地龙提取物抑制核因子κB信号通路延缓椎间盘髓核细胞的退变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2983

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (2): 264-268.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2983

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

地龙提取物抑制核因子κB信号通路延缓椎间盘髓核细胞的退变

付远飞1，何升华2，赖居易2，孙志涛2，冯华龙2，蓝志明2

1广州中医药大学第四临床医学院，广东省深圳市 518033；2深圳市中医院，广东省深圳市 518033

收稿日期:2020-01-14 修回日期:2020-01-17 接受日期:2020-03-13 出版日期:2021-01-18 发布日期:2020-11-21
通讯作者: 何升华，硕士，主任医师，深圳市中医院，广东省深圳市 518033
作者简介:付远飞，女，贵州省遵义市人，汉族，广州中医药大学在读博士，主要从事脊柱疾病研究。
基金资助:
深圳市科技创新委员会项目(JCYJ20170307155040463)；广东省中医药局科研课题(20191276)

Pheretima extract ameliorates nucleus pulposus cell degeneration in the intervertebral disc by inhibiting nuclear factor-kappa B pathway

Fu Yuanfei1, He Shenghua2, Lai Juyi2, Sun Zhitao2, Feng Hualong2, Lan Zhiming2

1Fourth Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China; 2Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China

Received:2020-01-14 Revised:2020-01-17 Accepted:2020-03-13 Online:2021-01-18 Published:2020-11-21
Contact: He Shenghua, Master, Chief physician, Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China
About author:Fu Yuanfei, MD candidate, Fourth Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China
Supported by:
a grant from Shenzhen Science and Technology Innovation Committee, No. JCYJ20170307155040463; the Scientific Research Project of Guangdong Provincial Traditional Chinese Medicine Bureau, No. 20191276

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
椎间盘：位于相邻椎体之间的软组织结构，由髓核、纤维环及软骨终板三部分组成，各部分相互作用，使椎间盘能够承载负荷，并具有一定的活动度。
髓核细胞退变：髓核位于椎间盘中央，呈胶冻状，对椎间盘生理功能的维持具有重要作用。因年龄、遗传、创伤等因素可使髓核细胞发生退变，主要表现为细胞增殖减缓、凋亡及衰老增多，细胞外基质分解代谢失衡。

背景：髓核细胞炎症微环境是促进髓核退变的重要因素，炎症因子通过激活核因子κB信号通路产生炎症级联反应，形成恶性循环，加速髓核退变进程。抑制核因子κB信号通路活性，可延缓椎间盘退变进展。
目的：探讨地龙提取物对髓核细胞退变的作用机制。
方法：采用冷浸法提取地龙活性成分，CCK-8法检测0，25，50，100，200，400 mg/L地龙提取物对大鼠髓核细胞活性的影响，筛选合适药物浓度用于后续实验。采用肿瘤坏死因子α诱导髓核细胞退变模型，选取50，100，200 mg/L地龙提取物作用于细胞模型，通过Western blot法检测聚蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的蛋白表达；实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的mRNA表达；采用细胞免疫荧光法检测核因子κB信号通路关键分子P65的入核表达。
结果与结论：①与空白组(0 mg/L地龙提取物)比较，400 mg/L地龙提取物抑制髓核细胞活性，其余浓度对髓核细胞活性无明显影响，选用50，100，200 mg/L地龙提取物用于后续实验；②与正常组(不作处理)比较，模型组聚蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达水平降低，肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的蛋白和mRNA水平上调，P65入核增加；③与模型组比较，地龙提取物能增加细胞外基质成分聚蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达，下调炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的mRNA和蛋白表达水平，减少P65在核内的表达；④结果表明，地龙提取物能够减少炎症因子表达，增加细胞外基质合成，抑制核因子κB信号通路活性，地龙提取物可能通过作用于核因子κB信号通路进而延缓椎间盘髓核细胞退变。
https://orcid.org/0000-0002-0090-0901 (付远飞)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨, 椎间盘, 退变, 髓核细胞, 地龙, 提取物, 核因子κB, 因子

Abstract: BACKGROUND: Inflammatory microenvironment of nucleus pulposus cells is an important factor to promote nucleus pulposus degeneration. Inflammatory factors amplify the cascade of inflammation by activating the nuclear factor-κB signaling pathway to form a vicious cycle and accelerate the process of nucleus pulposus degeneration. It could delay the progression of intervertebral disc degeneration by inhibiting the activity of nuclear factor-κB signaling pathway.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of Pheretima extract on nucleus pulposus cell degeneration.
METHODS: Pheretima active ingredients were extracted by cold dipping. The cell counting kit-8 method was used to detect the effects of 0, 25, 50, 100, 200, 400 mg/L Pheretima extract on rat nucleus pulposus cell activity, and then suitable drug concentrations were chosen for following research. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) was used to stimulate nucleus pulposus cells to induce the nucleus pulposus cell degeneration model. Pheretima extracts (50, 100, 200 mg/L) were used to treat the cell model. Western blot was used to detect the expression of Aggrecan, Collagen II, TNF-α and interleukin-6. RT-qPCR was used to detect mRNA expression of TNF-α and interleukin-6. Immunofluorescence was used to detect the nuclear expression of P65 in the nucleus pulposus cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank group (0 mg/L), 400 mg/L Pheretima extract inhibited the activity of nucleus pulposus cells, and 50, 100, 200 mg/L extracts of Pheretima were used for subsequent experimental research. Compared with the normal group, the expression of Aggrecan and Collagen II in the model group was reduced, the protein and mRNA expression levels of TNF-α and interleukin-6 were up-regulated, and P65 expression increased in the nucleus. Compared with the model group, Pheretima extract could increase the expression of Aggrecan and Collagen II, down-regulate the protein and mRNA levels of TNF-α and interleukin-6, and reduce P65 expression in the nucleus. To conclude, Pheretima extract can reduce the expression of inflammatory factors, increase the synthesis of extracellular matrix and inhibit nuclear factor-κB pathway activity. Pheretima extract may ameliorate nucleus pulposus cell degeneration in the intervertebral disc via the nuclear factor-κB signaling pathway.

Key words: bone, intervertebral disc, degeneration, nucleus pulposus cells, Pheretima, extract, nuclear factor-κB, factor

中图分类号:

付远飞, 何升华, 赖居易, 孙志涛, 冯华龙, 蓝志明. 地龙提取物抑制核因子κB信号通路延缓椎间盘髓核细胞的退变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 264-268.

Fu Yuanfei, He Shenghua, Lai Juyi, Sun Zhitao, Feng Hualong, Lan Zhiming . Pheretima extract ameliorates nucleus pulposus cell degeneration in the intervertebral disc by inhibiting nuclear factor-kappa B pathway [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(2): 264-268.

图/表（结果） 5

2.1 地龙提取物对大鼠髓核细胞活性的影响如图1所示，地龙提取物作用髓核细胞24 h，与空白组比较，25，50，100，200 mg/L地龙提取物对髓核细胞活性无影响 (P=0.224，1.000，0.970，0.102)；当地龙提取物质量浓度为400 mg/L时，可明显减弱髓核细胞活性(P=0.011)。地龙提取物作用髓核细胞48 h，与空白组比较，25，50，100，200 mg/L地龙提取物对髓核细胞活性的影响差异无显著性意义(P=1.000，0.933，0.757，0.878)；当地龙提取物质量浓度为400 mg/L时，可明显减弱髓核细胞活性(P=0.003)。根据CCK-8实验结果，选取50，100，200 mg/L地龙提取物用于后续实验研究。

2.2 地龙提取物对髓核细胞Ⅱ型胶原和聚蛋白聚糖的作用与正常组比较，模型组Ⅱ型胶原的蛋白表达水平明显下降，差异有显著性意义(P=0.001)；50，100，200 mg/L地龙提取物组与模型组对比，均能明显增加Ⅱ型胶原的蛋白表达，且呈剂量依赖性(P=0.010，P=0.001，P < 0.001)。与正常组比较，模型组聚蛋白聚糖蛋白表达水平下调(P=0.039)；与模型组相比，50 mg/L地龙提取物组聚蛋白聚糖的蛋白表达无明显差异(P=0.132)，100 mg/L地龙提取物组聚蛋白聚糖的蛋白表达增加(P=0.018)，200 mg/L地龙提取物组聚蛋白聚糖的蛋白表达明显上调(P=0.002)。说明地龙提取物能显著提升髓核细胞Ⅱ型胶原和聚蛋白聚糖的蛋白表达水平，且质量浓度越高，蛋白表达水平越高，见图2。

2.3 地龙提取物对髓核细胞炎症因子白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的影响实时荧光定量PCR实验结果显示，与正常组比较，模型组白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的mRNA水平明显上调(fold=8.915，4.094，P均 < 0.001)；与模型组相比，50，100，200 mg/L地龙提取组均能下调白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的mRNA表达，差异均有显著性意义(fold=7.014，6.414，5.947，2.304，1.829，1.362，P均 < 0.001)，见图3。

Western blot实验结果表明，与正常组对比，模型组肿瘤坏死因子α与白细胞介素6的蛋白水平表达增加(P < 0.001)；与模型组相比，50，100，200 mg/L地龙提取组呈剂量依赖性降低肿瘤坏死因子α与白细胞介素6的蛋白表达 (P均 < 0.001)，见图4。

2.4 地龙提取物对P65入核的影响细胞免疫荧光实验结果显示，肿瘤坏死因子α诱导髓核细胞可明显促进P65入核，与正常组比较，模型组P65核内荧光表达明显增加(P < 0.001)；与模型组比较，50，100，200 mg/L地龙提取物组能减少P65入核(P=0.039，0.016，0.002)，且地龙提取物质量浓度越高，P65核内表达越少，见图5。

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引言

随着全球人口数量增多、人口老龄化加剧，腰背痛发病率逐年上升，严重影响生活质量，增加人们的经济负担[1]。现代医学认为，椎间盘退变是引起腰背痛的主要原因[2]。髓核细胞和细胞外基质的病理改变是椎间盘退变的起始因素，并加速椎间盘退变进程[3]。由于遗传、感染、生物力学负荷、吸烟等因素促使髓核细胞与相关免疫细胞分泌的促炎因子产生异常，介导椎间盘退变，这些促炎因子包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素1α/β、白细胞介素6、白细胞介素17、白细胞介素8等，其中肿瘤坏死因子α研究最为广泛[4-6]。椎间盘组织内炎症因子表达增加，导致相关信号通路激活，促使细胞外基质降解，促进免疫细胞浸润和激活，放大级联反应，进一步加速椎间盘退变的进程[7]。因此，改善髓核细胞炎症微环境，有助于维持髓核细胞的正常形态和功能，延缓椎间盘退变的进程。
中药地龙擅于通络活血，临床常用其缓解腰腿疼痛症状。现代药理研究显示地龙含有多种活性成分，如氨基酸、核苷酸、多肽、蛋白质类化合物等，具有抗炎、镇痛、降压等作用[8]。地龙多以蛋白、多肽类活性成分为主，因此，多采用低温提取及冷冻干燥的方法以获取地龙活性成分，减少温度对活性成分的破坏[9-10]。地龙活性成分对髓核细胞炎症微环境的作用暂未见报道，此次研究拟通过冷浸法提取地龙活性成分，采用真空冷冻干燥机制备地龙提取物冻干粉，以肿瘤坏死因子α刺激大鼠髓核细胞诱导椎间盘髓核细胞退变模型，将地龙提取物作用于细胞模型，观察细胞外基质和炎症因子的改变，检测炎症相关通路的变化，以探究地龙提取物延缓椎间盘退变的作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点于2019年6至12月在广州中医药大学中西医结合基础研究中心实验室完成。
1.3 材料大鼠髓核细胞(Dr. G. Kollias’s Lab赠送)；DMEM/F12培养基(美国Gibco)；胎牛血清(美国Gibco)；Recombinant Rat TNF-α(美国Peprotech)；CCK-8试剂盒(美国APExBIO)；细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天)；一步法凝胶制备试剂盒(杭州弗德)；Ⅱ型胶原蛋白鼠单克隆抗体、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6鼠单克隆抗体、FITC标记羊抗鼠IgG(北京博奥森)；聚蛋白聚糖、P65鼠单克隆抗体(美国Santa)；HRP标记抗兔IgG、HRP标记抗鼠IgG(上海康为世纪)；ChemiLminescent HRP Substrate(美国MILLIPORE)；反转录试剂盒、SYBR Green荧光染料(天津诺禾致源)；RNAiso Reagent(日本Takara)；大鼠GAPDH内参引物、引物合成(上海生工)；DAPI(上海索莱宝)真空冷冻干燥机(广州德祥)；多功能酶标仪(美国Bio-Rad)；垂直电泳仪、蛋白转膜仪(美国Bio-Rad)；全自动化学发光仪(上海天能)；普通PCR仪(美国Bio-Rad)、荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)；紫外分光光度计(美国Thermo)；激光共聚焦(德国蔡司)。
1.4 实验方法
1.4.1 地龙提取物冻干粉的制备[9] 地龙粗粉(广州市伟达中药饮片有限公司，批号：180901)50 g，加入250 mL 浓度为 0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)，4 ℃冷浸36 h，3 500 r/min 离心15 min，取上清，透析除盐，然后冻至干粉备用。
1.4.2 细胞培养、分组与给药采用含体积分数10%胎牛血清的DMED/F12培养基复苏细胞，然后将细胞置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，1 d换1次液，待细胞长至85%浓度时进行传代。取处于对数生长期的细胞进行消化，完全培养基终止消化后，离心重悬细胞，按5×107 L-1细胞浓度接种至96孔板、24孔板及10 cm培养皿中，恒温培养箱中培养24 h后，弃去培养基。96孔板中加入由完全培养基配制的地龙提取物，质量浓度分别为0，25，50，100，200，400 mg/L；24孔板和10 cm培养皿分别分为正常组、模型组及用药组，其中正常组加入完全培养基，模型组加入含20 μg/L的肿瘤坏死因子α完全培养基，用药组采用20 μg/L的肿瘤坏死因子α完全培养基中配制质量浓度为50，100，200 mg/L的地龙提取物，然后置于培养箱中培养。
1.4.3 CCK-8法检测地龙提取物对髓核细胞活性的影响采用CCK-8试剂盒检测地龙作用髓核细胞24，48 h后对髓核细胞活性的影响。96孔板加药后分别培养24 h和48 h，然后取出，每孔加入10 μL的CCK-8试剂，放入培养箱中培养2 h后于多功能酶标仪450 nm处检测吸光度(A)值。
1.4.4 Western blot法检测细胞外基质蛋白聚蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达地龙提取物作用24 h，取出培养皿，细胞消化离心，预冷PBS清洗细胞1次，然后加入裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min，离心20 min，取上清。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，样品经变性、电泳、转膜后脱脂奶粉室温封闭，一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后用相应HRP标记的二抗进行室温孵育，以β-Tubulin作为内参，孵育结束后采用ECL法显色，曝光，使用ImageJ对条带进行灰度值分析，以目的灰度值与内参灰度值的比值作为目标蛋白的相对表达量。

1.4.5 实时荧光定量PCR和Western blot检测髓核细胞中炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的mRNA水平和蛋白表达地龙提取物作用髓核细胞24 h后，从培养箱中取出细胞，弃去培养基，胰酶消化离心，PBS洗涤1次，然后采用Trozol法提取样品总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，采用反转录试剂盒说明书将RNA进行反转录，反转录所得cDNA按照相应比例稀释后，根据实时荧光定量PCR反应体系及反应条件进行实验，以GAPDH作为内参基因。所得数据根据仪器自带软件件计算阈值循环数 Ct值，计算目的基与内参基因的Ct值之差，以2-ΔΔCt 表示各组基因 mRNA 相对表达倍数，然后做统计学分析。Western blot根据1.4.2方法操作并计算蛋白相对表达量。引物序列见表1。

1.4.6 细胞免疫荧光检测髓核细胞P65入核地龙作用髓核细胞24 h后，取出24 孔板，PBS浸洗3次，每次3 min，然后每孔加入500 μL固定液，室温固定15 min，PBS浸洗3次，每次3 min，加入0.5%曲拉通打孔20 min，PBS浸洗3次，每次3 min，然后加入正常山羊血清室温封闭30 min。封闭结束后滴加一抗，然后置于4 ℃冰箱孵育过夜。一抗孵育结束后使用PBST浸洗3次，每次3 min，加入荧光二抗室温避光孵育1 h，然后PBST浸洗3次，每次3 min，滴加DAPI染色5 min，PBST浸洗3次，每次5 min，然后采用抗荧光淬灭剂进行封固，采用激光共聚焦进行拍照，并统计荧光入核情况。
1.5 主要观察指标 ①髓核细胞活性；②Ⅱ型胶原蛋白、聚蛋白聚糖、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α蛋白表达；③白细胞介素6、肿瘤坏死因子α的mRNA表达；④P65入核表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计分析，数据以x±s 表示。两独立样本均数比较，采用t检验；多组间均数比较，采用单因素方差分析。按α=0.05水准， P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

椎间盘是由中央髓核、外周纤维环和上下终板软骨组成的复合结构，髓核位于椎间盘中央，其独特的结构和功能对椎间盘生理形态的维持具有重要作用。正常的髓核组织中，髓核细胞分泌产生富含蛋白聚糖和胶原蛋白的细胞外基质成分[11]。在椎间盘退变中，髓核组织中细胞外基质合成和分解代谢失衡，主要表现为Ⅱ型胶原的表达逐渐减少，蛋白聚糖含量降低，导致椎间盘形态和结构改变，包括椎间盘高度降低、椎间盘塌陷、含水量减少及机械缓冲能力减弱[12-13]。髓核细胞炎症微环境是导致细胞外基质破坏的重要因素，炎症因子在退变髓核中积聚，通过激活炎症相关信号通路，产生炎症级联反应，形成恶性循环，加速髓核退变进程，因此，在椎间盘退变的相关研究中，不论是药效机制研究还是再生医学方面，研究者们多致力于改善髓核细胞微环境，维持髓核细胞正常形态与功能，以延缓椎间盘退变[14-17]。
研究报道，采用肿瘤坏死因子α可诱导髓核细胞发生炎症反应，导致髓核细胞外基质降解，促使髓核细胞凋亡及衰老[18]。此次实验结合文献报道和预实验结果，采用20 μg/L的肿瘤坏死因子α干预髓核细胞，可明显检测到细胞中炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6在转录水平和翻译水平的表达明显增高，细胞外基质成分Ⅱ型胶原和聚蛋白聚糖蛋白表达明显下降。
地龙是临床常用动物类中药，其低毒，易于获取，富含多种蛋白质、多肽类活性成分。研究表明，地龙蛋白复合物结合纳米技术可通过增加组织愈合和增加胶原蛋白修复，从而促进创口愈合[19]；在动物实验中发现地龙提取物可延长凝血及出血时间，以发挥抗凝血作用[20]。作者所在课题组采用腰突颗粒延缓椎间盘退变具有显著的临床疗效，机制研究显示腰突颗粒可显著延缓髓核细胞退变[21]。腰突颗粒中含有地龙，且在历代中医书籍中皆有地龙治疗腰腿疼痛的记载，但其作用机制尚不明确。此次实验通过冷浸法提取地龙活性成分，真空冷冻干燥制备地龙提取物冻干粉用于细胞实验研究。地龙提取物作用于正常髓核细胞后，通过CCK-8法检测地龙提取物对正常髓核细胞活性的影响，发现在25-200 mg/L质量浓度时，地龙提取物对髓核细胞活性无显著影响；在400 mg/L时髓核细胞活性明显降低。地龙提取物在400 mg/L出现了抑制细胞活性的现象，可能是因为高浓度时渗透性物质过多，对正常细胞产生了非特异性的影响。因此，基于CCK-8实验结果，此次实验采用50，100，200 mg/L质量浓度的地龙提取物用于后续实验研究。采用肿瘤坏死因子α诱导髓核细胞退变模型，地龙提取物干预细胞模型后，可降低髓核细胞模型中炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的mRNA水平和蛋白表达，显著增加细胞外基质成分Ⅱ型胶原和聚蛋白聚糖的蛋白表达，说明地龙提取物具有抑制炎症因子表达、重塑髓核细胞外基质的作用。
核因子κB是一种多功能转录因子，其介导的信号通路与炎症反应、细胞增殖及凋亡密切相关[22]。正常状态下，核因子κB以失活状态存在于细胞质中，当接收到炎症因子刺激信号时，核因子κB可迅速转录入核，调节靶基因的转录及表达[23]。研究表明，在退变的椎间盘组织中，核因子κB信号通路活化，促进椎间盘退变，抑制核因子κB信号通路可延缓椎间盘退变进程[24-26]。此次研究采用肿瘤坏死因子α诱导髓核细胞退变模型，细胞免疫荧光检测可见模型组P65入核增多，说明髓核细胞中核因子κB信号通路激活；采用不同质量浓度地龙提取物作用细胞模型，发现P65入核减少，且地龙提取物浓度越高，P65入核量越少，说明地龙提取物具有抑制核因子κB信号通路的作用，且呈现出浓度依赖方式。
综上所述，地龙提取物具有减少髓核细胞炎症因子的表达、重塑髓核细胞外基质、抑制核因子κB信号通路的作用，地龙提取物可能通过作用于核因子κB信号通路，延缓椎间盘髓核细胞退变。但地龙提取物中所含的具体活性成分及其发挥作用的具体靶点还需进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

地龙提取物抑制核因子κB信号通路延缓椎间盘髓核细胞的退变

Pheretima extract ameliorates nucleus pulposus cell degeneration in the intervertebral disc by inhibiting nuclear factor-kappa B pathway

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