Shh/Ihh在小鼠胚胎椎间盘形成过程中的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2855

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (32): 5097-5101.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2855

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Shh/Ihh在小鼠胚胎椎间盘形成过程中的表达

巩婷婷1，陈建权1，2

1苏州大学医学部骨科研究所，江苏省苏州市 215008；2苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215008

收稿日期:2019-10-14 修回日期:2019-10-19 接受日期:2019-12-13 出版日期:2020-11-18 发布日期:2020-09-24
通讯作者: 陈建权，博士，教授，苏州大学医学部骨科研究所，江苏省苏州市 215008；苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215008
作者简介:巩婷婷，女，1992年生，甘肃省正宁县人，汉族，苏州大学在读硕士，主要从事骨发育与再生研究。
基金资助:
江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)

Expression of Shh and Ihh during the formation of intervertebral discs in mouse embryo

Gong Tingting1, Chen Jianquan1, 2

1Institute of Orthopedics, Soochow University School of Medicine, Suzhou 215008, Jiangsu Province, China; 2Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215008, Jiangsu Province, China

Received:2019-10-14 Revised:2019-10-19 Accepted:2019-12-13 Online:2020-11-18 Published:2020-09-24
Contact: Chen Jianquan, MD, Professor, Institute of Orthopedics, Soochow University School of Medicine, Suzhou 215008, Jiangsu Province, China; Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215008, Jiangsu Province, China
About author:Gong Tingting, Master candidate, Institute of Orthopedics, Soochow University School of Medicine, Suzhou 215008, Jiangsu Province, China
Supported by:
Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

Shh，Ihh：哺乳动物Hedgehog基因存在3种同源基因，分别为Sonic Hedgehog，India Hedgehog以及Desert Hedgehog，分别编码Shh，Ihh以及Dhh蛋白。它们在胚胎的发育、成体组织和器官干细胞的自我更新与增殖过程中发挥重要的作用。

他莫昔芬：是一种选择性雌激素反应调节剂。当向CreER^T2小鼠体内注射他莫昔芬时，由他莫昔芬代谢所产生的雌激素类似物与ERT结合，从而使CreER^T2进入细胞核内发挥Cre重组酶活性。

背景：研究表明，Sonic Hedgehog(Shh)在小鼠脊索细胞内有表达，India Hedgehog(Ihh)主要在小鼠胚胎椎体的软骨样细胞以及后期形成的终板中表达。但关于Shh以及Ihh在小鼠胚胎椎间盘形成过程中的表达情况并不清楚。

目的：探究Shh和 Ihh信号在小鼠胚胎椎间盘形成过程中的表达。

方法：将雄性的Shh-CreER^T2; R26-mTmG/+小鼠与雌性R26-mTmG/+小鼠进行交配，获取不同时期(E8.5，E11.5，E12.5，E14.5，E16.5，E18.5)的孕鼠，注射10 g/L的他莫昔芬10 μL/g。当小鼠胚胎处于P0时，取小鼠胚胎椎间盘组织进行基因型鉴定；同时将雄性的C57BL/6小鼠与雌性的C57BL/6小鼠进行交配，获取不同时期(E11.5，E12.5，E14.5，E16.5，E18.5)的孕鼠，取小鼠胚胎椎间盘组织进行分析。通过免疫荧光法检测Shh信号在小鼠胚胎椎间盘形成过程中的表达；免疫组织化学法检测Ihh信号在小鼠胚胎椎间盘形成过程中的表达。所有涉及动物的相关实验均获得苏州大学动物伦理委员会的批准。

结果与结论：①经PCR扩增筛选出基因型为Shh-CreERT2; R26-mTmG/+小鼠胚胎；②免疫荧光染色结果显示，在椎间盘形成过程中，髓核细胞内Shh表达水平逐渐降低；③免疫组织化学染色结果显示，在椎间盘形成过程中，髓核细胞内Ihh表达水平逐渐升高；④结果表明Shh和Ihh在椎间盘形成过程中均发挥调控作用，在一定程度上为研究椎间盘退变的分子机制奠定基础。

ORCID: 0000-0001-9429-2339(巩婷婷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 椎间盘退变, 脊索鞘, 髓核, Shh, Ihh, Shh-CreERT2, R26-mTmG/+

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that Sonic Hedgehog (Shh) is expressed in mouse Notochordal cells, and India Hedgehog (Ihh) is mainly expressed in chondrocyte-like cells and end plates of mouse embryonic vertebral bodies. However, the expression of Shh and Ihh during the formation of intervertebral discs in mouse embryo is unclear.

OBJECTIVE: To investigate the expression of Shh and Ihh during the formation of intervertebral discs in mouse embryo.

METHODS: Male Shh-CreER^T2, R26-mTmG/+ mice mated with female R26-mTmG/+ mice to obtain pregnant rats at different periods of pregnancy (E8.5, E11.5, E12.5, E14.5, E16.5, E18.5), followed by injection of 10 g/L tamoxifen at a dose of 10 μL/g. Intervertebral disc tissues were isolated from the mouse embryo at P0, followed by genotype identification. At the same time, male C57BL/6 mice mated with female C57BL/6 mice to obtain pregnant rats at different periods of pregnancy (E11.5, E12.5, E14.5, E16.5, E18.5), and the intervertebral disc tissues of mouse embryo were taken and analyzed. The expression of Shh and Ihh during the formation of intervertebral discs in mouse embryo was detected using immunofluorescence and immunohistochemistry, respectively. Implementation of animal experiments was approved by the Animal Ethics Committee of Soochow University.

RESULTS AND CONCLUSION: Shh-CreER^T2; R26-mTmG/+ mouse embryos were identified by PCR amplification. The results of immunofluorescent staining showed a gradual decrease in the expression of Shh in nucleus pulposus cells during the formation of intervertebral discs in mouse embryo. The results of immunohistochemical staining showed a gradual increase in expression of Ihh in nucleus pulposus cells during the formation of intervertebral discs in mouse embryo. In summary, Shh and Ihh are dynamically expressed during the formation of intervertebral discs in mouse embryo, and provide a basis for further research on the molecular mechanism of intervertebral disc degeneration.

Key words: intervertebral disc generation, notochord sheath, nucleus pulposus, Shh, Ihh, Shh-CreERT2, R26-mTmG/+

中图分类号:

巩婷婷, 陈建权. Shh/Ihh在小鼠胚胎椎间盘形成过程中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(32): 5097-5101.

Gong Tingting, Chen Jianquan. Expression of Shh and Ihh during the formation of intervertebral discs in mouse embryo[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(32): 5097-5101.

图/表（结果） 4

(2)PCR扩增反应及琼脂糖凝胶成像分析：①Cre的反应条件：预变性(95 ℃，2 min)；35循环(95 ℃变性30 s，58 ℃ 退火 45 s，72 ℃延伸 45 s)；最后 72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；②R26-mTmG的反应条件：预变性(95℃，3 min)；35循环(95 ℃变性30 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。将Cre和R26-mTmG的PCR扩增产物进行琼脂糖浓度为1%-2%的凝胶电泳，电压为120 V，上样量为20 μL，DNA marker为5 μL，30-50 min后至凝胶成像仪处拍照，并分析实验结果。引物序列见表1。

2.1 ShhcreER^T2; R26-mTmG/+小鼠基因型的鉴定提取小鼠胚胎尾巴的DNA，利用Cre和R26-mTmG引物通过PCR鉴定ShhcreER^T2; R26-mTmG/+小鼠和对照(R26-mTmG/+)小鼠基因型。部分小鼠胚胎尾巴的DNA扩增产物鉴定结果见图1：Cre序列存在时，DNA扩增产物的大小为300 bp；R26-mTmG序列存在时，DNA扩增产物的大小为250 bp，野生型等位基因DNA扩增产物的大小为330 bp。

2.2 小鼠胚胎椎间盘形成过程中Shh的表达在小鼠胚胎椎间盘形成过程中，经他莫昔芬诱导，对照小鼠(R26-mTmG/+小鼠)胚胎的椎间盘中未见绿色荧光信号表达；而Shhcre^ER; R26-mTmG/+小鼠胚胎椎间盘中可见绿色荧光信号表达(在E8.5，E11.5，E12.5，E14.5髓核细胞内可见绿色荧光信号；E16.5，E18.5髓核细胞内未见绿色荧光信号)，且绿色荧光信号逐渐减少，见图2A。髓核细胞内Shh信号的平均荧光强度见图2B，说明在小鼠胚胎椎间盘形成过程中，髓核细胞内Shh表达水平逐渐降低。

2.3 小鼠胚胎椎间盘形成过程中Ihh的表达在小鼠胚胎椎间盘形成过程中，对照小鼠(未加Ihh一抗)胚胎的椎间盘中未见Ihh表达；而实验小鼠(滴加Ihh一抗)胚胎椎间盘中可见Ihh表达(E11.5脊索鞘中未见Ihh信号；E12.5，E14.5，E16.5，E18.5髓核细胞中可见Ihh信号)，且Ihh信号逐渐增多，见图3A。髓核细胞内Ihh阳性细胞百分比见图3B，说明在小鼠胚胎椎间盘形成过程中，髓核细胞内Ihh表达水平逐渐升高。

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引言

腰痛是影响成年群体健康的第二大常见临床疾病^[1]。据报道，超过80%的成年人在日常生活中均会出现腰痛，很大程度由于年轻时缺少活动所致^[2]。作为一种常见的临床疾病，腰痛给患者家庭以及社会带来沉重的经济负担^[3]。虽然引发腰痛的确切因素尚不明确，但已有文献表明椎间盘退变与腰痛存在密切联系^[4-7]。近年来，椎间盘退变的年轻化趋势随着生活节奏的加快以及生活压力的加大越发明显^[8]。因此，深入研究椎间盘退变的分子机制，已成为寻找新的靶向性治疗手段亟待解决的问题。

椎间盘主要由两个相邻椎体间的纤维软骨结构组成，从而为脊柱的稳定性与灵活性提供重要保障^[9]。作为一种比较特殊的组织结构，其主要由髓核、纤维环以及软骨终板3部分构成^[6，10]。髓核由胚胎的脊索鞘发育而成，位于椎间盘的正中央，主要成分为蛋白聚糖、水、Ⅱ型胶原^[11]。随着年龄的增加或者椎间盘组织遭到破坏，蛋白聚糖和水分不断减少，Ⅱ型胶原转变为Ⅰ型胶原，最终导致髓核纤维化^[11]。

在哺乳动物中，Hedgehog(Hh)信号是编码一系列分泌蛋白的基因家族成员，能够很好地调节胚胎的发育、成体组织和器官干细胞的自我更新与增殖^[12]。已有研究表明，Sonic Hedgehog(Shh)在小鼠脊索细胞内有表达^[13-14]。此外，India Hedgehog(Ihh)主要在小鼠胚胎椎体的软骨样细胞以及后期形成的终板中表达^[15]。然而，关于Shh以及Ihh在小鼠胚胎椎间盘形成过程中的表达情况并不清楚。

基因工程小鼠，由于和人类遗传与生理病理的极大相似性，已成为研究人类常见疾病的重要工具^[16]，在此前提下，Cre/loxP系统应运而生。作为研究哺乳动物遗传学和生物学的一种比较完整的工具，该系统通过对基因表达进行时间和空间的控制，从而最大限度提高对基因功能的认识^[16]。对于可进行时间和空间控制的CreER^T2系统，在他莫昔芬诱导下，CreER^T2融合蛋白向细胞核内转移，并受细胞或组织特异性启动子的驱动，与目的基因片段两端的loxP位点结合，对目的基因片段进行位点特异性敲除^[16-18]。已有文献表明Shh-CreER^T2能够在小鼠胚胎的早期阶段(E8.5-E11.5)特异性靶向标记髓核细胞^[11]。而R26-mTmG是一种红绿双荧光报告基因。因此，在此次研究中，作者运用孟德尔原理获得基因型为Shh-CreER^T2; R26-mTmG/+的小鼠胚胎。并通过向不同时期(E8.5，E11.5，E12.5，E14.5，E16.5，E18.5)的转基因孕鼠注射他莫昔芬，诱导Shh-CreER^T2融合蛋白向细胞核内转移，使R26-mTmG发生基因重组，产生绿色荧光(该绿色荧光代表Shh信号)，从而探究Shh信号在小鼠胚胎椎间盘形成过程中的表达；以及通过对不同时期(E11.5，E12.5，E14.5，E16.5，E18.5)的小鼠胚胎椎间盘组织进行Ihh免疫组织化学染色，探究Ihh在小鼠椎间盘形成过程中的表达，从而为进一步研究椎间盘退变的分子机制奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计动物体内实验。

1.2 时间及地点于2019年2至9月在苏州大学骨科研究所内完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物雄性Shh-CreER^T2; R26-mTmG/+小鼠2只；雌性R26-mTmG/+小鼠8只；雄性C57BL/6小鼠2只；雌性C57BL/6小鼠8只均由苏州大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(苏)2017-0043。将雄性的Shh-CreER^T2; R26-mTmG/+小鼠与雌性R26-mTmG/+小鼠进行交配，通过检查雌鼠阴道口阴道栓的方式获取不同时期(E8.5，E11.5，E12.5，E14.5，E16.5，E18.5)的孕鼠，注射10 μL/g的质量浓度为10 g/L的他莫昔芬。当小鼠胚胎处于P0时，取小鼠胚胎椎间盘组织，并用4%PFA将其固定，于4 ℃摇床过夜。然后通过基因型鉴定获得基因型为R26-mTmG/+和Shh-CreER^T2; R26-mTmG/+的小鼠胚胎，并对其椎间盘进行相应分析；与此同时将雄性的C57BL/6小鼠与雌性的C57BL/6小鼠进行交配，通过检查雌鼠阴道口阴道栓的方式获取不同时期(E11.5，E12.5，E14.5，E16.5，E18.5)的孕鼠，并取小鼠胚胎椎间盘组织进行相应分析。实验动物符合国家实验动物检疫标准，相关研究已获苏州大学动物伦理委员会的批准。

1.3.2 主要试剂与仪器他莫昔芬、玉米油(Corn Oil)、PFA (Paraformaldehyde)(均为Sigma公司，美国)；蔗糖、异丙醇(均为上海国药集团化学试剂有限公司，中国)、中性树脂(生工生物工程(上海)股份有限公司，中国)、chicken GFP一抗、anti-chicken(488)二抗、Ihh一抗(均为Abcam公司，美国)、中杉金桥试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，中国)等；超速离心机、PCR仪(均为Thermo公司，美国)、冷冻包埋剂(OCT)、冰冻切片机(Leica公司，德国)、正置荧光显微镜(Carl Zeiss公司，德国)等。

1.4 实验方法

1.4.1 他莫昔芬溶液的制备向洁净的玻璃瓶内吸取10 mL玉米油，置于42 ℃的金属浴中加热30 min。然后称取100 mg 他莫昔芬于玻璃瓶中，避光、震荡，置于37 ℃摇床上，间隔震荡、澄清，4 ℃保存，终质量浓度为10 g/L。

1.4.2 小鼠胚胎的基因型鉴定

(1)DNA提取：①将适量小鼠胚胎的尾巴放入已标记好的Eppendorf(EP)管中，并加入300 μL组织裂解液和3 μL蛋白酶K进行裂解，于55 ℃恒温箱内过夜；②次日，将经过裂解的样本进行震荡，并向样本中加入42 μL的8 mol/L乙酸钾，上下颠倒混匀多次；③冰上放置1 h后，超速离心机13 000 r/min离心15 min；④将EP管中的上清液转移至新标记好的EP管中，并加入300 μL异丙醇，上下颠倒多次，此时出现白色絮状DNA沉淀；⑤超速离心机13 000 r/min离心15 min，弃去EP管中的上清；⑥超速离心机13 000 r/min离心1 min，使EP管壁残留液体聚集于底部，然后用移液器轻轻的将残留液体吸干，并置于通风橱中吹干；⑦根据DNA沉淀量加入ddH₂O，置于55 ℃恒温箱内溶解过夜。

1.4.3 冰冻切片包埋前处理、包埋、切片以及免疫荧光染色和免疫组织化学染色

(1)包埋前处理：①取妊娠的转基因雌鼠，用2%戊巴比妥麻醉安乐死后取出胚胎，剥开，转入4% PFA中进行4 ℃过夜固定；②次日，1×PBS洗3遍，每遍5 min；转入15%蔗糖溶液中进行脱水；③第3日，转移至30%蔗糖溶液进行脱水。

(2)包埋与切片：待椎间盘组织完全沉至30%蔗糖溶液底部时，进行OCT包埋。冰冻切片，切片厚度为8 μm，保存于-20 ℃冰箱内备用。

(3)免疫荧光染色：①将载玻片置于室温条件下避光干燥20 min后，1×PBST洗3遍，每遍5 min；②封闭液封闭 1 h后滴加GFP一抗(稀释比例1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；③滴加anti-chicken(488)二抗(稀释比例1∶400)室温条件下孵育1 h；④孵育结束后，1×PBST洗3遍，每遍5 min；最后进行封固，正置荧光显微镜下观察，拍照。

(4)免疫组织化学染色：①将载玻片置于60 ℃金属浴烘烤1 h后，1×PBST洗3遍，每遍5 min，然后将其放入柠檬酸钠缓冲液中，58 ℃修复过夜；②次日，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温条件下阻断15 min；然后用试剂A(中杉金桥试剂盒)室温封闭15 min，倾去，勿洗；③封闭后滴加Ihh一抗(稀释比例1∶200)，对照组用体积分数10%山羊血清代替，4 ℃孵育过夜；④滴加试剂B(中杉金桥试剂盒)，室温孵育15 min。待孵育结束后，用1×PBST洗3遍，每遍5 min，再滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育15 min；⑤DAB显色，用自来水适时终止反应；⑥苏木精复染2 min；⑦梯度脱水以及透明；⑧中性树脂封固后显微镜拍照。

1.5 主要观察指标 ①小鼠胚胎基因型鉴定结果；②免疫荧光法检测小鼠胚胎椎间盘形成过程中Shh信号的表达；③免疫组织化学法检测小鼠胚胎椎间盘形成过程中Ihh信号的表达。

1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 7.0软件进行数据分析并绘图。统计方法采用t 检验，P < 0.05被认为差异有显著性意义。

讨论

椎间盘退变是一种由多因素协同作用所引发的慢性退行性疾病，常导致腰痛^{[5，19- 20]}。目前关于椎间盘退变的治疗方法主要分为手术治疗和非手术治疗^[21]。虽然这些治疗方法在一定程度上能够缓解患者的病痛，但却不能根治椎间盘退变^[21]。究其原因主要因为基于该领域的基础研究比较匮乏^[22]。

近年来，大量研究表明Sonic Hedgehog，Wnt，转化生长因子β以及骨形态发生蛋白信号通路参与椎间盘的生长、分化以及衰老^[22]。但关于椎间盘形成阶段相关分子机制的研究相对较少。而Sonic Hedgehog信号通路不仅参与了椎间盘的形成，还可能与其后期内稳态的维持息息相关^[14^，^20]。因此，有必要对Sonic Hedgehog信号通路在椎间盘形成阶段的表达情况进行更为深入的研究。目前，部分研究表明椎间盘退变与髓核细胞代谢异常或丢失密切相关^[23-25]。因而作者主要在椎间盘形成过程中，对髓核细胞内Sonic Hedgehog(Shh)的表达情况进行研究。研究结果不仅进一步证明ShhCreER^T2能够在小鼠胚胎的早期阶段(E8.5-E11.5)特异性靶向标记髓核细胞，还发现在椎间盘形成过程中，髓核细胞内Shh表达水平逐渐降低，在一定程度上说明在椎间盘形成后期，Sonic Hedgehog信号通路所发挥的调控作用在减小。结果提示其他信号通路可能在椎间盘形成的后期阶段参与调控，对进一步深入研究椎间盘退变的相关分子机制具有重要意义。

Hedgehog(Hh)信号通路参与骨发育与内稳态的维持，并与疾病的发生息息相关，是调控细胞命运的一种重要信号通路^[26-27]。在哺乳动物中，该信号通路相对比较保守，主要包括 Sonic Hedgehog (Shh)，Indian Hedgehog (Ihh)以及Desert Hedgehog(Dhh)3种同源蛋白^[26]，而作为3种同源蛋白之一的Dhh主要参与调控睾丸的发育，特别是睾丸间质细胞(Leydig cell)^[27-28]。因此，接下来在椎间盘形成过程中，作者主要对髓核细胞内Ihh的表达情况进行研究。令人兴奋的是，在椎间盘的髓核细胞内首次发现Ihh的表达，结果表明在椎间盘形成的早期阶段Ihh表达水平很低(脊索细胞内几乎不表达)，到后期阶段髓核细胞内开始出现大量的Ihh信号。总之，在整个椎间盘形成过程中，髓核细胞内Ihh表达水平逐渐升高。不过，髓核细胞并没有完全被Ihh信号占据。因此，作者猜测Shh和Ihh在椎间盘的形成过程中均发挥调控作用，两者之间可能具有互补性。

尽管研究结果能够充分说明Shh和Ihh两者在椎间盘的形成过程中均发挥调控作用，并在一定程度上为进一步研究椎间盘退变的分子机制奠定基础，但尚有不足之处：①此次研究仅限于在小鼠胚胎椎间盘形成过程中，对Shh和Ihh表达水平进行研究，缺乏对椎间盘退变与Shh和Ihh表达关系的进一步验证；②在椎间盘形成过程中，Shh和Ihh均发挥调控作用，但两者是否具有互补性需进行进一步验证；③该研究具有一定的临床意义，需增加相应临床样本的研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Shh/Ihh在小鼠胚胎椎间盘形成过程中的表达

Expression of Shh and Ihh during the formation of intervertebral discs in mouse embryo

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[1]	刘志超, 张帆, 孙旗, 康晓乐, 袁巧妹, 柳根哲, 陈江. 不同静水压下人椎间盘髓核细胞的形态和活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1172-1176.
[2]	杨洋, 姚羽, 沈孝天, 刘佳佳, 薛建华. 退变腰椎间盘中白细胞介素21的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 690-694.
[3]	江丽红, 吴晓锋, 欧阳林, 罗爱芳, 黄丽. 基于代谢组学腰椎间盘退变的计算机辅助诊断[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3796-3803.
[4]	付远飞, 何升华, 赖居易, 孙志涛, 冯华龙, 蓝志明. 地龙提取物抑制核因子κB信号通路延缓椎间盘髓核细胞的退变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 264-268.
[5]	张凯, 张晓勃, 施锦涛, 王克平, 周海宇. 间充质干细胞治疗椎间盘退行性疾病：基于Web of Science数据库的文献计量及可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3031-3038.
[6]	杨林, 石军, 郭中华, 王中汉, 刘贺, 李秋菊. 基于高分子材料的椎间盘组织工程：研究重点和热点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2589-2596.
[7]	何升华, 付远飞, 蓝志明, 孙志涛, 赖居易, 冯华龙, 郭子宾, 李盖. 腰突颗粒通过调控miR-221表达干预髓核细胞的增殖与凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2177-2182.
[8]	刘志刚, 郭庆功, 陈景涛. 刺山柑总生物碱干预椎间盘退变模型大鼠髓核细胞的增殖与凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1699-1704.
[9]	陈铁柱, 王宁科, 李晓声. 腰痹舒干预腰椎间盘退变模型兔髓核组织水通道蛋白1、水通道蛋白3的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1168-1173.
[10]	陈江, 肖辉灯, 孙旗, 张帆, 祝永刚, 刘志超, 郭菲宇, 柳根哲. 人椎间盘髓核细胞增殖活性与益肾活血通络方的干预调控[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1200-1206.
[11]	吐尔洪江·阿布都热西提, 孟祥玉, 买合木提·亚库甫, 王天堂, 西尔艾力·买买提, 戴继芳, 王为. 椎间孔镜下腰椎间盘髓核摘除治疗腰椎间盘突出症的生物力学优势[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(36): 5768-5773.
[12]	杨金丰, 马三辉. 椎间盘退行性变与HTRA1和HAPLN1基因多态性的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(32): 5128-5132.
[13]	向熙, 司群超, 成伟益, 曹平, 郑金鹏, 胡冰. 不同手术方式治疗腰椎间盘突出症的网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(27): 4398-4405.
[14]	王宇, 雷建银, 辛浩, 罗凛, 李志强. 椎间盘退变颈椎(C2-C7)在正常承载与推拿下的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(27): 4278-4284.
[15]	尹逊路, 朱立国, 冯敏山, 于杰, 展嘉文, 梁龙, 韩涛. 持续负载压力对髓核细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(26): 4125-4128.