2.1  髓核细胞的培养、鉴定及传代  第1，2，3代髓核细胞生长呈S形，第3-7天呈直线增殖，第8天后细胞停止生长，呈水平线。第5，6代髓核细胞表现为长梭形，胞体增大，生长缓慢，为老化表现，因此实验最好采用第1，2，3代细胞^[9]，见图2。

2.2  各组髓核细胞形态、生长状况及超微结构

2.2.1  各组髓核细胞形态、生长状况  相同作用时间下，所有单纯静水压压力组椎间盘髓核细胞体积均出现缩小，其中0.3 MPa和1 MPa静水压压力下椎间盘髓核细胞体积未表现出明显差异，3 MPa静水压压力下髓核细胞体积缩小最为明显，见图3。在同一静水压压力及作用时间下，压力+中药血清干预组椎间盘髓核细胞形态较常压组、单纯压力干预组更完整，生长状况更好，见图4。

2.2.2  髓核细胞超微结构  在相同作用时间下，常压组椎间盘髓核细胞超微结构完整，所有单纯压力干预组椎间盘髓核细胞主级突起、次级突起结构显示出不同程度的断裂，其中0.3，1 MPa压力干预组次级突起结构断裂，而细胞体两端的主级突起结构则较为完整，压力+中药血清干预组椎间盘髓核细胞的超微结构较单纯压力干预组更完整；3 MPa纯压力干预组椎间盘髓核细胞的主级突起、次级突起均表现出断裂现象，压力+中药血清干预组与单纯压力干预组髓核细胞结构未见明显差异，见图5。相同静水压不同作用时间，各组椎间盘髓核细胞超微结构未表现出明显差异，见图6。

2.2.3  髓核细胞增殖活性  随压力作用时间的延长，0.3，1 MPa压力下髓核细胞增殖活性未表现出明显差异；3 MPa压力下髓核细胞增殖活性总体趋于下降；干预2，6 h时，与0.3 MPa压力组比较，0.3 MPa压力+中药血清组髓核细胞增殖活性显著增加，1，3 MPa压力组分别与1，3 MPa压力+中药血清组比较未见明显差异，见图7。

2.2.4  髓核细胞凋亡变化  在常压、0.3 MPa静水压作用下，随作用时间增加，椎间盘髓核细胞凋亡率无明显差异；而在1，3 MPa静水压压力下椎间盘髓核细胞凋亡率增加。所有压力+中药血清组椎间盘髓核细胞凋亡率均低于单纯压力干预组，见图8，9。

2.2.5  在0.3 MPa静水压下髓核细胞NF-κB p65、Collagen Ⅱ、ADAMTS-4、MMP-13、Caspase-3表达  随作用时间的增加，Collagen Ⅱ、Caspase-3表达减少，NF-κB p65、ADAMTS-4、MMP-13表达增加，压力+中药血清干预组较单纯压力干预组Collagen Ⅱ、Caspase-3表达增加、NF-κB p65、ADAMTS-4、MMP-13表达减少，说明益肾活血通络方能有效延缓椎间盘的退变，其机制可能与NF-κB信号通路的激活有关，见图10。1 MPa和3 MPa表达结果同0.3 MPa，故不详细列举。

流行病学调查显示，久坐、久站等原因已经逐渐成为椎间盘退行性疾病的主要致病因素，静水压是椎间盘承受压力负荷的主要力学形式。前期研究发现椎间盘髓核细胞代谢机制及相关炎性因子的释放与静水压压力大小、作用时间、药物之间存在“压力-时间-药物”调节轴^[1]。最新研究发现，NF-κB信号通路与椎间盘退变过程联系紧密^[2-5]，表现在细胞受病原微生物、压力、氧化应激、毒素、细胞因子、应力、炎症递质等刺激时，抑制性IκB在IκB激酶作用下从三聚体中脱离出来发生磷酸化、泛素化并被分解，p50亚基上的易位信号及p65亚基上的DNA结合位点由此被显露出来，NF-κB活性得以恢复，具有活性的二聚体将从细胞质转移至细胞核中，与κB序列相结合，从而发挥基因转录、调节下游蛋白表达的作用。

针对国内1991至2010年记载关于中药治疗腰椎间盘突出症相关143篇文献分析得出结论，中药治疗腰椎间盘突出症疗效明显，活血化瘀、补益肝肾及舒筋通络包含于中医治疗腰椎间盘突出症最常用的11种治法之中^[6-7]。该研究在体外构建的细胞静水压加载系统中模拟人体不同体位时的椎间环境，观察细胞结构、活性、凋亡率以及相关基因蛋白表达水平，以期能探明益肾活血通络方对椎间盘髓核细胞影响的确切机制，为防治椎间盘退变寻得新的靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞学体外实验研究。

1.2  时间及地点  实验于2017年1月至2018年12月在北京中医药大学东直门医院教育部重点实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验药物及试剂  益肾活血通络方临床常用剂量均在《中华人民共和国药典》规定范围内，其组成中药由北京中医药大学东直门医院药剂科提供；DMEM培养基(美国Sciencell公司，Cat No：1101，Lot No：8617)；标准胎牛血清(美国Sciencell公司，Cat No：0010，Lot No：16360)；PBS溶液(美国Sciencell公司，Cat No：0303，Lot No：14093)；CCK-8试剂盒(Beyotime公司，C0038)；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(百奥莱博，型号40302ES60)。

1.3.2  实验设备仪器  医用恒温静水压压力罐(柳根哲教授设计，专利号：ZL201520108857.5，图1)；倒置相差显微镜及成像系统(奥林巴斯，型号IX50)；透视电镜(日本Hitachi公司，型号HF5000)；流式细胞仪(美国Beckmam公司，型号Cytomics FC500)；凝胶电泳仪(DEDUYIQI，DYCP-44P)；Western blot分析仪(美国Simon公司)。

1.3.3  实验动物  新西兰大白兔8只，5月龄，体质量2-4 kg，雌雄不限，由中国中医科学院实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(京)2018-0018。

1.4  方法

1.4.1  造模  人椎间盘髓核细胞由Sciencell Research Laboratories提供。先将椎间盘髓核细胞从液氮中取出，立即置于37 ℃恒温水浴中，待完全融化后取出，将髓核细胞重悬后1 000 r/min离心5 min，弃上清液后传代培养，使用倒置相差显微镜观察椎间盘髓核细胞的生长状况，取第3代髓核细胞进行实验。

1.4.2  益肾活血通络方含药血清的制备  北京中医药大学东直门医院名老中医孙呈祥教授临床上疗效显著的经验方——益肾活血通络方，该方由肉苁蓉30 g、杜仲15 g、怀牛膝15 g、骨碎补15 g、川芎15 g、全蝎5 g、威灵仙10 g、鸡血藤25 g、地龙10 g、当归15 g、丹参15 g、甘草10 g组成，药材来源于北京中医药大学东直门医院药剂科，先把药材放入容量规格为1 L的圆底烧瓶中，加20倍左右的水，浸泡中药4 h，然后将其放入套式恒温器煎煮，煮沸约1.5 h后，将药液用无纺纱布过滤、离心(4 000×g，10 min)，上层药液经滤纸过滤，过滤液倒入500 mL圆底烧瓶中，通过旋转蒸发仪设备进行蒸发操作(旋转调节：73 ℃，转速4×g)，最后浓缩为20-30 mL，将取得的浸膏倒入培养皿中，置于真空干燥箱(50 ℃)进行真空干燥2 d左右，获得固体浸膏，称得质量，对应于原药材，最终溶液的质量浓度是0.25 g/mL，生药含量是7.81 g/mL。益肾活血通络方按人与兔体表面积折算成动物等效药量，新西兰兔按生药98 g/(kg•d)灌胃，连续3 d，末次灌胃2 h后在麻醉状态下行耳缘静脉采血，贮存于4 ℃环境下过夜后离心处理，血清于56 ℃下灭活30 min，过滤除菌，分装，-20 ℃环境下留置备用。

1.4.3  分组  该研究共分为8组：①常压组：常压环境/单纯DMEM；②常压+中药血清组：常压环境/DMEM+中药血清；③0.3 MPa压力组：0.3 MPa压力环境/单纯DMEM；④0.3 MPa压力+中药血清组：0.3 MPa压力环境/DMEM+中药血清；⑤1 MPa压力组：1 MPa压力环境/单纯DMEM；⑥1 MPa压力+中药血清组：1 MPa压力环境/DMEM+中药血清；⑦3 MPa压力组：3 MPa压力环境/单纯DMEM；⑧3 MPa压力+中药血清组：3 MPa压力环境/DMEM+中药血清。

依据NACHEMSON的经典实验^[8]，已证实人椎间盘内的静水压压力随体位和活动量的不同而发生改变：平卧休息位时最低约0.3 MPa，坐位时接近1 MPa，弯腰搬重物可达3 MPa。该实验中压力值的选择上，也参考以上数据，分别为0.3 MPa、1 MPa和3 MPa，以模拟人体不同体位下椎间压力环境，另设对照组为常压(1 atm≈0.1 MPa)。椎间盘同样存在时间累积性损伤机制，负荷增加及反复负荷的加载，导致椎间盘极可能发生不可逆性损伤。静水压作用4 h，随压力上升，分解基因表达大于抗分解基因，总体表现为分解大于合成趋势。基于此，压力负荷加载作用4 h以上，椎间盘髓核细胞发生退变，可保证建模成功。因此，实验设置每个静水压下分别作用时间为2，4，6 h，在干预结束后进行相关指标检测并进行分析。

1.4.4  干预措施  将第3代髓核细胞铺片连同培养基一同装入规格为10 mL的注射器中，然后将其置于体外静水压压力罐并密封，使用氮气瓶朝压力罐中加入气体，观察压力仪表数值，直至压力装置内达到所需的压力值，通过智能温控装置使压力罐内温度始终在37 ℃左右。每个静水压下分别作用时间2，4，6 h。

1.5  主要观察指标

1.5.1  髓核细胞形态、生长状况及超微结构  经倒置相差显微镜及透射电镜观察不同静水压下椎间盘髓核细胞形态、生长状况及超微结构的变化和差异性。

1.5.2  髓核细胞增殖活性  CCK-8法检测各组椎间盘髓核细胞的增殖活性。细胞以5 000/cm²接种在96孔板中，在37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养6 h后向每孔加入10 mL CCK-8溶液，继续培养2 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。

1.5.3  髓核细胞凋亡情况  运用Annexin V-FITC/ Propidium Iodide凋亡试剂盒对椎间盘髓核细胞进行双染，观察并统计髓核细胞的凋亡率。

1.5.4  Western blot法检测髓核细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达  经组织蛋白提取后应用BCA法测定相关蛋白含量。将100 g蛋白通过凝胶电泳、转膜、孵育及显影成像后记录图像。以NF-κB p65、Collagen Ⅱ、ADAMTS-4、MMP-13、Caspase-3特异性抗体标记相关蛋白，运用Western blot法检测相关蛋白含量的变化。

1.6  统计学分析  应用SPSS 22.0软件进行结果统计分析，计量数据以x(_)±s表示，多组样本比较采用单因素方差分析；Levene法检验方差齐性：若方差齐，采用LSD法进行两两比较；若方差不齐，采用Tamhane法进行比较。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

3.1  压力因素对椎间盘髓核组织退变的影响  对椎间盘组织起作用的众多力学形式中，静水压是椎间盘髓核组织在人体直立、坐位、负重、弯腰抬重物等日常生活中承载负荷的最主要力学形式。研究证实，压力负荷对椎间盘组织的细胞活性和椎间盘基质的合成具有重要影响^[10]。静水压对椎间盘髓核细胞具有双向调控作用^[11]：一方面，恰当的静水压压力能促进髓核细胞的生长发育和成熟；另一方面，长期、不正确的力学负荷将会导致髓核细胞的凋亡，从而促进椎间盘组织的退变。长期直立、久坐、过度劳作均可引起椎间盘退变，导致颈胸腰痛等相关疾病，这种情况就是中医学所阐述的“久立伤骨、伤肾、损伤颈胸腰”的观念。研究表明，当过高的压力加载到腰椎间盘上时，椎间盘会发生形变，导致椎间盘组织内的水分减少，进而椎间盘细胞外基质分解速度加快，椎间盘内环境倾向于恶化，从而促进椎间盘退变^[12-13]；相反，如果椎间盘内静水压缺失同样会导致椎间盘组织内蛋白聚糖的表达量显著降低，这种作用与压力的强度和作用时间相关。因此，合适的静水压刺激对椎间盘髓核细胞的增殖、生长发育及基质代谢起着极其关键的作用。课题组前期的研究结果也显示：单层培养的髓核细胞在0.3 MPa静水压压力下，髓核细胞活性较好，生长状况、细胞形态、超微结构较为完整，细胞外基质合成增加，而在3 MPa静水压压力下持续受压时，细胞外基质表达明显较少，分解速度显著加快，髓核细胞凋亡率增加。这些结果同国内外学者的研究结果一 致^[11，14]，这些研究均表明静水压力学因素对于椎间盘组织的发育成熟和退变具有重要的相关性，对椎间盘髓核细胞的凋亡和基质代谢发挥着重要作用^[15]。该研究以益肾活血通络方含药血清在不同静水压下干预人椎间盘髓核细胞，研究结果观察到益肾活血通络方含药血清对髓核细胞生长状况、形态和超微结构起到保护作用，且能降低髓核细胞凋亡率。
3.2  作用时间对椎间盘髓核组织退变的影响  前期研究结果已证实椎间盘髓核细胞表现出对“压力-时间-药物”影响因素敏感^[16-17]，静水压压力下作用时间超过4 h后，细胞分解过程大于合成过程，因此表现为分解大于合成趋势。该实验研究中在同一静水压下中药血清干预组与单纯压力干预组作用4 h较作用2，6 h差异更明显。

3.3  药物对椎间盘髓核组织退变的影响  中医学关于椎间盘退行性疾病已有深刻独到的认识，《素问•生气通天论》曰：“故肾为腰痛之病也”，指出腰部疼痛的病理基础是由于久立、久劳损及于肾, 最终出现脊柱衰老。因此，椎间盘退变不仅与肾中精气衰退有内在联系，而且与负荷劳损致血瘀络阻密切相关。益肾活血通络方治法上具有消补兼顾、补不壅滞、攻不伤正的特点，其破中有补、补中有行的治法特点可以较大程度地抑制炎症反应，减少炎性因子的合成，能有效降低椎间盘髓核细胞的凋亡，进而减缓椎间盘的退变趋势^[18]。目前西医基础研究明确指出腰椎间盘突出引起腰腿痛的主要原因是由于神经根受压水肿，细胞中大量炎性因子的释放所致^[19]。北京中医药大学东直门医院名老中医孙呈祥教授根据多年临床经验总结指出椎间盘退变的主要病机为肾亏、血瘀、络阻，缓解临床腰腿痛的用药根本是补肾，核心是活血，关键是通络，并以“益肾活血通络”思路临床辩证组方治疗腰椎间盘突出等椎间盘退变性疾病，经临床20余年的验证，屡见效佳，为无数患者解决腰腿痛之苦，重新恢复正常的生活及工作。国内有关益肾活血通络法治疗颈椎、腰椎疾病的相关临床研究报道显示该方临床效果显著^[20-21]。该研究采用Western blot法检测加入益肾活血通络方含药血清后髓核细胞NF-κB p65表达减少，分解相关蛋白ADAMTS-4、MMP-13表达减少。与常压组、单纯压力组比较，加入益肾活血通络方含药血清后虽不能逆转椎间盘退变趋势，但明显抑制了这种进程，说明益肾活血通络方可能通过抑制NF-κB p65通路的表达延缓髓核细胞的凋亡，从而减缓椎间盘的退变。

综上，益肾活血通络方可能通过激活NF-κB信号通路，进而调控该通路相关分子蛋白的表达，延缓椎间盘的退变趋势，其机制可能与促进Collagen Ⅱ、Caspase-3表达，抑制NF-κB p65、ADAMTS-4、MMP-13表达有关。该研究部分探明了静水压诱导椎间盘髓核细胞凋亡及调控基质代谢的分子生物学机制，为寻找益肾活血通络方治疗椎间盘退变性疾病的疗效机制及作用靶点提供新的思路和方法，为中医药治疗椎间盘退行性疾病在分子生物学领域提供新的微观生物学证据。

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文题释义：
静水压：是椎间盘承受压力负荷的主要力学形式。静水压压力随体位和活动量的不同而发生改变：平卧休息位时最低约0.3 MPa，坐位时接近1 MPa，弯腰搬重物可达3 MPa。在该实验中压力值的选择上，也参考以上数据，分别为0.3 MPa、1 MPa和3 MPa，以模拟人体不同体位下椎间压力环境，另设对照组为常压(1 atm≈0.1 MPa)。
NF-κB信号通路：最新研究发现，NF-κB信号通路与椎间盘退变过程联系紧密。在细胞受压力、氧化应激、毒素、细胞因子、应力、炎症递质等刺激时，NF-κB活性得以恢复，与κB序列相结合后发挥基因转录、调节下游蛋白表达的作用。该实验基于益肾活血通络方的确切疗效，从与椎间盘退变过程密切相关的NF-κB信号通路入手，研究其发挥临床疗效的可能机制。

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目前NF-κB信号通路与椎间盘退变二者关系是骨科学术界研究热点，深入研究椎间盘中各种信号通路的作用，不但能揭示椎间盘退变的发生机制，而且能减少社会和经济压力，但是NF-κB信号通路调节大量的基因，多通路间相互影响，不管是从基础研究还是临床都有很多工作需要完善。目前有文献报道PI3K/Akt、MAPK、Wnt/β-catenin信号通路与NF-κB信号通路存在着相互作用，共同参与椎间盘退变，但对椎间盘退变的总体效应及作用机制的关键环节还需更深一步研究。关于益肾活血通络方发挥临床疗效的作用途径可能不止NF-κB信号通路一条通路，将来应完善不同通路研究，且进行横向比较，真正明确益肾活血通络方发挥临床疗效的关键机制。

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