补肾壮督方含药血清对髓核细胞线粒体凋亡通路的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2644

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (23): 3643-3648.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2644

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补肾壮督方含药血清对髓核细胞线粒体凋亡通路的影响

周文明¹，林一峰²，张震³，迟利业¹

¹广州中医药大学，广东省广州市 510405；²广州中医药大学附属骨伤科医院，广东省广州市 510240；³深圳市沙井人民医院，广东省深圳市 518104

收稿日期:2019-08-26 修回日期:2019-08-27 接受日期:2019-10-09 出版日期:2020-08-18 发布日期:2020-07-30
通讯作者: 林一峰，主任医师，博士生导师，广州中医药大学附属骨伤科医院，广东省广州市 510240
作者简介:周文明，男，1983年生，湖北省荆门市人，汉族，广州中医药大学在读博士，主要从事中医药防治脊柱退行性疾病的临床与实验研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81574000)

Effect of Bushen Zhuangdu Fang serum on mitochondrial apoptotic pathway of nucleus pulposus cells

Zhou Wenming¹, Lin Yifeng², Zhang Zhen³, Chi Liye¹

¹Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; ²Orthopaedic and Traumatic Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China; ³Shenzhen Shajing People’s Hospital, Shenzhen 518104, Guangdong Province, China

Received:2019-08-26 Revised:2019-08-27 Accepted:2019-10-09 Online:2020-08-18 Published:2020-07-30
Contact: Lin Yifeng, Chief physician, Doctoral supervisor, Orthopaedic and Traumatic Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China
About author:Zhou Wenming, MD candidate, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81574000

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

线粒体凋亡通路：又称为内源性凋亡通路，可以通过多种应力刺激激活，导致线粒体外膜改变、线粒体DNA损伤等，这些改变将最终导致线粒体外膜通透性的增加，正常情况下存在于线粒体内外膜之间的凋亡相关蛋白将扩散至细胞质中，从而导致细胞凋亡的发生。

中药血清药理方法：是指动物灌胃给予中药及制剂，经吸收进入机体血液循环，在一定时间内采集血液，分离所得血清中必定含有一定量的该药物成分，此时的血药浓度反映了机体的真实血药浓度，将此血清加入到体外细胞培养体系，观察其药理作用。

背景：线粒体凋亡通路是细胞凋亡中的重要通路，前期动物实验发现补肾壮督方可通过抑制线粒体凋亡通路改善椎间盘退变，但其作用机制还有待研究。

目的：观察补肾壮督方含药血清对人髓核细胞线粒体凋亡通路关键蛋白的影响，探讨其改善椎间盘退变的机制。

方法：①37只SD雄性大鼠，随机分为正常组、低剂量中药组[0.506 g/(kg•d)]、中剂量中药组[1.012 g/(kg•d)]及高剂量中药组[2.024 g/(kg•d)]，连续灌胃2周，灌胃结束后制备含药血清；②人髓核细胞随机分为正常组、模型组、低剂量含药血清组、中剂量含药血清组、高剂量含药血清组，模型组用200 μmol/L H₂O₂处理6 h，正常组不进行任何处理，低、中、高剂量含药血清组造模后用体积分数为2%含药血清干预48 h。透射电镜观察髓核细胞的超微结构，流式细胞术检测髓核细胞凋亡率和线粒体膜电位，qPCR和Western blot检测Apaf1、Bcl-2、Bax及Cytc的表达。

结果与结论：①与正常组相比，模型组出现明显的细胞凋亡形态特征，髓核细胞凋亡率显著增加(P < 0.05)，Apaf1、Cytc、Bax mRNA及蛋白表达量均显著增加(P < 0.05)，线粒体膜电位、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量显著下降(P < 0.05)；②补肾壮督方含药血清干预后，髓核细胞凋亡率明显减少(P < 0.05)，Apaf1、Cytc、Bax mRNA及蛋白表达量均明显下降(P < 0.05)，线粒体膜电位、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量显著增加 (P < 0.05)；③补肾壮督方含药血清可有效抑制髓核细胞凋亡，并呈剂量依赖性，可能通过减少Apaf1、Cytc、Bax蛋白及mRNA表达，增加Bcl-2蛋白及mRNA表达，抑制线粒体凋亡通路，从而改善椎间盘退变。

ORCID: 0000-0002-6045-9062(林一峰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 椎间盘退变, 髓核细胞凋亡, 线粒体通路, 含药血清, 补肾壮督方

Abstract:

BACKGROUND: The mitochondrial apoptotic pathway is an important pathway in cell apoptosis. Previous studies have found that Bushen Zhuangdu Fang can improve intervertebral disc degeneration by inhibiting the mitochondrial apoptotic pathway in animal experiments. However, its mechanism of action is to be clarified.

OBJECTIVE: To observe the effect of serum containing Bushen Zhuangdu Fang on mitochondrial apoptotic pathway key proteins of human nucleus pulposus cells, and to explore the mechanism by which this drug-containing serum improves intervertebral disc degeneration.

METHODS: Thirty-seven male Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank group, low-dose Chinese medicine group (0.506 g/kg per day), medium-dose Chinese medicine group (1.012 g/kg per day) and high-dose Chinese medicine group (2.024 g/kg per day). After 2 weeks of continuous administration, drug-containing serum was prepared. Human nucleus pulposus cells were randomly divided into normal group, cell model group, low-dose drug-containing serum group, medium-dose drug-containing serum group, and high-dose drug-containing serum group. The cell model group was treated with 200 μmol/L H₂O₂ for 6 hours, and the normal group received no treatment. The three drug-containing serum groups were treated with corresponding treatments for 48 hours. The pathological changes of nucleus pulposus cells were observed by transmission electron microscopy. Apoptotic rate of nucleus pulposus cells was detected by flow cytometry and mitochondrial membrane potential was detected by flow cytometry. Apaf1, Bcl-2, Bax and Cytc expressions were detected by real-time quantitative PCR and western blot assay.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal group, the apoptotic rate of nucleus pulposus cells with obvious apoptotic morphology was significantly increased (P < 0.05), the expression of Apaf1, Cytc, and Bax were significantly increased at mRNA and protein levels (P < 0.05), and the mitochondrial membrane potential and expression of Bcl-2 mRNA and protein were significantly decreased in the cell model group (P < 0.05). After treatment with drug-containing serum, the apoptotic rate of nucleus pulposus cells decreased significantly (P < 0.05), the expression of Apaf1, Cytc, Bax and their proteins decreased significantly (P < 0.05), and the mitochondrial membrane potential, Bcl-2 and their proteins increased significantly (P < 0.05). Therefore, the serum containing Bushen Zhuangdu Fang can effectively inhibit apoptosis of nucleus pulposus cells in a dose-dependent manner. The drug-containing serum may alleviate intervertebral disc degeneration by reducing the expression of Apaf1, Cytc and Bax and increasing the expression of Bcl-2 at protein and gene levels, and inhibiting the mitochondrial apoptotic pathway.

Key words: intervertebral disc degeneration, nucleus pulposus cell apoptosis, mitochondrial pathway, drug-containing serum, Bushen Zhuangdu Fang

中图分类号:

周文明, 林一峰, 张震, 迟利业. 补肾壮督方含药血清对髓核细胞线粒体凋亡通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(23): 3643-3648.

Zhou Wenming, Lin Yifeng, Zhang Zhen, Chi Liye. Effect of Bushen Zhuangdu Fang serum on mitochondrial apoptotic pathway of nucleus pulposus cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(23): 3643-3648.

图/表（结果） 9

2.1 髓核细胞超微结构正常组髓核细胞的细胞膜结构完整，细胞质内如线粒体、内质网、溶酶体等细胞器清晰，细胞核形态不规则；模型组细胞膜不完整，细胞肿胀增大，细胞核碎裂，浓缩集聚，细胞器不清晰，并可见大量凋亡小体；低剂量含药血清组细胞核形态不规则，细胞质内细胞器如内质网、线粒体等欠清晰，并可见少量凋亡小体；中剂量含药血清组细胞膜完整，细胞质内细胞器清晰，偶见少量凋亡小体；高剂量含药血清组细胞膜完整，胞质内细胞器清晰可见，未见凋亡小体，见图1。

2.2 髓核细胞凋亡率与正常组相比，模型组细胞凋亡率明显增高(P < 0.05)；高、中、低剂量含药血清组细胞凋亡率均明显减少(P < 0.05)；3个剂量组之间相互比较，高、中剂量组细胞凋亡率少于低剂量组(P < 0.05)，但高、中剂量组间差异无显著性意义，见表2及图2。

2.3 髓核细胞线粒体膜电位模型组及低、中、高剂量含药血清组线粒体膜电位均显著低于正常组(P < 0.05)，低、中、高剂量含药血清组线粒体膜电位均高于模型组(P < 0.05)，中、高剂量含药血清组均高于低剂量含药血清组(P < 0.05)，中、高剂量含药血清组比较差异无显著性意义，见表3及图3。

2.4 各组髓核细胞Apaf1、Bax、Bcl-2及Cytc蛋白表达量与正常组相比，模型组Apaf1、Bax及Cytc表达量显著增加(P < 0.05)，而Bcl-2表达量显著减少(P < 0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量含药血清组Apaf1、Bax及Cytc表达量显著减少(P < 0.05)，而Bcl-2表达量显著增加(P < 0.05)；高剂量含药血清组Apaf1、Bax及Cytc表达量明显低于低、中剂量含药血清组(P < 0.05)，低、中剂量含药血清组之间差异无显著性意义；高剂量含药血清组Bcl-2表达量明显高于低、中剂量含药血清组(P < 0.05)，低、中剂量组之间差异无显著性意义，见表4及图4。

2.5 各组髓核细胞Apaf1、Bcl-2、Bax及Cytc mRNA表达量与正常组相比，模型组Apaf1、Bax及Cytc mRNA表达量显著增加(P < 0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量含药血清组中Apaf1、Bax及Cytc mRNA表达量显著减少(P < 0.05)，低、中、高剂量含药血清组之间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；与正常组相比，模型组Bcl-2 mRNA表达量显著减少(P < 0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量含药血清组Bcl-2 mRNA表达量明显增加(P < 0.05)，见表5和图5。

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引言

椎间盘退行性变与临床上多种疾病有关，包括颈椎病、腰椎间盘突出症、椎管狭窄症以及脊柱畸形等^[1]，据研究显示椎间盘退行性变在中老年人群中患病率高达90%^[2]。髓核细胞凋亡所引起的细胞数量减少是椎间盘退行性变的重要病理基础^[3-4]，但是导致髓核细胞凋亡的具体机制尚不清楚。在哺乳动物中，线粒体是调节大部分凋亡通路的主要细胞器，是细胞凋亡的调控中心。研究表明，线粒体凋亡通路在髓核细胞凋亡中发挥着重要作用^[5-6]。线粒体凋亡通路被多种因素激活后，导致线粒体外膜通透性增加，引起细胞色素C释放进入胞质，与细胞凋亡激活因子Apaf-1结合，随后活化Caspase-9前体并激活Caspase-3，引起级联反应导致细胞凋亡。Bcl-2及Bax作为Bcl-2蛋白家族成员，在线粒体凋亡通路中分别发挥抑制凋亡和促进凋亡的作用^[7]。孙鹏等^[8]应用益气化瘀方拆方含药血清干预研究发现，化瘀方、益气方、益气化瘀方均可降低椎间盘软骨细胞线粒体凋亡通路中关键蛋白Bax、Caspase-8的表达，上调Bcl-2的表达，从而延缓椎间盘退变。

现代中医通过探索认为椎间盘退变病机属于本虚标实，而肾阳不足、督脉气衰是其病程中常见的证型^[9]。中药在治疗椎间盘退行性疾病方面具有毒副作用小以及整体调节的优势。补肾壮督方是林一峰教授在阳和汤基础上进行化裁加减形成的经验方，具有温肾通督的功效，在治疗椎间盘退行性疾病方面，临床疗效显著^[9-10]。因此，该研究采用H₂O₂诱导人髓核细胞建立髓核细胞凋亡模型，观察补肾壮督方含药血清对髓核细胞凋亡及线粒体凋亡通路的影响，为临床治疗椎间盘退行性疾病提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。

1.2 时间及地点于2018年3月至2019年3月在广州中医药大学岭南医学研究中心中医骨伤科学实验室及广州中医院药大学动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 8周龄SPF级雄性SD大鼠37只，体质量(280±40) g，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK(粤)2013-0034。该实验经广州中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.3.2 实验药物补肾壮督方药物组成如下：鹿角胶10 g、海马5 g、黄芪30 g、熟地黄20 g、细辛4 g。以上中药由广州中医药大学第三附属医院制剂室提供。按上述比例将饮片制成粗粉(除鹿角胶外)，煎药取汁，将鹿角胶烊化后溶入药液中，用蒸发仪调整药物质量浓度至1.8 g/mL，常温冷却后置于冰箱中保存备用。

1.3.3 实验试剂及仪器水合氯醛(国药集团公司)；电镜固定液(武汉谷歌公司)；Anti-Bax抗体、Anti-Bcl-2抗体、Anti-Apaf1抗体，Anti-Cytochrome C抗体(艾博抗公司)；Annexin V-APC Apoptosis Detection Kit(凯基公司)；JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit(欣博盛生物科技有限公司)；Tris-base(上海生工有限公司)；双丙烯酰胺(Genview公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo公司)； Trizol(TAKARA公司)；Bestar^TM qPCR RT kit(DBI公司)；Bestar^TM qPCR MasterMix(DBI公司)；DYY-6C恒压恒流电泳仪(北京市六一仪器厂)；Hema TGL-16R冷冻高速离心机(珠海黑马公司)；JY 92-IIN超声破碎仪(新芝有限公司)；MP-8001 SDS-PAGE垂直电泳槽(北京凯元伯乐公司)；Bio-5000扫描仪(上海中晶公司)；MULTISKAN MK3 Thermo酶标仪(美国Thermo公司)；HT7700透射电子显微镜(日本Hitachi公司)；FACSCanto Ⅱ流式细胞仪(美国BD公司)；DYY-2C核酸电泳仪(北京六一仪器)；Mx3000P Stratagene Real time PCR仪(Agilent公司)。

1.3.4 细胞人髓核细胞购自美国Sciencell公司。

1.4 实验方法

1.4.1 含药血清的制备 37只SD大鼠适应性喂养1周后，按随机数字法分为4组：低、中、高剂量中药组，每组10只，剩余7只作为正常组。按照正常成人用药剂量，根据动物与人之间等效剂量换算^[11]，低、中、高剂量组分别给予1倍 [0.506 g/(kg·d)]、2倍[1.012 g/(kg·d)]、4倍[2.024 g/(kg·d)]药液，上、下午各灌胃1次，正常组则灌胃等量生理盐水，连续灌胃2周；末次灌胃2 h后，水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，静置2 h，离心机离心15 min，分离血清，水浴锅灭菌，0.22 μm滤膜过滤，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 髓核细胞培养将冻存管在预热的水浴锅中解冻，将细胞转移至15 mL离心管内，滴加预热的NPCM完全培养基，离心后吸去上清，然后用NPCM完全培养基重悬细胞，将细胞悬液加入细胞培养皿内，放入37 ℃含体积分数为5%CO₂的培养箱内进行培养48 h，吸掉旧培养液，PBS洗涤细胞，加入胰酶消化，于倒置显微镜下观察细胞将要分离而呈现圆粒状时，轻拍培养瓶壁使大部分细胞脱落，加入适量含体积分数为5%胎牛血清的新鲜培养基以终止胰酶的消化作用，吸管打散细胞团块，混和均匀，依稀释比例1∶2转移至新的培养瓶中进行传代。

1.4.3 细胞分组干预将髓核细胞随机分为正常组、模型组、低剂量含药血清组、中剂量含药血清组、高剂量含药血清组。将第4代髓核细胞悬液以8×10⁸ L^-1接种于6孔板，每孔2 mL，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养过夜，次日进行造模，模型组用200 μmol/L H₂O₂处理6 h，正常组不进行任何处理，低、中、高剂量组造模后立即给予相应剂量体积分数2%含药血清干预48 h。

1.4.4 透射电镜观察将各组髓核细胞离心至管底可以看到绿豆大小的细胞团块，弃去培养液，加入电镜固定液4 ℃固定2-4 h，1%锇酸-0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)室温(20 ℃)固定2 h，0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min；样品依次入梯度乙醇及100%丙酮进行脱水，每次15 min；丙酮︰812包埋剂(1︰1)渗透2-4 h，丙酮︰812包埋剂(2︰1)渗透过夜，纯812包埋剂渗透5- 8 h，将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37 ℃渗透过夜；60 ℃聚合48 h；切片机切出60-80 nm超薄切片；铀铅双染色(2%醋酸铀饱和水溶液以及枸橼酸铅各自染色15 min)，干燥过夜；透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

1.4.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况各组髓核细胞长至80%时，吸去旧培养基，PBS润洗细胞，加入胰酶消化，在显微镜下观察细胞不再连接成片，吸弃胰酶，加入NPCM完全培养基中止消化，吹打制成单细胞悬液；将单细胞悬液移至流式管，PBS洗涤细胞2次，1 000 r/min离心5 min，弃去上清，加入200 μL Annexin V/7-AAD染色工作液，重悬细胞，避光孵育15 min，上流式细胞仪检测。

1.4.6 流式细胞术检测线粒体膜电位取(1-6)×10⁵各组髓核细胞，重悬于0.5 mL NPCM完全培养基中，吹打均匀，加入0.5 mL JC-1染色工作液，颠倒数次混匀，细胞培养箱中孵育20 min，2 000 r/min离心三四分钟，弃上清，注意尽量不要吸除细胞；细胞沉淀用JC-1染色缓冲液洗涤1次，加入1 mL JC-1染色缓冲液重悬细胞，2 000 r/min 4 ℃离心三四分钟，弃上清，再用200 μL JC-1染色缓冲液重悬，上流式细胞仪分析。

1.4.7 Western blot检测相关蛋白表达量收集各组髓核细胞进行蛋白提取，使用超微量核酸定量仪测定蛋白浓度，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离待测蛋白样品，转移至PVDF膜上，加入5%脱脂奶粉-TBS封闭液中封闭2 h，加入一抗Apaf1、Bcl-2、Cytc、Bax及GAPDH抗体，置于摇床上4 ℃轻摇过夜；加入辣根过氧化物酶标记的稀释二抗溶液，室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次7 min；化学发光、显影、定影，将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统(Image-Pro Plus 6.0)分析条带吸光度值。

1.4.8 qPCR检测凋亡基因表达量收集各组髓核细胞，采用Trizol法提取RNA，以总RNA为模板，按照Bestar qPCR RT Kit说明书配制反转录反应体系完成反转录；用Agilent Stratagene荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR。按照2^-^∆∆Ct方法处理数据，∆Ct=(目的基因Ct-内参基因Ct)；∆∆Ct=(待测样品中目的基因∆Ct-参照样品中目的基因∆Ct)(若无参照样品则选择Ct最大的样品为参照进行计算)。引物名称、序列及产物长度见表1。

1.5 主要观察指标 ①透射电镜观察髓核细胞超微结构；②流式细胞术检测髓核细胞凋亡率；③流式细胞术检测线粒体膜电位；④Western blot检测髓核细胞Bax、Bcl-2、Apaf1及Cytc蛋白表达量；⑤qPCR检测髓核细胞Bax、Bcl-2、Apaf1及Cytc mRNA表达量。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，结果以x(_)±s表示，方差齐性采用单因素方差分析，两两比较则采用LSD检验；方差不齐采用Dunnett T3检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

中医古代经典文献中虽无“椎间盘退行性变”这一病名，但是就其具体的临床表现，将其归属为“痹证”这一范畴，其在中医经典文献中早有相关论述，如《素问·痹论》：“肾痹者，善肿，尻以代踵，脊以代头”。《难经·廿九难》：“尺寸具浮，直上直下，此为督脉，腰脊强痛，不得俯仰。” 督脉作为“阳脉之海”，随着人年龄的增长，督脉阳气虚衰，温煦无力以致脏腑运化失职，水湿痰饮停聚。林一峰教授在多年临床经验基础上，结合中医经典及相关医家论述，认为椎间盘退行性变的根本病机在于“督脉阳虚，气机不振”，并提出了“椎间盘退行性责之于督脉”的学术观点^[12]。针对其病机，在长期临床实践的基础上提出以“温阳化气”为治则，并结合疾病的具体情况随证加减，并总结出以阳和汤为基础方化裁形成补肾壮督方，该方以鹿角胶、海马为君药，滋补肝肾，壮督脉之阳气，黄芪以补气行血，熟地黄滋阴和阳，同为臣药；细辛为佐药，以通经化瘀，温阳止痛^[10]。

细胞凋亡是有机体内常见的一种细胞程序性死亡模式，既是机体维持正常生理功能的重要保障，同时过度的细胞凋亡又会影响组织器官的功能活动，进而导致疾病的发生与发展^[13]。目前研究表明，髓核细胞过度凋亡导致椎间盘功能丢失而引起椎间盘退行性变^[14]。该实验透射电镜观察显示模型组髓核细胞出现细胞核碎裂，浓缩集聚，并可见凋亡小体；流式细胞术检测髓核细胞凋亡情况，发现模型组髓核细胞凋亡率较正常组显著增加，补肾壮督方含药血清干预后细胞凋亡率均有不同程度降低，且随着含药血清浓度增高，髓核细胞凋亡率越低；中、高剂量组之间差异无显著性意义，说明在设置含药血清浓度上还需要进一步探索。以上实验结果表明，髓核细胞的过度凋亡可能参与了椎间盘退行性变的病理过程。

在哺乳动物中，线粒体是调节大部分凋亡通路的主要细胞器，是细胞凋亡的调控中心^[15-16]。研究表明，诸多因素引起的髓核细胞凋亡主要由线粒体凋亡通路所介导^[17]。多种因素使线粒体凋亡通路被激活而启动细胞凋亡程序，导致线粒体通透性转运孔遭到破坏，引起线粒体膜电位下降，Cytc释放到细胞质溶质中，在一定条件下即与Apaf1结合，引起Apaf1寡聚化成凋亡小体，引起级联反应，导致细胞凋亡^[18-19]。Bcl-2蛋白家族主要分布在线粒体外膜上，是调节线粒体凋亡通路的关键蛋白家族^[20]。根据其功能和结构可分为：①抗凋亡蛋白家族如Bcl-2、Bcl-xL等，其中Bcl-2可以抑制caspase激活，还可以调节线粒体膜电位变化^[21-22]；②促凋亡蛋白家族如Bax、Bak等，Bax通过与Bid结合，自身构象发生改变进而引发Cytc的释放^[22]。在线粒体膜电位变化方面，模型组及低、中、高剂量含药血清组线粒体膜电位均显著低于正常组(P < 0.05)；低、中、高剂量含药血清组线粒体膜电位均高于模型组(P < 0.05)，且随含药血清浓度增加，线粒体膜电位逐渐增高，说明补肾壮督方含药血清具有改善线粒体膜电位的作用；中、高剂量含药血清组线粒体膜电位均高于低剂量含药血清组(P < 0.05)，中、高剂量含药血清组虽有差异，但无显著性意义，说明在设置含药血清浓度上还需要进一步探索。在蛋白表达方面，与正常组相比较，模型组Apaf1、Cytc、Bax蛋白表达显著增加(P < 0.05)，而Bcl-2表达显著降低(P < 0.05)；补肾壮督方含药血清干预后，Apaf1、Cytc、Bax蛋白表达均有降低(P < 0.05)，Bcl-2表达则增高(P < 0.05)。低、中剂量含药血清组之间虽有差异，但无显著性意义，高浓度含药血清对线粒体通路相关蛋白表达的影响更为显著。在基因表达方面，与正常组相比较，模型组Cytc、Apaf1、Bax mRNA表达显著增加(P < 0.05)，Bcl-2 mRNA表达则显著减少(P < 0.05)；补肾壮督方含药血清干预后，Cytc、Apaf1、Bax mRNA表达显著减少(P < 0.05)，Bcl-2 mRNA表达则显著增加(P < 0.05)。因此，作者推测线粒体通路参与了髓核细胞凋亡的过程，补肾壮督方含药血清尤其是高浓度含药血清，可明显减少线粒体信号通路所导致的髓核细胞凋亡。

综上所述，线粒体凋亡通路参与了髓核细胞凋亡，是髓核细胞凋亡的重要机制之一。髓核细胞的凋亡导致线粒体膜电位下降，以及Apaf1、Cytc、Bax表达增加，Bcl-2表达减少；补肾壮督方含药血清可使线粒体膜电位增加，以及Apaf1、Cytc、Bax表达减少，Bcl-2表达增加，从而为防治椎间盘退行性变提供新的途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

补肾壮督方含药血清对髓核细胞线粒体凋亡通路的影响

Effect of Bushen Zhuangdu Fang serum on mitochondrial apoptotic pathway of nucleus pulposus cells

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