2.1  紫檀芪对软骨细胞的最适浓度  见图1，应用不同质量浓度的紫檀芪(7.8-32 000 μg/L)处理软骨细胞时，与对照组相比，在15.6-250 μg/L 的紫檀芪可显著促进细胞生长(P < 0.05)。尤其是紫檀芪质量浓度为125 μg/L时，软骨细胞显示出最高的增殖活性。基于该结果，将125 μg/L作为紫檀芪最适质量浓度用于进一步研究。

2.2  紫檀芪对软骨细胞增殖能力的影响  MTT结果显示，与对照组相比，紫檀芪可以促进软骨细胞增殖(P < 0.05)。H₂O₂刺激的软骨细胞，与对照组相比细胞增殖率显著降低(P < 0.05)。然而，紫檀芪干预则能显著抑制H₂O₂对软骨细胞增殖的不利影响，H₂O₂+紫檀芪组细胞数目明显多于H₂O₂组 (P < 0.05)，见图2。苏木精-伊红和FDA/PI染色结果也表明，在H₂O₂组中软骨细胞数量减少，在H₂O₂+紫檀芪组中细胞数量较单独H₂O₂刺激组显著增加。这些结果均表明紫檀芪可促进软骨细胞增殖，避免H₂O₂诱导的软骨细胞凋亡，见图3。

2.2  紫檀芪对软骨细胞增殖能力的影响  MTT结果显示，与对照组相比，紫檀芪可以促进软骨细胞增殖(P < 0.05)。H₂O₂刺激的软骨细胞，与对照组相比细胞增殖率显著降低(P < 0.05)。然而，紫檀芪干预则能显著抑制H₂O₂对软骨细胞增殖的不利影响，H₂O₂+紫檀芪组细胞数目明显多于H₂O₂组 (P < 0.05)，见图2。苏木精-伊红和FDA/PI染色结果也表明，在H₂O₂组中软骨细胞数量减少，在H₂O₂+紫檀芪组中细胞数量较单独H₂O₂刺激组显著增加。这些结果均表明紫檀芪可促进软骨细胞增殖，避免H₂O₂诱导的软骨细胞凋亡，见图3。

2.3  紫檀芪对软骨细胞蛋白聚糖分泌的影响  结果显示，紫檀芪能够阻止H₂O₂诱导的细胞丢失，并且促进细胞聚集成团。同时，相对于对照组，紫檀芪组出现更多蛋白聚糖阳性染色区，提示紫檀芪能够可以增加蛋白聚糖的分泌，抑制H₂O₂诱导的软骨细胞细胞外基质丢失。见图4。

2.4  紫檀芪对软骨细胞特异性基因表达的影响  相对于对照组，紫檀芪可以促进软骨细胞分化特异性基因聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原酶1高表达，H₂O₂干预抑制软骨细胞聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原酶1基因表达(P < 0.05)。然而，H₂O₂+紫檀芪组聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原酶1基因表达显著显高于H₂O₂组(P < 0.05)，提示紫檀芪可改善H₂O₂对软骨细胞分化的损伤。见图5。

骨关节炎是老年群体常见的一种慢性退行性疾病，其主要特征为关节软骨退变、软骨下骨硬化及周围软组织炎症增生，全世界约15%的人口患有骨关节炎^[1-2]。 骨关节炎的发生主要与细胞外基质丢失和大量纤维化形成而导致的软骨破裂有关，最终导致软骨总量的减少^[3]。尽管临床上某些药物可通过减轻软骨退变和滑膜炎症来减轻骨关节炎症状，但由于该病发病机制复杂，目前尚无有效的治疗方法。最近的研究主要集中在软骨细胞凋亡的抑制上，以保持软骨功能和维持软骨细胞活性^[4]。据报道，活性氧过度积累可促进骨关节炎的发展^[5]。活性氧可诱发软骨细胞氧化应激反应和线粒体的损伤^[6-7]，并激活内质网应激^[4，8]，此外，氧化应激会破坏细胞膜并诱导细胞凋亡^[9]。大量临床与基础研究表明抗氧化剂的应用可以发挥对骨关节炎的保护作用^[10]。然而，许多抗氧化剂使用后常常产生严重不良反应，例如胃肠道出血、心脏或血管相关的疾病，这可能对患者的健康造成更大危害^[11-13]。许多传统的中草药具有抗氧化、抗炎等作用，且不良反应少、成本低，目前已作为关节软骨治疗的替代品受到越来越多的关注^[14-15]。

紫檀芪(pterostilbene，PTE)是紫檀、蓝莓、葡萄和花榈木等中药植物的有效成分之一，是白藜芦醇衍生的非黄酮类多酚化合物。白藜芦醇是当今研究的热点化合物之一，因紫檀芪是白藜芦醇的衍生物，因此两者具有相似的药理特性。而有实验表明，在同等情况下紫檀芪的生物利用率、生物活性及安全性比白藜芦醇更高^[16-17]，因此，紫檀芪较白藜芦醇可能更适于进一步开发并应用于临床。紫檀芪是一种强大的天然抗氧化剂，已有证明能降低细胞氧化应激和活性氧的发生，并抑制不同细胞系过氧化氢酶的表达增加^[18]。虽然目前国内外对紫檀芪的抗氧化机制进行了广泛的研究，但是，关于紫檀芪在软骨细胞抗氧化应激作用中的研究还未见报道。实验旨在研究紫檀芪对H₂O₂诱导的人软骨细胞氧化应激损伤的影响，为今后深入探讨紫檀对软骨细胞的治疗作用提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞学实验观察。

1.2  时间及地点  实验于2019年1月至9月在广西医科大学完成。

1.3  材料  

1.3.1  人膝关节软骨  取自无膝关节相关疾病、无污染，因车祸在广西医科大学创伤骨科手外科截肢患者，标本获取均得到患者知情同意，并取得广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准，批号201805008。

1.3.2  实验用主要药品、试剂及仪器  紫檀芪(成都曼斯特科技有限公司)；Ⅱ型胶原酶、二甲基亚砜(Sigma，美国)；1%青-链霉素(索莱宝，北京，中国)；体积分数10%胎牛血清(Hyclone，美国)；高糖培养基(DMEM)、MTT溶液(Gibco，美国)；Multiskan GO酶标仪(Thermo Fisher Scientific，USA)；苏木精和伊红染色、番红O染色试剂盒(索莱宝)；荧光素二乙酸盐(FDA，Invitrogen Life Technologies，美国)；碘化丙锭(PI，Invitrogen，美国)；激光扫描共聚焦显微镜(Nikon America Inc，美国)；倒置显微镜(OLYMPUS，日本)。

1.4  实验方法

1.4.1  软骨细胞的分离与培养  将在无菌条件下将膝关节软骨剪碎成小块，在37 ℃下用2 g/L II型胶原酶消化4 h。收集消化的细胞，离心并重悬于含1%青-链霉素和体积分数10%胎牛血清的高糖培养基，于体积分数5%CO₂，37 ℃培养箱中培养。待软骨细胞铺满培养皿表面至80%-90%，以1∶3传代，取第2代软骨细胞开始用于后续实验。

1.4.2  紫檀芪与H₂O₂体外处理软骨细胞  为了确定紫檀芪的最佳浓度，将软骨细胞接种于96孔板(2 000个细胞/孔)，待细胞贴壁后，使用含不同质量浓度紫檀芪(7.8-   32 000 μg/L)的培养基继续培养24h。向每个孔中添加   10 µL 5 g/L MTT溶液后，放置于37 ℃、黑暗环境中孵育  4 h。然后弃去培养基，并向每孔中加入150 µL 二甲基亚砜，震荡仪震荡10 min。使用Multiskan GO酶标仪于   570 nm波长处测定吸光度。重复3次实验后，选择浓度为125 μg/L的紫檀芪用于后续实验。

实验共分为4组：对照组，紫檀芪组(含有125 μg/L紫檀芪的培养基处理24 h)，H₂O₂组(0.2 mmol/L 的H₂O₂处理24 h)，H₂O₂+紫檀芪组(含有125 μg/L 紫檀芪的培养基预处理2 h后，更换含H₂O₂与125 μg/L 紫檀芪的培养基继续培养24 h)。处理完毕后应用MTT测定各组软骨细胞在570 nm波长处的吸光度值。

1.4.3  苏木精-伊红染色检测软骨细胞增殖能力  将细胞接种于24孔板爬片中(1×10⁴个细胞/孔)，按上述分组干预条件处理后，各组细胞用40 g/L多聚甲醛固定30 min，然后严格按照苏木精和伊红染色试剂盒说明书操作步骤，将细胞爬片置入苏木精-伊红染色液染色。随后通过梯度乙醇脱水后，将载玻片密封并应用倒置显微镜进行图像观测并拍摄。

1.4.4  FDA/PI染色检测软骨细胞增殖能力  将细胞接种于24孔板爬片中，按上述分组干预条件处理后，在黑暗环境下收集的各组软骨细胞与2 µmol/L FDA和2 µg/L PI在37 ℃下孵育5 min。用PBS快速冲洗掉载玻片的残余染料后，通过激光扫描共聚焦显微镜观测并获取图像。

1.4.5  番红O染色软骨细胞蛋白聚糖分泌情况  将细胞接种于24孔板爬片中，按上述分组干预条件处理后，各组细胞用40 g/L多聚甲醛固定30 min，然后严格按照试剂盒说明书操作步骤，进行番红O染色。通过梯度乙醇脱水后，将载玻片密封并应用倒置显微镜进行图像观测并拍摄。

1.4.6  RT-PCR检测  将细胞接种于6孔板爬片中(5×10⁴个细胞/孔)，按上述分组干预条件处理后提取细胞 RNA，并合成 cDNA，随后通过7900HT快速实时荧光定量PCR系统对聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原酶1基因进行定量检测。采用β-actin为内参，以2^-∆∆Ct法计算相对表达量。引物序列如下：聚集蛋白聚糖，上游引物5'-GGC AAC AAC TCA CCC AGC ACT G-3'，下游引物5'-AGG AGG CAC GGG A CGT AGT TC-3'，22 bp；Ⅱ型胶原酶1，上游引物5'-CCA AGT GGC CAG GTT CAA CG-3'，下游引物5'-GGG ATG AGG AAT GCG CCC TA-3'，20 bp；β-actin，上游引物5'-CAT GAG CCG AAG CTA AC CC-3'，下游引物5'-CTC CTA TGA CTT CTG CGT CTG G-3'，19 bp。

1.5  主要观察指标  ①紫檀芪对软骨细胞的最适浓度；②紫檀芪对软骨细胞增殖能力的影响；③紫檀芪对软骨细胞蛋白聚糖分泌的影响；④紫檀芪对软骨细胞特异性基因表达的影响。

1.6  统计学分析  所有数据均采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析，使用Graphpad 6.0和Word 2016软件作图，数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

随着人口老龄化的进展，骨关节炎的发生率越来越高，巨大的治疗费用已成为患者和医疗系统的沉重负担。在骨关节炎的晚期，目前主要的治疗方式是进行包括关节镜手术和人工关节置换在内的手术干预^[19-20]，为患者带来巨大痛苦。目前大量研究表明软骨细胞过度凋亡是诱发软骨退变损伤的一个十分重要的原因^[21]，而其中大量活性氧化物的生成是诱导细胞凋亡的主要因素之一。正常情况下，机体内活性氧的产生和清除系统处于动态平衡，过量的活性氧生成会打破体内氧化系统与抗氧化系统的平衡，导致氧化应激状态的发生进而引起关节软骨细胞凋亡，导致骨关节炎的发生^[22-23]。H₂O₂是活性氧的主要成分之一，具有稳定，且较易通过细胞膜等特点，因此通常被选用为体外构建细胞氧化应激模型的传导分子^[24]。此次实验的研究结果也表明，H₂O₂作用于人软骨细胞24 h能够有效诱导细胞的凋亡，降低细胞活性，造成氧化应激损伤。

国内外多项研究报告表明紫檀芪的抗氧化作用十分突出，其可能通过多个相互关联的机制产生抗氧化作用。MOON等^[25]研究发现紫檀芪可通过Bcl-2相关X蛋白的激活和表达，上调线粒体基质内锰超氧化物歧化酶的表达，抑制线粒体呼吸，减少过氧化物的生成。紫檀芪可作用于低密度脂蛋白受体1，减少活性氧的生成，下调基质金属蛋白酶的表达，减轻炎症反应^[26]。CHIOU等^[27]在研究抗氧化剂对直肠癌的作用时发现，紫檀芪可以引起血红素加氧酶1和谷胱甘肽还原酶的高表达，从而起到抗氧化、抗癌的作用，并且其作用比白藜芦醇强。同时，XUE等^[28]的研究也表明，紫檀芪可以通过激活Nrf2通路，抑制大鼠骨关节炎软骨细胞内活性氧的生成与炎症的进展。

上述研究结果表明紫檀芪具有较好的抗氧化、抗炎特性，是多种疾病的潜在治疗药物。而在此次实验亦取得了类似结果。作者发现紫檀芪可增强软骨细胞的活力和增殖，并减弱由H₂O₂诱导的软骨细胞凋亡，促进软骨细胞中蛋白聚糖的沉积，以及软骨分化标志基因聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原酶1高表达。聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原酶1是构成具有细胞外基质的重要成分，分泌增加有利于软骨合成和修复。这些结果表明紫檀芪的能够促进软骨细胞分化，抑制氧化应激所造成的软骨细胞凋亡，是防治骨关节炎的潜在药物。实验为深入开展紫檀芪对骨关节炎的作用机制的研究提供了一定的依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

紫檀芪(pterostilbene，PTE)：是紫檀、蓝莓、葡萄和花榈木等中药植物的有效成分之一，是白藜芦醇衍生的非黄酮类多酚化合物，两者具有相似的药理特性。紫檀芪是一种强大的天然抗氧化剂，已有证明能降低细胞氧化应激和活性氧的发生，并抑制不同细胞系过氧化氢酶的表达增加。

氧化应激：是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。

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软骨细胞是成熟软骨组织内唯一的细胞类型。它在软骨损伤以及重塑过程中起到维持内环境平衡的作用。二型胶原是细胞外基质的重要组成部分，二型胶原质和量的改变是软骨细胞丧失其正常生物特性的直接原因, 其变化与骨关节炎有着密切关系。

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