2.1  成骨细胞形态及鉴定  原代大鼠成骨细胞形态多呈梭形，有较多突起并互相连接，可见细胞分裂相；碱性磷酸酶染色结果可见染色阳性细胞出现，细胞膜及胞浆内颗粒染色呈蓝黑色颗粒。见图1。

2.2  绞股蓝皂苷对经氧化应激损伤的成骨细胞增殖的影响  给药后不同时间实验组与对照组相比对成骨细胞的活性影响不同。随绞股蓝皂苷干预时间的增加，细胞增殖活性增强，在第5天时促细胞增殖作用最强。因此，选择绞股蓝皂苷干预5 d用于后续实验，见图2。

2.3  碱性磷酸酶染色和茜素红染色  诱导的第7天，观察发现3组碱性磷酸酶染色程度有差异, 主要表现为：对照组的碱性磷酸酶染色程度较少, 实验组的染色程度明显深于对照组，而正常细胞组碱性磷酸酶染色最多，见图3。诱导的第21天，茜素红染色结果主要表现为：对照组的钙结节数量最少，实验组的钙结节数量明显多于实验组与对空白组，见图4。

2.4  绞股蓝皂苷对NOX4、骨形态发生蛋白2、Smad4蛋白表达的影响 在绞股蓝皂苷干预5 d后的作用下，实验组骨形态发生蛋白2、Smad4蛋白表达均较对照组升高，NOX4蛋白表达较对照组降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

骨质疏松是一种全身性骨骼疾病，以骨量减少和骨微结构破坏为特点，表现为骨强度下降、易发生脆性骨折^[1]，目前关于骨质疏松的发病机制研究尚不明确。氧化应激是影响骨重建的一个重要因素^[2]，由于活性氧自由基的过量产生和抗氧化防御机制的不足，导致机体的各种组织和细胞遭到损伤^[3-4]，因此也被认为是骨质疏松症成骨形成受损的一个重要因素^[5]。Nox家族属于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶的亚型，与大多数细胞中活性氧的产生密切相关^[6-7]。而成骨细胞在维持骨代谢平衡中发挥重要作用，主要参与骨形成以及骨损伤的修复过程，推动机体骨重建活动^[8]。研究证明，减轻氧化应激能促进成骨细胞的增殖^[9]，但是具体机制尚未明确。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)属于转化生长因子β超家族的一员，在胚胎发育过程中，特别是对颅骨骨骼的形成发挥重要用^[10]，研究发现，BMP/Smad信号通路对成骨细胞的增殖分化、骨形成和骨重建等方面具有调节作用^[11]，是目前研究骨质疏松等骨代谢性疾病的新热点。

绞股蓝皂苷来源于葫芦科植物绞股蓝的全草，其中皂苷类为其主要药理成分，其毒性低，具有抗氧化、神经保护、降血压、降血脂等作用^[12-15]，HAN等^[16]研究发现绞股蓝皂苷对多种细胞的氧化损伤具有保护作用，还可以通过调节核因子κB，AKT和MAPK信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成，抑制骨量丢失。此次研究通过观察绞股蓝皂苷对氧化应激损伤的大鼠成骨细胞增殖分化的影响，以及NOX、BMP/Smad信号通路相关蛋白表达的影响，探讨绞股蓝皂苷减轻氧化损伤的机制，为将来临床治疗骨质疏松症提供一定的实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  体外细胞学实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年1至11月在广州中医药大学岭南医学研究中心骨伤科实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  出生24 h SD大鼠2只，性别不限，购于广州中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(粤) 2018-0034。

1.3.2  实验材料  绞股蓝皂苷购于上海源叶生物科技有限公司，纯度：UV≥98%。

1.3.3  实验试剂  Alpha-MEM培养基、胎牛血清、双抗(美国 Gibco 公司)，胰酶(美国 sigma 公司)，Western blot 试剂盒、碱性磷酸酶染色试剂盒(上海碧云天)，CCK8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(贝博生物)，BMP2、NOX4、Tbulin和Smad4抗体(英国Abcam公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  绞股蓝皂苷配置  绞股蓝皂苷用二甲基亚砜溶解，用完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清和1%双抗)配置所需浓度，课题组于前期预实验预筛选出的药物最佳干预浓度为80 mg/L。

1.4.2  大鼠成骨细胞分离、培养及鉴定  参照文献[17]方法提取大鼠成骨细胞。乳鼠脱臼处死后在体积分数75%乙醇中充分浸泡消毒备用，超净台内无菌操作取出头盖骨，PBS冲洗去除脂肪组织及残留血液，将颅骨剪成1 mm×   1 mm大小的骨碎片并移入15 mL离心管内，采用0.25%胰蛋白酶和0.1%的Ⅱ型胶原酶多次消化法，分离成骨细胞，使用含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的Alpha-MEM培养液于培养皿中培养，37 ℃，体积分数5%CO₂孵箱中孵育，24 h后全量换液，显微镜下观察细胞贴壁情况及形态学变化，之后每隔2 d换液1次，待细胞长至80%-90%时传代。

1.4.3  绞股蓝皂苷对成骨细胞增殖的影响  取对数期细胞进行实验操作，调整成骨细胞浓度为2×10⁶ L^-1接种于96孔培养板中，100 μL/孔，24 h后待细胞贴壁，细胞分为空白组、经氧化应激损伤对照组(下称对照组)和绞股蓝皂苷组(下称实验组)，为制作氧化损伤模型，实验组和对照组成骨细胞更换为含150 μmol/L过氧化氢的生长培养基，2 h后去掉原培养基，实验组以含药培养基干预，对照组则换为生长培养基，各组设6个复孔。成骨细胞经上述方法处理24 h后，弃培养基，每孔加10 μL CCK8溶液，37 ℃孵育1 h，检测各孔450 nm下吸光度值，按上述方法再次检测第3天和第5天的吸光度值，计算各组增殖率。

1.4.4  碱性磷酸酶染色  将细胞以2×10⁸ L^-1孔密度接种于12孔板, 培养24 h待细胞贴壁后, 按上述方法制作氧化损伤模型，模型完成后，实验组加入绞股蓝皂苷终浓度为80 μmol/L的成骨诱导液，对照组和空白组加入成骨诱导液，每组4个复孔。培养7 d后进行碱性磷酸酶染色。具体成骨诱导分化结束后，吸出诱导液，PBS漂洗3次，加入40 g/L多聚甲醛室温固定10 min。PBS漂3次，加入碱性磷酸酶染色液孵育液，室温避光染色20 min。流水冲洗，晾干，拍照观察。

1.4.5  茜素红染色  使用上述方法制作模型，成骨诱导21 d后，使用茜素红染液进行矿化结节染色。吸弃细胞培养上清，使用40 g/L多聚甲醛固定20 min后，用PBS将多聚甲醛洗净。加入茜素红染液染色30 min，快速用蒸馏水清洗3次，稍晾干后在显微镜下观察，橘红色沉淀即为矿化钙结节。

1.4.6  Western blot法检测NOX4、骨形态发生蛋白2、Smad4的蛋白表达  细胞分组和培养同1.4.3，预冷PBS冲洗细胞，加入蛋白裂解液裂解，离心(4 ℃、12 000 r/min、10 min)，取上清液，测定蛋白浓度。配制样品，通过上样、电泳、转膜、封闭、孵育一抗二抗后显影，检测NOX4、骨形态发生蛋白2、Smad4蛋白的表达情况，以β-Tublin为内参，各蛋白条带与β-Tublin灰度值的比值表示蛋白表达水平。

1.5  主要观察指标  ①绞股蓝皂苷对成骨细胞增殖的影响；②绞股蓝皂苷对成骨细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶活性的影响；③绞股蓝皂苷对成骨细胞成骨诱导分化后钙结节的影响；④绞股蓝皂苷对成骨细胞NOX4、骨形态发生蛋白2、Smad4蛋白表达影响。

1.6  统计学分析  采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，符合正态分布的计量资料以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析法，P < 0.05为差异有显著性意义。

近年来，骨质疏松症患病人群数量逐步升高，而由此疾病导致的脆性骨折等危害严重影响人们的日常生活^[18]，对于骨质疏松的防治研究也逐渐深入。氧化应激是骨质疏松的致病因素已得到相关证明，HE等^[19]通过动物实验发现，激活相关通路可缓解骨质疏松大鼠的氧化应激损伤，同时伴随着氧化应激程度的加深，活性氧对骨的侵蚀作用将直接影响骨细胞的生命周期^[20]，但是低水平的活性氧却具有细胞内信号传递的作用，可导致细胞增殖、迁移、凋亡与分化^[21]。骨质疏松的形成与成骨细胞密切相关，骨骼通过骨形成和骨吸收之前的平衡而不断塑造和维持，成骨细胞沉积是骨代谢中形成新骨的重要环节^[22]，现有许多聚焦于成骨细胞的研究，展现了成骨细胞治疗骨质疏松的巨大应用前景。绞股蓝皂苷是中药绞股蓝的有效活性成分，经研究具有抗氧化、神经保护以及抗肿瘤等作用^[23-25]，但是目前尚未有关于绞股蓝皂苷减轻成骨细胞的氧化应激损伤机制的相关研究，因此此次实验对中医药绞股蓝防治骨质疏松具有重要意义。

碱性磷酸酶不仅参与成骨分化，是成骨细胞分化早期的标志，其活性更代表了成骨分化程度^[26-27]，此次实验结果显示，在诱导的第7天，实验组的碱性磷酸酶活性较对照组显著增强；而钙结节是成骨细胞分化成熟的标志^[28]，在实验诱导的第21天，实验组的钙结节数量明显多于对照组，以上结果均表明绞股蓝皂苷能促进氧化应激损伤的成骨细胞的成骨分化和矿化能力。

FLORCZYK等^[29]研究发现，NADPH氧化酶可以诱导活性氧产生，NOX4属于NADPH氧化酶的一个亚型，多存在于血管内皮细胞，下调NOX4可以抑制内皮细胞活性氧以及H₂O₂的产生^[30]，从而减低对细胞的氧化损伤。BMP/Smad可以调控成骨细胞的增殖分化，对于骨形成起着重要作用^[31]，其功能障碍可使骨形成减少导致骨质疏松症，其中骨形态发生蛋白2属于骨形态发生蛋白家族，是BMP/Smad信号通路的重要配体^[32]，也是目前研究最多的促成骨生长因子^[33]，骨形态发生蛋白2可促使磷酸化的Smad1/5蛋白与Smad4相结合进入细胞核，进一步调控靶基因的转录和表达，激活成骨特异性基因的表达，最终促进成骨细胞的分化^[34-35]，因此骨形态发生蛋白2和Smad4是BMP/Smad信号通路的重要节点。此次实验结果显示，绞股蓝皂苷干预受损的成骨细胞后，NOX4的蛋白表达较对照组减少，提示绞股蓝皂苷可下调NOX4的表达，减低细胞的氧化损伤，其机制可能与减少活性氧的产生有关^[36]，同时骨形态发生蛋白2、Smad4蛋白表达量的增加表明绞股蓝皂苷在减轻氧化损伤的同时能促进成骨细胞的增殖分化，其机制与激活BMP/Smad信号通路促进成骨细胞的成骨分化相关。

综上所述，绞股蓝皂苷对H₂O₂诱导的成骨细胞氧化损伤具有一定的保护作用，并且对损伤的成骨细胞有促进增殖分化的作用，其作用机制可能与NOX/BMP/Smad信号通路相关，其具体的分子机制还有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

绞股蓝皂苷：来源于葫芦科植物绞股蓝的全草，具有抗氧化、神经保护、降血压和降血脂等作用。研究发现，绞股蓝皂苷对多种细胞的氧化损伤具有保护作用，还可以通过调节NF-κB、AKT和MAPK信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成，抑制骨量丢失，有可能成为治疗骨质疏松等骨代谢相关疾病的潜在药物。

氧化应激：机体受到刺激时氧化和抗氧化系统的平衡被破坏，对细胞和组织产生氧化损伤，氧化应激被认为和机体衰老密切相关。研究发现，绝经后骨质疏松症的发生也与氧化应激有关，是目前骨代谢疾病研究的新热点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨质疏松的形成与成骨细胞密切相关，骨骼通过骨形成和骨吸收之前的平衡而不断塑造和维持，成骨细胞沉积是骨代谢中形成新骨的重要环节，现有许多聚焦于成骨细胞的研究，展现了成骨细胞治疗骨质疏松的巨大应用前景。绞股蓝皂苷是中药绞股蓝的有效活性成分，经研究具有抗氧化、神经保护以及抗肿瘤等作用，但是目前尚未有关于绞股蓝皂苷减轻成骨细胞的氧化应激损伤机制的相关研究，因此此次实验对中医药绞股蓝防治骨质疏松具有重要意义。

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