腰突颗粒通过调控miR-221表达干预髓核细胞的增殖与凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3123

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (14): 2177-2182.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3123

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腰突颗粒通过调控miR-221表达干预髓核细胞的增殖与凋亡

何升华1，付远飞2，蓝志明1，孙志涛1，赖居易1，冯华龙1，郭子宾2，李盖2

1深圳市中医院，广东省深圳市 518033；2广州中医药大学第四临床医学院，广东省深圳市 518033

收稿日期:2020-05-22 修回日期:2020-05-23 接受日期:2020-06-12 出版日期:2021-05-18 发布日期:2020-12-30
通讯作者: 何升华，硕士，主任医师，深圳市中医院，广东省深圳市 518033
作者简介:何升华，男，1965年生，安徽省安庆市人，汉族，2003年安徽中医学院毕业，硕士，主任医师，主要从事脊柱病研究。
基金资助:
深圳市科技创新委员会项目(JCYJ20170307155040463)，项目负责人：何升华

Yaotu Granule deals with the proliferation and apoptosis of nucleus pulposus cells via regulating the expression of microRNA-221

He Shenghua1, Fu Yuanfei2, Lan Zhiming1, Sun Zhitao1, Lai Juyi1, Feng Hualong1, Guo Zibin2, Li Gai2

1Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China; 2Fourth Clinical Medical School, Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China

Received:2020-05-22 Revised:2020-05-23 Accepted:2020-06-12 Online:2021-05-18 Published:2020-12-30
Contact: He Shenghua, Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China
About author:He Shenghua, Master, Chief physician, Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China
Supported by:
a grant from Shenzhen Municipal Science and Technology Innovation Commission, No. JCYJ20170307155040463 (to HSH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
髓核：位于椎间盘中央，呈高度凝胶状，富含胶原蛋白和蛋白聚糖，髓核细胞位于凝胶状基质中，为圆形或椭圆形类软骨细胞，髓核细胞与细胞外基质对维持椎间盘生理功能具有重要作用。
microRNA：是一类非编码RNA，长度为21-25个核苷酸，与靶基因mRNA的3’非翻译区结合，从而介导靶基因mRNA降解、抑制翻译和mRNA不稳定。

背景：microRNA与椎间盘退变密切相关，腰突颗粒能显著延缓椎间盘退变进展。
目的：通过研究miR-221对髓核细胞增殖与凋亡功能的影响及腰突颗粒对miR-221的调控作用探讨腰突颗粒延缓椎间盘退变的机制。
方法：应用miR-221模拟物(模拟物组)及抑制剂(抑制剂组)转染大鼠髓核细胞，肿瘤坏死因子α诱导髓核细胞退变模型(模型组)，并分别应用100，200 mg/L腰突颗粒冻干粉处理退变的髓核细胞(腰突颗粒低、高浓度组)，模拟物+腰突颗粒组为同时加入miR-221模拟物和200 mg/L腰突颗粒冻干粉处理的髓核细胞。采用CCK-8法检测细胞增殖，TUNEL法检测凋亡情况，RT-qPCR检测miR-221的mRNA表达，Western blot检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的蛋白表达。
结果与结论：①与模拟物阴性对照组比较，模拟物组在24，48，72 h细胞增殖减缓(P < 0.05)，凋亡增多(P < 0.05)；与抑制剂阴性对照组比较，抑制剂组在24，48，72 h细胞增殖明显(P < 0.05)，凋亡减少(P < 0.05)；与正常组比较，模型组细胞增殖抑制(P < 0.05)，凋亡增加(P < 0.05)，miR-221表达上调(P < 0.05)；②与模型组比较，腰突颗粒低、高浓度组细胞明显增殖(P < 0.05)，细胞凋亡率下降(P < 0.05)，miR-221表达下调(P < 0.05)；与模拟物组比较，模拟物+腰突颗粒组细胞凋亡降低(P < 0.05)，细胞增殖改善(P < 0.05)，Bax蛋白表达下降(P < 0.05)，Bcl-2蛋白表达增高(P < 0.05)。③提示：miR-221影响髓核细胞增殖与凋亡，腰突颗粒通过下调miR-221的表达发挥延缓椎间盘退变的作用。
https://orcid.org/0000-0003-2435-0227 (何升华)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 中药, 腰突颗粒, miR-221, 髓核细胞, 增殖, 凋亡, 椎间盘, 脊柱

Abstract: BACKGROUND: MicroRNA is involved in intervertebral disc degeneration, and Yaotu Granule can significantly delay the progress of intervertebral disc degeneration.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Yaotu Granule in the proliferation and apoptosis of nucleus pulposus cells by regulating the expression of microRNA-221 (miR-221).
METHODS: MiR-221 mimics and inhibitors were transfected into rat nucleus pulposus cells to establish miR-221 overexpression and inhibition models. Tumor necrosis factor-α was used to induce nucleus pulposus cell degeneration model. The degenerated nucleus pulposus cells were treated with 100 and 200 mg/L Yaotu Granule freeze-dried powder (low and high dose groups). In the miR-221 mimics + Yaotu Granule group, miR-221 mimic and 200 mg/L Yaotu Granule freeze-dried powder were added. Cell counting kit-8 and TUNEL assay were used to detect the cell proliferation and apoptosis, RT-qPCR was used to detect mRNA expression of miR-221, and western blot was used to detect the expression of Bax and Bcl-2.
RESULTS AND CONCLUSION: MiR-221 mimics reduced cell prolifecation at 24, 48, 72 hours (P < 0.05) and promoted cell apoptosis at 48 hours (P < 0.05); miR-221 inhibitors had the opposite results (P < 0.05). Compared with the normal group, tumor necrosis factor-α inhibited cell proliferation, increased cell apoptosis, and upregulated miR-221 expression (all P < 0.05). Compared with the model group, low- and high-dose Yaotu Granules increased cell proliferation, reduced cell apoptosis, and downregulated miR-221 expression (all P < 0.05). Compared with the mimics group, cell proliferation improved, apoptosis rate decreased, the protein expression of Bax reduced, and the Bcl-2 protein expression up-regulated in the miR-221 mimics + Yaotu Granule group (all P < 0.05). To conclude, miR-221 has an effect on the proliferation and apoptosis of nucleus pulposus cells, and Yaotu Granule can delay the progression of intervertebral disc degeneration by downregulating the expression of miR-221.

Key words: Chinese herb, Yaotu Granule, miR-221, nucleus pulposus cells, proliferation, apoptosis, intervertebral disc, spine

中图分类号:

何升华, 付远飞, 蓝志明, 孙志涛, 赖居易, 冯华龙, 郭子宾, 李盖. 腰突颗粒通过调控miR-221表达干预髓核细胞的增殖与凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2177-2182.

He Shenghua, Fu Yuanfei, Lan Zhiming, Sun Zhitao, Lai Juyi, Feng Hualong, Guo Zibin, Li Gai . Yaotu Granule deals with the proliferation and apoptosis of nucleus pulposus cells via regulating the expression of microRNA-221[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(14): 2177-2182.

图/表（结果） 7

2.1 miR-221模拟物和抑制剂转染髓核细胞后对细胞增殖的影响采用miR-221模拟物及其阴性对照转染髓核细胞，CCK-8法检测细胞增殖，实验结果为数值资料，符合正态分布，方差齐，采用单因素方差分析。与正常组比较，24，48，72 h模拟物阴性对照组细胞增殖未见明显改变(P=0.805，P=0.821，P=0.460)；与模拟物阴性对照组比较，24，48，72 h模拟物组细胞增殖显著减缓(P=0.028，P=0.037，P < 0.001)。采用miR-221抑制剂及其阴性对照转染髓核细胞，与正常组相比，抑制剂阴性对照组细胞在24，48，72 h 3个时间段增殖无统计学意义(P=0.975，P=0.537，P=0.545)；与抑制剂阴性对照组相比，抑制剂组髓核细胞增殖明显(P=0.041，P=0.025，P=0.012)。说明在髓核细胞中miR-221影响细胞增殖活性。见图1。

2.2 miR-221模拟物和抑制剂转染髓核细胞后对细胞凋亡的作用各组髓核细胞分别干预48 h后采用TUNEL法检测miR-221对细胞凋亡的影响，实验结果为数值资料，符合正态分布，方差齐，采用单因素方差分析。与正常组比较，模拟物阴性对照组和抑制剂阴性对照组对髓核细胞凋亡无明显影响(P=0.396，P=0.964)；与模拟物阴性对照组比较，模拟物组髓核细胞凋亡显著增加(P < 0.001)；与抑制剂阴性对照组比较，抑制剂组细胞凋亡率下降，差异具有统计学意义(P=0.036)。见图2。结果说明miR-221过表达时促进细胞凋亡，miR-221表达抑制时减少细胞凋亡，通过靶向调控miR-221表达的可能是延缓髓核退变的关键分子。

2.3 腰突颗粒对退变髓核细胞增殖和凋亡的影响采用肿瘤坏死因子α诱导髓核细胞退变模型，腰突颗粒低、高浓度对退变髓核细胞进行干预，使用CCK-8法检测药物作用24，48，72 h细胞增殖情况。实验结果为数值资料，符合正态分布，方差齐，采用单因素方差分析。与正常组比较，模型组在24，48，72 h 3个时间段均会降低细胞增殖(P=0.023，P=0.037，P=0.002)；与模型组比较，腰突颗粒低浓度和高浓度组均能促进细胞增殖(P=0.013，P=0.043，P=0.001；P=0.001，P=0.005，P < 0.001)，见图3。TUNEL法检测腰突颗粒干预髓核退变模型后，对髓核细胞凋亡的影响。结果显示，与正常组比较，模型组细胞凋亡明显增多(P < 0.001)；与模型组比较，腰突颗粒低、高浓度组均能降低髓核细胞凋亡(P < 0.001，P < 0.001)，见图4。结果表明，腰突颗粒具有促进髓核细胞增殖，抑制髓核细胞凋亡的作用。

2.4 腰突颗粒调控miR-221表达并逆转了miR-221过表达对髓核细胞增殖和凋亡的影响腰突颗粒干预髓核退变细胞模型48 h后，采用RT-qPCR检测各组miR-221的表达。实验结果为数值资料，符合正态分布，方差齐，采用单因素方差分析。与正常组比较，模型组miR-221的mRNA表达上调(P < 0.001)；与模型组比较，腰突颗粒低、高浓度组可下调miR-221的表达水平，差异有统计学意义(P < 0.001，P < 0.001)。髓核细胞采用miR-221模拟物转染的同时加入腰突颗粒进行干预48 h，然后检测miR-221的mRNA表达水平。与模拟物组比较，模拟物+腰突颗粒组miR-221 mRNA水平显著下调(P < 0.001)。见图5。

采用miR-221模拟物转染的同时加入腰突颗粒进行干预48 h后，检测髓核增殖、细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达情况。实验结果为数值资料，符合正态分布，采用两独立样本t 检验进行统计分析。实验结果表明，与模拟物组比较，模拟物+腰突颗粒组细胞凋亡减少(P < 0.001)，细胞增殖增加(P=0.011)，见图6。Western blot实验结果表明，与模拟物阴性对照组比较，模拟物组Bax蛋白表达增高(P=0.001)，Bcl-2蛋白表达下降(P=0.007)；与模拟物组比较，模拟物+腰突颗粒组中Bax蛋白表达降低(P=0.002)，Bcl-2蛋白表达上调(P=0.003)。见图7。结果表明腰突颗粒能够下调miR-221的表达，并能逆转 miR-221过表达引起的细胞增殖与凋亡的改变。

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引言

腰椎间盘退变是引起下腰痛的重要原因，是临床常见的慢性致残性疾病，严重影响人们的生活质量，增加社会经济负担[1-2]。椎间盘作为脊柱的重要组成部分，在椎体连接与脊柱运动中具有重要作用。椎间盘由三部分组成，包括外层纤维环、中央髓核及覆盖在纤维环和髓核上下的软骨终板[3]。在髓核组织中，髓核细胞分泌的蛋白聚糖和胶原蛋白是形成细胞外基质的主要成分，使得髓核组织呈现出高度水合的凝胶状[4]。髓核组织的病理改变是椎间盘退变的起始因素，并加速椎间盘退变进程[5]。椎间盘退变机制的研究虽尚不完全，但机械负荷、年龄、环境或遗传等因素引起的髓核细胞外基质的分解代谢异常、炎症因子的影响、髓核细胞早衰、增殖减缓以及髓核细胞过度凋亡在椎间盘退变中具有重要的作用。髓核细胞增殖和凋亡引起髓核细胞外基质代谢紊乱，针对髓核细胞增殖和凋亡的干预措施能够显著延缓椎间盘退变进程[6-7]。
microRNA(miRNA，miR)是一类非编码RNA，长度为21-25个核苷酸，与靶基因mRNA的3’非翻译区结合，从而介导靶基因mRNA降解、抑制翻译和mRNA不稳定[8-9]。越来越多的研究显示出miRNA与椎间盘退变密切相关，靶向miRNA可能具有延缓椎间盘退变的作用。相关研究表明，miR-221作用于细胞增殖与凋亡途径影响多种疾病的进展[10-11]。在椎间盘退变中抑制miR-221的表达，可显著减缓椎间盘退变程度[12]。椎间盘退变过程中髓核细胞增殖与凋亡的病理改变是影响椎间盘退变的重要因素，但miR-221是否通过作用于髓核细胞增殖与凋亡进而影响椎间盘退变进程尚待研究。
目前，中医药在延缓椎间盘退变的相关研究中已显示出明显疗效，中药能够通过增加髓核细胞外基质成分、降低椎间盘内炎症因子的表达以及抑制髓核细胞凋亡等方面发挥延缓椎间盘退变的作用[13-15]。此次研究中所用腰突颗粒为本课题组在临床中常用于治疗腰椎间盘突出症的经验方，前期研究显示，腰突颗粒具有延缓椎间盘退变的作用，但其对髓核细胞相关miRNA的作用尚不明确[16-17]。
此次实验通过采用miR-221模拟物及抑制剂转染大鼠髓核细胞，观察髓核细胞增殖与凋亡情况，并采用腰突颗粒进行干预，探究miR-221对髓核细胞增殖与凋亡的作用，以及腰突颗粒对退变髓核细胞中miR-221表达的影响，为今后研发新药以延缓椎间盘退变提供依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点于2018年6月至2019年8月在深圳市中医院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 药材实验所用药材均由深圳市中医院中药房提供。
1.3.2 细胞大鼠髓核细胞由Dr. G. Kollias’s Lab赠送。
1.3.3 试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；CCK-8试剂盒(美国APExBIO公司)；microRNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂(日本Takara公司)；引物设计(上海生工公司)；microRNA转染试剂(上海吉凯公司)；miR-221模拟物、抑制剂(广州锐博公司)；Recombinant Rat TNF-α(美国Peprotech公司)；一步法凝胶制备试剂盒(杭州弗德公司)；细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天公司)；Bax、Bcl-2鼠单克隆抗体(北京博奥森)；HRP标记抗鼠IgG(上海康为世纪)；DAPI(上海索莱宝公司)。
1.3.4 仪器真空冷冻干燥机(广州德祥公司)；旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)；多功能酶标仪、垂直电泳仪、蛋白转膜仪、普通PCR仪、荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)；全自动化学发光仪(上海天能)；紫外分光光度计(美国Thermo)；荧光显微镜(德国蔡司公司)。
1.4 方法
1.4.1 腰突颗粒冻干粉制备腰突颗粒冻干粉制备方法参考中药冻干粉相关文献并结合预实验对方法进行优化[18]。具体制备方法如下：腰突颗粒(独活20 g、桑寄生20 g、牛膝15 g、盐杜仲15 g、熟地黄15 g、黄芪20 g、茯苓15 g、川芎15 g、地龙15 g、当归10 g、白芍10 g、醋三棱10 g、醋莪术10 g、醋延胡索10 g、土鳖虫10 g、蜈蚣3条、甘草5 g)一剂，加入10倍体积的纯水进行微波提取30 min，过滤后将滤渣再加入10倍体积水，然后微波提取30 min，合并2次滤液，采用冷冻离心机进行离心，取上清，旋转蒸发仪减压浓缩，将浓缩液置于-80 ℃冰箱预冻24 h，然后放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，待干燥后将冻干粉用容器收集，置于4 ℃冰箱中保存备用。
1.4.2 细胞培养与分组大鼠髓核细胞采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基传代培养。细胞融合至85%时胰酶消化细胞后离心重悬，调整细胞悬液浓度为5×107 L-1，96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液，24孔板中每孔加入1 mL细胞悬液，6 cm培养皿中每皿加入4 mL细胞悬液。实验共分为9组：①正常组：未经干预，只采用完全培养基培养的髓核细胞；②模拟物阴性对照组：加入20 nmol/L miR-221模拟物阴性对照处理的髓核细胞；③模拟物组：加入20 nmol/L miR-221模拟物处理的髓核细胞；④抑制剂阴性对照组：加入20 nmol/L miR-221抑制剂阴性对照处理的髓核细胞；⑤抑制剂组：加入20 nmol/L miR-221抑制剂处理的髓核细胞；⑥模型组：加入20 μg/L 肿瘤坏死因子α处理的髓核细胞；⑦腰突颗粒低浓度组：同时加入20 μg/L 肿瘤坏死因子α和100 mg/L腰突颗粒冻干粉处理的髓核细胞；⑧腰突颗粒高浓度组：同时加入20 μg/L 肿瘤坏死因子和200 mg/L腰突颗粒冻干粉处理的髓核细胞；⑨模拟物+腰突颗粒组：同时加入20 nmol/L miR-221模拟物和200 mg/L腰突颗粒冻干粉处理的髓核细胞。以上组中需转染细胞在转染后48 h对转染效率进行检测。
1.4.3 miR-221表达检测采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-221的mRNA表达。收集各组细胞，参照microRNA提取试剂盒说明书进行microRNA提取。提取完成后对各组样品进行反转录获得cDNA，应用荧光定量试剂与miR-221的引物进行RT-qPCR，以U6作为内参。引物序列如下：miR-221-F： GTT CGT GGG AGC TAC ATT GTC TGC，miR-221-R：GTG CAG GGT CCG AGG T；U6-F：CTC GCT TCG GCA GCA CA，U6-R：AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT 。采用2-ΔΔCt 表示各组基因mRNA相对表达倍数，然后做统计学分析。
1.4.4 细胞增殖检测各组细胞采用96孔板进行培养。培养24，48，72 h后采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于恒温培养箱中培养2 h后取出，采用多功能酶标仪在450 nm波长处检测吸光度。
1.4.5 细胞凋亡检测采用一步法TUNEL检测试剂盒检测细胞凋亡情况。根据一步法TUNEL检测试剂盒说明书对各组细胞进行处理，细胞核采用DAPI染色，然后采用荧光显微镜进行荧光拍照，计数各组荧光表达阳性细胞与总细胞数，以阳性细胞数与总细胞数比值计算各组细胞凋亡率。
1.4.6 细胞凋亡相关蛋白检测采用免疫蛋白印迹(Western blot)检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的蛋白表达变化。采用蛋白提取试剂盒对各组细胞进行总蛋白提取，提取过程保持在冰上操作，然后采用BCA试剂盒检测各组样品蛋白浓度，根据蛋白浓度对各组蛋白体积进行调整，使各组蛋白浓度保持一致，加入上样缓冲液后将各组样品放入100 ℃恒温培养箱中变性5 min。变性后的样品经垂直电泳、转膜、封闭后进行一抗孵育，各组均以β-Tubulin为内参，将膜置于4 ℃冰箱过夜，次日采用相应种属的HRP标记二抗进行室温孵育，孵育结束后采用ECL法显色曝光。采用ImageJ软件对各组条带进行灰度值分析，目的蛋白相对表达量为目的条带灰度值与内参条带灰度值之比。
1.5 主要观察指标各组细胞增殖与凋亡检测；各组细胞miR-221表达；各组细胞凋亡相关蛋白表达比较。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件对实验数据进行统计分析，数值资料采用x±s表示，两独立样品均数比较采用t 检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，按α=0.05水准，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前，关于椎间盘退变的研究多以髓核细胞及细胞外基质的病理改变为主，促进髓核细胞增殖，抑制髓核细胞凋亡、早衰，促进细胞外基质的表达，对于维持髓核组织的正常形态及功能具有重要的作用，能够显著延缓椎间盘退变的发展[19-21]。越来越多的研究表明，miRNA与椎间盘髓核细胞的正常形态与功能紧密相关，如miR-499a-5p在退变髓核中下调，miR-499a-5p通过靶向SOX4发挥影响髓核细胞凋亡及髓核细胞外基质降解；上调髓核细胞中miR-129-5p的表达可促进细胞增殖，抑制细胞衰老及凋亡；在退变髓核细胞中，miR-573表达下调，采用miR-573过表达可下调Bax蛋白表达，从而抑制髓核细胞凋亡[19-21]。说明在椎间盘退变的研究中，靶向髓核细胞miRNA具有修复椎间盘的作用。已有研究显示miR-221参与椎间盘退变进程，但对其髓核细胞增殖与凋亡的作用尚不明确，因此，该研究中采用miR-221模拟物及抑制剂转染髓核细胞，以探究miR-221对髓核细胞增殖与凋亡的影响。
实验结果表明，miR-221模拟物转染髓核细胞，促使髓核细胞中高表达miR-221，CCK-8检测结果显示在24，48，72 h 3个时间段细胞增殖均减缓，TUNEL法结果显示细胞凋亡增加，说明miR-221可影响髓核细胞增殖与凋亡，为进一步验证miR-221对髓核细胞的作用，采用miR-221抑制剂转染髓核细胞，观察到细胞增殖和凋亡的改变与miR-221模拟物组相反，即miR-221抑制剂可促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。椎间盘退变相关研究证实，椎间盘退变与髓核细胞增殖及凋亡异常改变密切相关，促进髓核细胞增殖和抑制细胞凋亡的策略具有延缓椎间盘退变的作用[25-26]。此次实验结果表明了miR-221在髓核细胞中的表达抑制了髓核细胞的增殖，促进了髓核细胞凋亡，因此靶向miR-221具有延缓髓核退变的作用。
腰椎间盘退变继发腰椎间盘突出，引起腰背疼痛及下肢放射痛，中医认为，腰为肾之府，肝肾亏虚，腰府失养，外邪侵袭致脉络瘀阻，不通则痛，不荣则痛[27-28]。中医药在缓解腰痛症状、恢复腰椎功能方面已显示出明确疗效[29-31]。此次研究所用腰突颗粒具有补益肝肾、活血通络的功效，已在临床使用20余年。临床研究中显示，腰突颗粒能够显著缓解腰椎间盘突出症患者腰腿痛症状，治疗3个月有效率可达96.67%；动物实验表明，腰突颗粒可通过降低兔椎间盘退变模型髓核组织中Fas/FasL基因表达，从而延缓椎间盘退变；采用腰突颗粒干预人髓核细胞证实了腰突颗粒可降低髓核细胞中炎症因子的表达[16，32-33]。此次实验利用炎症因子肿瘤坏死因子α干预髓核细胞诱导髓核细胞退变模型，肿瘤坏死因子α浓度以预实验结果确定，与正常组比较，模型组中细胞增殖减缓、细胞凋亡增多，表明髓核细胞退变模型成立，与文献报道具有一致性[34]。采用腰突颗粒干预髓核细胞24，48，72 h后发现，与模型组比较，腰突颗粒低浓度组和高浓度组髓核细胞增殖明显，细胞凋亡减少，miR-221 mRNA表达下调，且呈现浓度依赖趋势，表明了腰突颗粒具有延缓椎间盘退变的作用。为了进一步明确腰突颗粒是否通过靶向miR-221发挥了促增殖和抗凋亡的作用，研究采用miR-221模拟物与200 mg/L腰突颗粒同时干预髓核细胞，发现与模拟物组比较，模拟物+腰突颗粒组细胞凋亡减少，细胞增殖增加，促凋亡蛋白Bax的蛋白表达下降，抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达增加，说明腰突颗粒逆转了miR-221过表达对髓核细胞增殖与凋亡的影响，腰突颗粒能够通过靶向miR-221发挥延缓椎间退变的作用。
综上所述，miR-221具有抑制髓核细胞增殖与促进髓核细胞凋亡的作用，腰突颗粒通过靶向调控miR-221的表达，逆转了髓核细胞退变进程，具有延缓椎间盘退变的作用。此次实验尚未涉及miR-221靶基因研究以及动物实验水平的验证，将在下一步实验中进行深入探讨。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

腰突颗粒通过调控miR-221表达干预髓核细胞的增殖与凋亡

Yaotu Granule deals with the proliferation and apoptosis of nucleus pulposus cells via regulating the expression of microRNA-221

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