组细胞中MEG3的表达量（0.63±0.21）显著降低（t=4.034，P＜0.05）。 2.2 MEG3过表达对白细胞介素1β诱导的大鼠椎间盘髓核细胞增殖的影响将pcDNA-MEG3转染至大鼠椎间盘髓核细胞后，结果显示与对照组比较，白细胞介素1β组细胞活力显著降低（P＜0.05），Ki-67、增殖细胞核抗原蛋白水平显著降低（P＜0.05）；与白细胞介素1β+pcDNA组比较，白细胞介素1β+pcDNA-MEG3组细胞活力显著升高（P＜0.05），Ki-67、增殖细胞核抗原蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图1。

2.3 MEG3过表达对白细胞介素1β诱导的大鼠椎间盘髓核细胞凋亡的影响
将pcDNA-MEG3转染至大鼠椎间盘髓核细胞后，结果显示与对照组比较，白细胞介素1β组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），Bax、活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与白细胞介素1β+pcDNA组比较，白细胞介素1β+pcDNA-MEG3组细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），Bax、活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图2及表1。

2.4 MEG3过表达对白细胞介素1β诱导的大鼠椎间盘髓核细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响
将pcDNA-MEG3转染至大鼠椎间盘髓核细胞后，采用Western blot法检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达量，结果显示与对照组比较，白细胞介素1β组p-PI3K、p-Akt蛋白水平显著降低（P＜0.05）；与白细胞介素1β+pcDNA组比较，白细胞介素1β+pcDNA-MEG3组p-PI3K、p-Akt蛋白水平显著升高（P＜0.05），对照组、白细胞介素1β组、白细胞介素1β+pcDNA组、白细胞介素1β+pcDNA-MEG3组间PI3K、Akt蛋白水平比较差异无显著性意义（P＞0.05），见图3及表2。

2.5 添加PI3K/Akt信号通路抑制剂对白细胞介素1β诱导的大鼠椎间盘髓核细胞增殖及凋亡的影响
添加PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002后，结果显示与白细胞介素1β+pcDNA-MEG3组比较，白细胞介素1β+pcDNA-MEG3+LY294002组细胞活力显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），Ki-67、增殖细胞核抗原蛋白水平显著降低（P＜0.05），Bax、活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图4及表3。

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引言

材料方法

1.1设计：体外细胞学实验。
1.2时间及地点：于2017年12月至2019年10月在安阳职业技术学院基础医学部完成。
1.3材料：
1.3.1实验动物：10只SPF级SD雄性大鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，1月龄，动物许可证号：SCXK（湘）：2016-0003。
1.3.2试剂：DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；Trizol、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；白细胞介素1β购自美国Sigma公司；PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002购自美国Selleckchem公司；pcDNA3.1购自上海远慕生物科技有限公司；MTT、二甲基亚砜、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶细胞凋亡试剂盒购自美国Sigma公司；RIPA裂解液购自北京百奥莱博科技有限公司；BCA蛋白定量检测试剂盒、ECL购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗鼠增殖标记蛋白Ki-67、增殖细胞核抗原抗体购自美国CST公司；兔抗鼠Bax、活化半胱氨酸蛋白酶3抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗鼠PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自武汉艾美捷科技有限公司。
1.4方法
1.4.1 椎间盘髓核细胞鉴定
(1)采用10%水合氯醛腹腔注射处死大鼠，常规消毒，取出整个椎体，去除椎弓及脊髓，沿着上下终板取出椎间盘，置于显微镜下取出髓核，使用Hank’s液清洗髓核，剪碎（1 mm3），加入0.25%胰蛋白酶，消化20 min，4 ℃条件下经3 000 r/min转速离心5 min，弃上清，加入含有体积分数10%胎牛血清的培养液，4 ℃条件下经1000 r/min转速离心5 min，弃上清，加入0.02%Ⅱ型胶原酶，室温消化4 h，使用200目滤网过滤，4 ℃条件下经3000 r/min转速离心5 min，弃上清，重复3次，调整细胞浓度为2×107 L-1，接种于培养瓶（25 mm×25 mm），加入培养液，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱培养，每隔2 d更换培养液，待原代细胞形成单层进行传代培养[11]。
（2）将盖玻片提前泡酸，洗净后晾干，再用无水乙醇浸泡4 h以上，双蒸水冲洗干净后烘干，高压消毒后备用。
（3）将生长状态良好的第2代髓核细胞按照3×108 L-1的浓度直接接种于放有盖玻片的六孔板中，贴壁生长5d后（此时为第3代髓核细胞），用40 g/L多聚甲醛 PBS溶液固定20min 后，PBS溶液清洗2遍，于-20℃冷冻保存备用。
（4）Ⅱ型胶原染色：将处理好的消毒盖玻片放入六孔板中，细胞以3×108 L-1接种于六孔板中，每孔2mL，经过一定时间培养细胞接近融合，取出盖玻片，经D-Hanks液洗后，
用40 g/L多聚甲醛固定30min。体积分数0.3% H2O2室温孵育10 min，蒸馏水洗涤3次，3 min/次。加入兔抗人Ⅱ型胶原多克隆抗体；4 ℃冰箱过夜或 37 ℃ 2 h，PBS 洗涤3次，3 min/次，加入二抗（生物素化山羊抗兔 IgG，1:400），37 ℃ 40 min，PBS洗涤3次，3min/次。滴加试剂SABC，20-37 ℃ 20 min。PBS洗5 min×4次。DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1 mL蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片；室温显色，镜下控制反应时间，一般在5-30 min之间。蒸馏水洗涤，苏木精轻度复染，脱水、透明、常规封固。结果判断：呈现棕黄色为阳性，无着色为阴性。
1.4.2实验分组处理
取第3代椎间盘髓核细胞（2.5×108 L-1）接种于96孔板，加入含有质量浓度为10 μg/L的白细胞介素1β处理24 h[12]，记作白细胞介素1β组，同时将正常培养的细胞作为对照组。使用不含胎牛血清的细胞培养液与pcDNA、pcDNA-MEG3混合后室温孵育5 min（A液），Lipofectamine 2000转染试剂与不含胎牛血清的细胞培养液充分混合（B液），A液与B液充分混匀后室温孵育20 min后将其加入椎间盘髓核细胞，转染6 h弃上清液后更换含有10 μg/L白细胞介素1β的培养液培养24 h，分别记为白细胞介素1β+pcDNA组、白细胞介素1β+pcDNA-MEG3组。为探究MEG3是否通过调控PI3K/Akt信号通路而影响白细胞介素1β诱导的大鼠椎间盘髓核细胞增殖及凋亡，将pcDNA-MEG3转染至大鼠椎间盘髓核细胞，加入含有浓度为10 μmol/L的LY294002与10 μg/L白细胞介素1β处理24 h[13]，记作白细胞介素1β+pcDNA-MEG3+LY294002组。
1.4.3实时荧光定量PCR检测细胞中MEG3的表达水平
收集各组对数生长期大鼠椎间盘髓核细胞，采用Trizol法提取细胞中的总RNA。应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度，反转录合成cDNA。MEG3正向引物5’-GGGCTTCTGGAATGAGCATG-3’，反向引物5’-TCTATGCCAGATCCTGCCTG-3’；GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，反应条件：95 ℃ 2 min，95℃15s，60℃ 30 s，72 ℃30 s，共40次循环。MEG3以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算MEG3相对表达量。
1.4.4 MTT检测细胞增殖
收集各组对数生长期大鼠椎间盘髓核细胞接种于96孔板（3×104个/孔），每孔加入质量浓度为5 g/L的MTT溶液20 μL，室温孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，室温振荡孵育10 min，应用酶标仪检测波长为490nm处各孔吸光度值（A），计算细胞活力（%）=（实验组A值/对照组A值）×100%。
1.4.5 流式细胞术检测细胞凋亡率
收集各组对数生长期大鼠椎间盘髓核细胞，预冷PBS洗涤，4 ℃条件下经3000 r/min转速离心6 min，加入500 μL结合缓冲液重悬细胞，加入5μL膜联蛋白 V-异硫氰酸荧光素与5μL碘化丙啶，室温孵育10 min，应用FACS Calibur流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。
1.4.6 蛋白免疫印迹（Western blot）检测Ki-67、增殖细胞核抗原、Bax、活化半胱氨酸蛋白酶3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达
收集各组对数生长期大鼠椎间盘髓核细胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃条件下经3000 r/min离心10 min，提取细胞总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度，取蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗稀释液（Ki-67稀释比1:800，增殖细胞核抗原稀释比1:800，Bax稀释比1:1000，活化半胱氨酸蛋白酶3稀释比1:1000，PI3K稀释比1:800，p-PI3K稀释比1:1000，Akt稀释比1:800，p-Akt稀释比1:1000），4 ℃孵育24 h，TBST洗涤，加入二抗（1:5000），室温孵育1 h，TBST洗涤，暗室内曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。
1.6主要观察指标：所有指标检测均取培养48 h后的大鼠椎间盘髓核细胞，采用实时荧光定量PCR细胞中MEG3的表达量；采用MTT法检测MEG3过表达与添加PI3K/Akt信号通路抑制剂对大鼠椎间盘髓核细胞增殖活性的影响；采用流式细胞术检测MEG3过表达与添加PI3K/Akt信号通路抑制剂对大鼠椎间盘髓核细胞凋亡的影响；采用Western blot法检测Ki-67、增殖细胞核抗原、Bax、活化半胱氨酸蛋白酶3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达。
1.7统计学分析采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料以x±s表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有显著性意义。

讨论

多因素引起的髓核细胞凋亡可减少蛋白聚糖及Ⅱ型胶原合成从而加速椎间盘退变过程，局部炎症反应可促进炎性介质的生成从而促进椎间盘退变[14-21]，因而促进髓核细胞增殖及抑制细胞凋亡成为治疗椎间盘退变的关键。
MEG3通过miR-141及AKT/mTOR信号通路而抑制类风湿性关节炎[22]，MEG3通过靶向miR-146a而抑制强直性脊柱炎的炎症反应[23]，抑制MEG3的表达可通过调节miR-181b /肿瘤坏死因子α信号通路而保护肾小管免受缺氧诱导的肾损伤[24]。此次研究结果显示白细胞介素1β处理的大鼠椎间盘髓核细胞中MEG3的表达量显著降低，提示MEG3在椎间盘退变过程中可能发挥重要调控作用。研究表明Ki-67、增殖细胞核抗原表达上调可促进细胞增殖[25-26]，此次研究结果显示白细胞介素1β处理大鼠椎间盘髓核细胞后，细胞活力显著降低，Ki-67、增殖细胞核抗原表达下调；而MEG3过表达后细胞活力显著升高，Ki-67、增殖细胞核抗原表达上调，提示MEG3过表达可促进白细胞介素1β诱导的大鼠椎间盘髓核细胞增殖。研究表明Bax表达上调可促进线粒体释放细胞色素C而激活Caspase级联反应而形成活化半胱氨酸蛋白酶3从而诱导细胞凋亡[27]。此次研究结果显示，白细胞介素1β处理后大鼠椎间盘髓核细胞凋亡率显著升高，Bax、活化半胱氨酸蛋白酶3表达上调，而MEG3过表达细胞凋亡率显著降低，Bax、活化半胱氨酸蛋白酶3表达下调，提示MEG3过表达可抑制白细胞介素1β诱导的大鼠椎间盘髓核细胞凋亡。
PI3K/Akt信号通路激活后PI3K形成p-PI3K，并可促进下游基因Akt激活形成p-Akt，PI3K/Akt信号通路激活可减轻过氧化氢诱导的大鼠髓核间充质干细胞凋亡[28-32]。骨形态发生蛋白2通过激活PI3K/Akt而抑制髓核细胞凋亡从而减轻椎间盘退变[33-40]。既往研究显示PI3K/Akt信号通路在髓核细胞炎症反应、凋亡等过程中发挥重要调控作用[40-44]。此次研究结果显示白细胞介素1β处理后大鼠椎间盘髓核细胞中p-PI3K、p-Akt表达下调，而MEG3过表达后p-PI3K、p-Akt表达上调，提示MEG3过表达可能通过激活PI3K/Akt信号通路从而影响白细胞介素1β诱导的大鼠椎间盘髓核细胞增殖及凋亡。为探究MEG3是否可通过调控PI3K/Akt信号通路而发挥作用，此次研究将pcDNA-MEG3转染至大鼠椎间盘髓核细胞，使用PI3K/Akt信号通路抑制剂与白细胞介素1β共同处理，结果显示细胞活力显著降低，细胞凋亡率显著升高，Ki-67、增殖细胞核抗原表达下调，Bax、活化半胱氨酸蛋白酶3表达上调，提示抑制PI3K/Akt信号通路可降低MEG3过表达对白细胞介素1β诱导的大鼠椎间盘髓核细胞增殖及凋亡的作用。
综上所述，MEG3可促进白细胞介素1β诱导的大鼠椎间盘髓核细胞增殖并抑制细胞凋亡，其作用机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关，可能为进一步揭示大鼠椎间盘髓核细胞增殖及凋亡的分子机制奠定实验基础，并可能为椎间盘退行性病变的治疗提供新方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程